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  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

在这里，我们描述了人类细胞中基于Moloney小鼠白血病病毒的逆转录病毒载体的整合位点全基因组图谱的方案。

摘要

莫洛尼鼠白血病（MLV）病毒的逆转录病毒载体主要集中在乙酰化增强子和启动子中。因此，mLV整合位点可用作活性调节元件的功能标记。在这里，我们提出了一种逆转录病毒扫描工具，可以在全基因组范围内鉴定细胞特异性增强子和启动子。简言之，用mLV衍生的载体转导靶细胞群，并用经常切割的限制酶消化基因组DNA。在用相容的DNA接头连接基因组片段后，连接子介导的聚合酶链反应（LM-PCR）允许扩增病毒宿主基因组连接。扩增子的大规模测序用于在全基因组范围内定义mLV整合谱。最后，定义了复发整合的集群，以确定细胞特异性调节区域，负责细胞型特异性转录程序的激活。

例如体细胞干细胞）的工具技术，其缺乏用于预期分离的鲁棒标记物。

引言

细胞同一性由特定基因组的表达决定。顺式调节元件（如启动子和增强子）的作用对于细胞型特异性转录程序的激活至关重要。这些调节区域的特征在于特定的染色质特征，例如特异性组蛋白修饰，转录因子和辅因子结合以及染色质可及性，其已被广泛用于在几种细胞类型1,2,3中的全基因组鉴定。特别地，组蛋白H3赖氨酸27（H3K27ac）的乙酰化的全基因组谱通常用于定义活性启动子，增强子和超增强子4,5,6 。

莫洛尼鼠白血病病毒（MLV）是广泛用于基因的γ-逆转录病毒转移哺乳动物细胞。感染靶细胞后，逆转录病毒RNA基因组被逆转录在双链DNA分子中，其结合病毒和细胞蛋白以组装前整合复合物（PIC）。 PIC进入核并结合宿主细胞染色质。在这里，病毒整合酶，一个关键的PIC组件，介导前病毒DNA整合到宿主细胞基因组。基因组DNA中的mLV整合不是随机的，而是发生在活性顺式调节元件（如启动子和增强子）中，细胞特异性方式为7,8,9,10 。这种特异的整合特征是通过mLV整合酶和细胞溴结构域和外切域（BET）蛋白质11,12,13之间的直接相互作用来介导的。 BET蛋白（BRD2，BRD3，BRD4）作为宿主染色质和mLV PIC之间的桥梁:通过它们的溴结构域，它们识别高度乙酰化的顺式调节区，而外发区与mLV整合酶11,12,13相互作用。

在这里，我们描述了逆转录病毒扫描，一种基于mLV的整合性质绘制活性顺式调节区的新工具。简言之，用表达增强的绿色荧光蛋白（eGFP）报道基因的来自mLV的逆转录病毒载体转导细胞。在基因组DNA提取后，通过连接物介导的PCR（LM-PCR）扩增mLV载体的3'末端重复序列（LTR）和基因组DNA之间的连接并进行大规模测序。 mLV整合位点被映射到人类基因组，并且由mLV高度靶向的基因组区域被定义为mLV整合位点的簇。

逆转录病毒扫描ning用于在几个人类原代细胞14,15 中定义细胞特异性活性调节元件。 mLV簇与表观遗传学定义的启动子和增强子共同定位，其中大部分含有活性组蛋白标记，如H3K27ac，并且是细胞特异性的。逆转录病毒扫描允许在前瞻性纯化的细胞群体中的DNA调节元件的全基因组鉴定7,14以及缺乏有效标记物的回顾性定义的细胞群（例如角质形成细胞干细胞） 15 。

研究方案

人类细胞的MLV转导

  1. 分离靶细胞并用携带eGFP报告基因的mLV衍生的逆转录病毒载体转导它们，并用水泡性口炎病毒G（VSV-G）或单调性包膜糖蛋白16假型。
    1. 将模拟转导细胞作为阴性对照进行以下分析。由于基于mLV的逆转录病毒载体可以转导有效分裂的细胞，在刺激细胞分裂的条件下培养靶细胞群体。需要针对研究中的每种细胞类型，特异性优化转导条件。人造血祖细胞，T细胞和表皮细胞的细胞生长和转导条件描述于参考文献7,14,15和17中。
  2. 转导后48 h，在300μL含有2％胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中重悬10 000个细胞，并用f低细胞分析（488nm激发激光）。使用模拟转导的细胞作为阴性对照。为了优化整合位点检索，通过荧光活化细胞分选（FACS）纯化GFP +细胞。
  3. 收集0.5-5百万个细胞用于基因组DNA制备。在分析真正干细胞的长期后代时，较长的培养期（> 7天）优先稀释未整合的原病毒并且是必需的（参见讨论部分和参考文献15 ）。细胞颗粒可以快速冷冻并储存在-80°C直到使用。

2.通过接头介导的PCR（LM-PCR）扩增mLV整合位点

  1. 基因组DNA（gDNA）的制备
    1. 使用基于柱的DNA提取试剂盒提取gDNA，并按照制造商的说明遵循培养细胞的方案。
  2. 限制酶消化上
    1. 在1.5 mL管中每个样品设置4个限制酶消化。通过加入1μLTru9I（10U）和1μL缓冲液M，最终体积为10μL，每个管中消化0.1至1μggDNA。将反应在65℃下孵育6小时或过夜。
    2. 向每个反应物中加入1μlPstI（10U），1μL缓冲液H和8μL水。将反应在37℃孵育6小时或过夜。样品可以保存在-20°C直到使用。
  3. 连接器结扎
    1. 通过以100μM的浓度混合连接体加链和接头负链寡核苷酸，在1.5mL管中制备100μMTru9I连接体储备溶液。将管置于100°C的水中，并在室温下冷却。 Tru9I接头储液可以在-20°C储存，直到使用。
    2. 在1.5 mL管中设置8个接头连接反应。对于每个反应，添加以下组分s至10μL限制酶消化:1.4μL10X T4 DNA连接酶反应缓冲液，1μL10μM接头Tru9I，1μL（2,000U）T4DNA连接酶和0.6μL水。在16℃下孵育3至6小时。样品可以保存在-20°C直到使用。
  4. 第一次PCR
    1. 在0.2mL管中设置48个PCR反应（来自每个连接管的6个反应）。对于每个PCR，将以下试剂加入2μL连接反应:5μL10X PCR缓冲液，2μL50mM硫酸镁，1μL10mM脱氧核苷酸（dNTP）Mix，1μL10μM接头引物1 μL10μMmLV-3'LTR引物，0.3μL（1.5U）Taq DNA聚合酶和37.7μL水。引物序列在表1中提供。
    2. 在具有加热盖的热循环仪中进行PCR反应，如下:95℃2分钟; 25个循环，95℃15秒，55℃30秒，72℃1分钟; 72°; C为5分钟;保持在4°C。样品可以保存在-20°C直到使用。
  5. 第二次PCR
    1. 在0.2 mL管中设置48个PCR反应（每个"第一PCR"管1个）。对于每个PCR，将以下组分添加到2μL第一次PCR反应中:5μL10X PCR缓冲液，2μL50mM硫酸镁，1μL10mM dNTP Mix，1μL10μM接头嵌套引物，1 μL10μMmLV-3'LTR嵌套引物，0.3μLTaq DNA聚合酶（1.5U）和37.7μL水。使用针对特定大规模测序策略设计的嵌套引物:（i）与Illumina平台兼容的接头嵌套引物和mLV-3'LTR嵌套引物; （ii）接头嵌套引物和与Roche平台兼容的mLV-3'LTR嵌套引物。引物序列列于表1 。
    2. 在具有加热盖的热循环仪中进行PCR反应，如下:95℃2分钟; 25循环95℃15秒，58℃30秒，72℃1分钟; 72℃5分钟;保持在4°C。样品可以保存在-20°C直到使用。
    3. 将48个巢式PCR反应置于15 mL试管（最终体积〜2.4 mL）中。样品可以保存在-20°C直到使用。
  6. 通过琼脂糖凝胶电泳确定LM-PCR产物的存在和大小。
    1. 加入4μL载体缓冲液至20μLLM-PCR产物，并将样品加载到1％琼脂糖凝胶上，并连同100 bp DNA梯。以5 V / cm的速度运行凝胶30至60分钟，并通过溴化乙锭染色观察PCR产物。
    2. 从模拟转导的样品中进行LM-PCR反应作为阴性对照。
  7. 通过加入0.1体积的乙酸钠溶液（3M; pH5.2）和2.5体积的100％乙醇沉淀扩增子。在-80℃下混合并冷冻20分钟。
    1. 旋转在福在4℃下在标准微量离心机中速度20分钟。弃去上清液，用70％乙醇洗涤沉淀。在标准微量离心机中以4℃全速旋转5分钟。
    2. 弃上清，空气干燥沉淀。加入200μLPCR级水，并重悬DNA。样品可以保存在-20°C直到使用。
  8. 向100μLLM-PCR产物中加入20μL载体缓冲液，并将样品加载到1％琼脂糖凝胶上，并连同100 bp DNA梯。
    1. 以5V / cm的速度运行凝胶30至60分钟，并切割含有150至500bp长的扩增子的部分凝胶。
    2. 使用柱式凝胶提取试剂盒纯化LM-PCR产物，并使用紫外分光光度计测定浓度。
  9. 根据制造商的说明，使用1μL的文库来评估使用生物分析仪器的LM-PCR产品的长度。
  10. 霰弹枪克隆扩增子
    1. 使用20 ng纯化的LM-PCR产物，并按照制造商的说明将其克隆到pCR2.1-TOPO载体中。
    2. 使用M13通用引物进行测序反应，随后对所得序列进行基因组测绘，以显示> 50％克隆中病毒 - 基因组连接（包括mLV-3'LTR嵌套引物）的存在，以鉴定合适的样品用于大规模测序。病毒 - 基因组连接的实例:
      figure-protocol-3059
      MLV-3'LTR嵌套引物454和接头嵌套引物454（ 表1 ）以粗体表示，病毒LTR的3'末端以斜体表示。人类基因组序列以红色文本（chr10:6439408-6439509，hg19）突出显示。

mLV集成位点的大规模测序

注意:LM-PCR产品可以使用商业平台（在第二次PCR反应中选择适当的嵌套引物对，参见小节2.5.1）进行测序。对于罗氏GS-FLX焦磷酸测序平台的测序，请参考以前的论文7,14,15。在本节中，描述了用于Illumina测序平台的新优化协议。

  1. 图书馆准备
    1. 每个样品在0.2 mL管中设置1个分选PCR反应。对于每个PCR，向5μL（150-170 ng）纯化的LM-PCR产物中加入以下试剂:5μLIndex Primer 1，5μLIndex Primer 2，25μL2X Master Mix和10μLPCR-等级水。对每个样本使用不同的索引组合。
    2. 在具有加热盖的热循环仪中进行PCR反应，如下:95℃3分钟; 95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒的8个循环; 72°C 5 m在;保持在4°C。
    3. 使用固相可逆固定（SPRI）珠分离方法纯化PCR产物:在新的1.5 mL管中，向每个样品加入56μL珠，并按照制造商的说明进行操作。在25μLTris-HCl 10mM中洗脱。库可以保存在-20°C直到使用。
  2. 图书馆检查
    1. 使用1μL样品，使用生物分析仪器来评估文库大小。
    2. 根据制造商的说明，使用1μL样品，使用基于荧光的实时PCR检测来定量文库的摩尔浓度。
  3. 图书馆稀释和测序
    1. 使用Tris-HCl 10mM将文库稀释至10nM。对于汇集文库，将5μL每个稀释的文库转移到新的1.5mL管中，然后在10mM Tris-HCl中将池稀释至4nM。
    2. 将5μL稀释池与5μL0.2 N NaOH混合，加入1.5 mL管，短暂涡旋，旋转并在室温下孵育5分钟以使文库变性。
    3. 将管放在冰上，加入990μL预冷的杂交缓冲液（HT1）。将等分试样在新的1.5 mL管中加入300μL变性池，加入300μL预冷HT1，获得10 pM的最终文库池。
    4. 同时，在1.5 mL管中混合2μLPhiX对照文库（10 nM）和3μLTris-HCl 10 mM。加入5μLNaOH 0.2 N，短暂旋转，旋转下来，室温孵育5 min，使稀释的PhiX变性。将管放在冰上，加入990μL预冷HT1。
    5. 在新的1.5 mL管中分装300μL变性PhiX，并加入300μL预冷HT1，以获得10 pM的最终PhiX。
    6. 在新的1.5 mL管中，将510μL变性库文库与90μL变性PhiX文库混合，从而获得最终10 pM池，其中15％为PhiX对照。
    7. 移取600μL样品体积进入解冻的测序试剂盒的Load Sample储存器，并立即执行单次读取150循环运行。
      注意:本协议所需的关键试剂和引物序列见表1 。

结果

逆转录病毒扫描程序的工作流程

逆转录病毒扫描程序的工作流程如图1所示 。用表达eGFP报告基因的mLV衍生的逆转录病毒载体纯化并转导靶细胞群。转基因侧翼是两个相同的长末端重复序列（5'和3'LTR），确保病毒基因组合成，逆转录和整合到宿主DNA中。通过FACS分析eGFP表达来评估转导效率。扩增含有高?...

讨论

在这里，我们描述了一个针对染色质区域的逆转录病毒mLV的整合位点的全基因组映射方案，表观遗传标记为活性启动子和增强子。方案的关键步骤和/或限制包括:（i）目标细胞群的mLV转导; （ii）通过LM-PCR扩增病毒宿主结; （iii）检索高比例的整合站点。基于mLV的逆转录病毒载体有效转导分裂细胞。非分裂细胞（例如有丝分裂后神经元细胞）的转导效率低是该技术的潜在限制。然而，可以通过基于?...

披露声明

作者没有什么可以披露的。

致谢

这项工作由欧洲研究委员会（ERC-2010-AdG，GT-SKIN），意大利教育，大学和研究部（2010年Ricerca的FIRB-Futuro-RBFR10OS4G，2012年Ricerca的FIRB-Futuro-RBFR126B8I_003）的赠款支持，EPIGEN Epigenomics旗舰项目），意大利卫生部（Young Research Call 2011 GR-2011-02352026）和Imagine研究所基金会（法国巴黎）。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
PBS, pH 7.4ThermoScientific10010031or equivalent
Fetal Bovine SerumThermoScientific16000044or equivalent
0.2 ml tubesgeneral lab supplier
1.5 ml tubesgeneral lab supplier
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit QIAGEN51306or equivalent
T4 DNA ligase New England BioLabsM0202T
T4 DNA Ligase Reaction bufferNew England BioLabsM0202T
Linker Plus Strand oligonucleotidegeneral lab supplier5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’  (Purification grade: SDS-PAGE)
Linker Minus Strand oligonucleotidegeneral lab supplier5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE)
Tru9IRoche-Sigma-Aldrich11464825001
SuRE/Cut Buffer MRoche-Sigma-Aldrich11417983001
PstI Roche-Sigma-Aldrich10798991001
SuRE/Cut Buffer HRoche-Sigma-Aldrich11417991001
Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity Invitrogen11304011
10 mM dNTP MixInvitrogen18427013or equivalent
PCR grade watergeneral lab supplier
96-well thermal cycler (with heated lid)general lab supplier
linker primergeneral lab supplier5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade)
MLV-3’ LTR primergeneral lab supplier5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade)
linker nested primer 454general lab supplier5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer 454general lab supplier5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
linker nested primer Illuminageneral lab supplier5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer Illuminageneral lab supplier5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2general lab supplier
Ethanol (absolute) for molecular biologySigma-AldrichE7023or equivalent
Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector)InvitrogenK4500-01
QIAquick Gel Extraction kitQIAGEN28704
AgaroseSigma-AldrichA9539or equivalent
Ethidium bromide Sigma-AldrichE1510or equivalent
100 bp DNA ladderInvitrogen15628019or equivalent
6x Loading BufferThermoScientificR0611or equivalent
NanoDrop 2000 UV-Vis SpectrophotometerThermoScientificND-2000
Nextera XT Index kitIlluminaFC-131-1001 or FC-131-1002
2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix KAPA BiosystemsKK2601
Dynal magnetic stand for 2 ml tubesInvitrogen12321Dor equivalent
Agencourt AMPure XP 60 ml kitBeckman Coulter GenomicsA63881
Tris-HCl 10 mM, pH 8.5general lab supplier
Agilent 2200 TapeStation systemAgilent TechnologiesG2964AAor equivalent
D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5582or equivalent
D1000 ReagentsAgilent Technologies5067-5583or equivalent
KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism)KAPA BiosystemsKK4835
ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR SystemApplied Biosystems4329003
NaOH 1.0 N, molecular biology-gradegeneral lab supplier
HT1 (Hybridization Buffer)Illumina Provided in the MiSeq Reagent Kit
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles)IlluminaMS-102-3001
MiSeq SystemIlluminaSY-410-1003
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001

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