레트로 바이러스 스캐닝 : MLV 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의

요약

여기, 우리는 인간 세포에서 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스 기반의 레트로 바이러스 벡터의 통합 사이트의 게놈 전체 매핑을위한 프로토콜을 설명합니다.

초록

Moloney murine leukemia (MLV) 바이러스 기반 레트로 바이러스 벡터는 주로 아세틸 화 된 인핸서와 프로모터에 통합됩니다. 이러한 이유로 mLV 통합 사이트는 능동적 인 규제 요소의 기능적 표지자로 사용될 수 있습니다. 여기에 우리는 세포 특이 적 인핸서 (enhancer)와 프로모터 (promoter)에 대한 게놈 차원의 식별을 가능하게하는 레트로 바이러스 스캐닝 도구를 제시한다. 간단히 말해, 표적 세포 집단은 mLV 유래 벡터로 형질 도입되고 게놈 DNA는 절단 제한 효소로 절단된다. 호환 DNA 링커와 게놈 조각의 연결 후, 링커 중재 폴리머 라제 연쇄 반응 (LM-PCR)은 바이러스 - 호스트 게놈 교차점의 증폭을 허용합니다. amplicons의 대규모 시퀀싱은 게놈 전체 mLV 통합 프로필을 정의하는 데 사용됩니다. 마지막으로, 반복적 통합의 클러스터는 세포 유형 특이적인 전사 프로그램의 활성화를 담당하는 세포 특이 적 조절 영역을 확인하기 위해 정의된다.

예를 들면 체세포 줄기 세포)의 회고 확인을위한 도구 기술을 대표한다.

서문

세포 동일성은 특정 유전자 세트의 발현에 의해 결정됩니다. 프로모터 및 인핸서와 같은 시스 조절 요소의 역할은 세포 유형 특이 적 전사 프로그램의 활성화에 결정적이다. 이러한 조절 부위는 특이적인 히스톤 변형, 전사 인자 및 보조 인자 결합, 염색질 접근성과 같은 특이적인 염색질 특징을 특징으로하는데, 이는 여러 세포 유형 ^{1 , 2 , 3} 에서 게놈 전체의 식별을 위해 널리 사용되어왔다. 특히 히스톤 H3 라이신 27 (H3K27ac)의 게놈 전체 프로파일은 활성 프로모터, 인핸서 및 슈퍼 인핸서 ^{4 , 5 , 6} 을 정의하는 데 일반적으로 사용됩니다.

Moloney murine leukemia virus (MLV)는 유전자에 널리 사용되는 감마 - 레트로 바이러스입니다포유 동물 세포에서 전달. 표적 세포를 감염시킨 후 retroviral RNA genome은 pre-integration complex (PIC)를 조립하기 위해 바이러스 및 세포 단백질에 결합하는 이중 가닥의 DNA 분자에서 역전사된다. PIC는 핵을 입력하고 숙주 세포 염색질을 바인딩합니다. 여기에서 중요한 PIC 성분 인 바이러스 인테그라 아제 (viral integrase)는 프로 바이러스 DNA의 숙주 세포 게놈으로의 통합을 매개한다. 게놈 DNA에서의 mLV 통합은 무작위 적이 지 않지만 세포 특이적인 방식으로 활성 cis 조절 요소, 예를 들어 프로모터 및 인핸서에서 일어난다 ^{7 , 8 , 9 , 10} . 이 특이 적 통합 프로파일은 mLV integrase와 세포 bromodomain 및 외쪽 끝 도메인 (BET) 단백질 ^{11 , 12 , 13} 사이의 직접적인 상호 작용에 의해 매개됩니다. BET 단백질 (BRD2, BRD3 및BRD4)는 숙주 염색질과 mLV PIC 사이의 가교 역할을한다. 브롬 도메인을 통해 고도로 아세틸 화 된 시스 조절 영역을 인식하고 외측 말단 도메인은 mLV 인테그라 아제 ^{11 , 12 , 13} 과 상호 작용한다.

여기에서, 우리는 mLV의 통합 특성에 기초하여 활성 cis- 조절 영역을 매핑하는 새로운 도구 인 레트로 바이러스 스캐닝을 기술한다. 간략하게, 세포는 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 리포터 유전자를 발현하는 mLV 유래 레트로 바이러스 벡터로 형질 도입된다. 게놈 DNA 추출 후, mLV 벡터의 3 '긴 말단 반복 (LTR)과 게놈 DNA 간의 연결 부위는 링커 매개 PCR (LM-PCR)에 의해 증폭되고 대량으로 서열 분석된다. mLV 통합 사이트는 인간 게놈에 매핑되며 mLV에 의해 표적화되는 게놈 영역은 mLV 통합 사이트의 클러스터로 정의됩니다.

레트로 바이러스 검사ning은 여러 인간의 일차 세포에서 세포 특이 적 활성 조절 요소를 정의하는 데 사용되었습니다 ^{14 , 15} . mLV 클러스터는 후생 적으로 정의 된 프로모터 및 인핸서와 함께 매핑되었으며, 대부분은 H3K27ac과 같은 활성 히스톤 마커를 가지며 세포 특이 적이었다. 레트로 바이러스 스캐닝은 전향 적으로 정제 된 세포 집단 7,14뿐 아니라 예비 격리 ¹⁵ 에 효과적인 마커가없는 케라틴 틴틴 줄기 세포와 같은 후 향적으로 정의 된 세포 집단에서 DNA 조절 요소의 게놈 전체 식별을 허용합니다.

프로토콜

1. 인간 세포의 MLV 형질 도입

1. 대상 세포를 분리하고 eGFP 리포터 유전자를 포함하고 Vesicular Stomatitis Virus G (VSV - G) 또는 amphotropic 봉투 glycoprotein ¹⁶ pseudotyped mLV 유래 레트로 바이러스 벡터로 그들을 transduce.
   1. 모의 변형 된 세포를 다음 분석을위한 음성 대조군으로 유지하십시오. mLV 기반의 레트로 바이러스 벡터는 효율적으로 분열하는 세포를 형질 도입 할 수 있기 때문에 세포 분열을 자극하는 조건에서 표적 세포 집단을 배양하십시오. 형질 도입 조건은 연구중인 각 세포 유형에 대해 특별히 최적화되어야합니다. 인간 조혈 전구 세포, T 세포 및 표피 세포에 대한 세포 성장 및 형질 도입 조건은 문헌 7, 14, 15 및 17에 기재되어있다.
2. 48 시간 후, 2 % 태아 소 혈청을 함유 한 인산염 완충 식염수 (PBS) 300 μL에 100,000 세포를 재현하고 f에 의해 eGFP 발현을 측정한다낮은 cytometric 분석 (488 nm의 여기 레이저). 모의 - 형질 전환 된 세포를 음성 대조군으로 사용하십시오. 최적의 통합 사이트 검색을 위해 Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)로 GFP ⁺ 세포를 정제하십시오.
3. 게놈 DNA 준비를 위해 0.5 ~ 5 백만 개의 세포를 수집하십시오. 통합되지 않은 프로 바이러스를 희석하고 선천적 인 줄기 세포의 장기 자손을 분석 할 때 더 긴 배양 기간 (> 7 일)이 바람직합니다 ( 토론 절 및 참조 ¹⁵ 참조). 세포 펠렛은 사용하기 전까지 급속 동결되고 -80 ° C에서 보관할 수 있습니다.

2. 링커 매개 PCR (LM - PCR)에 의한 mLV 통합 사이트의 증폭

1. 게놈 DNA (gDNA)
   1. 컬럼 기반의 DNA 추출 키트를 사용하여 gDNA를 추출하고 배양 세포에 대한 프로토콜을 따르십시오 (제조 업체의 지침에 따라).
2. 제한 효소 digesti...에
   1. 1.5 ML 튜브에서 샘플 당 4 제한 효소 소화를 설정합니다. 10 μL의 최종 부피에 1 μL의 Tru9I (10U)와 1 μL의 Buffer M을 첨가하여 각 튜브에 0.1 ~ 1 μg gDNA를 분해하십시오. 65 ° C에서 6 시간 또는 밤새 반응을 일으킨다.
   2. 각 반응 1 μl의 PstI (10U), 1 μL의 버퍼 H와 8 μL의 물을 첨가하십시오. 37에서 반응을 6 시간 또는 밤새 품어. 샘플은 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다.
3. 링커 라이 게이션
   1. 100 μM 농도의 링커 플러스 가닥 및 링커 마이너스 스트랜드 oligonucleotides를 혼합하여 1.5 ML 튜브에 100 μM Tru9I 링커 주식 솔루션을 준비합니다. 튜브를 100 ° C로 설정된 물에 넣고 실온에서 식히십시오. Tru9I 링커 스톡 용액은 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다.
   2. 1.5 ML 튜브에서 8 링커의 연결 반응을 설정합니다. 각 반응에 대해 다음 성분을 첨가하십시오10 μL의 10 X T4 DNA 리가 제 반응 완충액, 1 μL의 10 μM 링커 Tru9I, 1 μL (2,000 U)의 T4 DNA 리가 제 및 0.6 μL의 물. 16에서 3에서 6 시간 동안 품어 라. 샘플은 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다.
4. 첫 번째 PCR
   1. 0.2 ML 튜브에서 48 PCR 반응 (각 연결 튜브에서 6 반응)를 설정합니다. 각 PCR에 대해 다음과 같은 시약을 2 μL의 연결 반응에 첨가하십시오 : 5 μL의 10X PCR 버퍼, 2 μL의 50 mM 마그네슘 설페이트, 1 μL의 10 mM deoxynucleotide (dNTP) Mix, 1 μL의 10 μM 링커 프라이머, 1 10 μM mLV-3 'LTR 프라이머 μL, Taq DNA Polymerase 0.3 μL (1.5 U) 및 물 37.7 μL. 프라이머 서열은 표 1에 제시되어있다.
   2. 다음과 같이 가열 된 뚜껑을 갖춘 열 순환 장치에서 PCR 반응을 수행하십시오 : 95 ℃에서 2 분; 15 초 동안 95 ℃, 30 초 동안 55 ℃, 1 분 동안 72 ℃의 25주기; 72 °5 분간 C; 4 ° C에서 유지. 샘플은 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다.
5. 두 번째 PCR
   1. 0.2 ML 튜브에서 48 PCR 반응 (각 "첫 번째 PCR"튜브에서 1)를 설정합니다. 각 PCR에 대해 첫 번째 PCR 반응 2 μL에 다음 구성 요소를 추가합니다. 5 μL의 10X PCR 버퍼, 2 μL의 50 mM 마그네슘 설페이트, 1 μL의 10 mM dNTP Mix, 1 μL의 10 μM 링커 중첩 프라이머, 1 10 μM mLV-3 'LTR 중첩 프라이머 μL, Taq DNA 중합 효소 (1.5 U) 0.3 μL 및 물 37.7 μL. 선택된 거대한 시퀀싱 전략을 위해 설계된 중첩 된 프라이머를 사용하십시오 : (i) 링커 중첩 프라이머 및 Illumina 플랫폼과 호환되는 mLV-3 'LTR 중첩 프라이머; (ii) Roche 플랫폼과 호환되는 링커 중첩 프라이머 및 mLV-3 'LTR 네 스팅 프라이머. 프라이머 서열은 표 1 에 열거되어있다.
   2. 다음과 같이 가열 된 뚜껑을 갖춘 열 순환 장치에서 PCR 반응을 수행하십시오 : 95 ℃에서 2 분; 25 세95 ℃에서 15 초간, 58 ℃에서 30 초간, 72 ℃에서 1 분간의 사이클; 72 ℃에서 5 분; 4 ° C에서 유지. 샘플은 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다.
   3. 15 ML 튜브 (~ 2.4 ML의 최종 볼륨)에서 48 개의 중첩 PCR 반응을 풀. 샘플은 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다.
6. 아가로 오스 겔 전기 영동으로 LM-PCR 제품의 존재 여부와 크기를 결정하십시오.
   1. LM-PCR 제품 20 μL에 Loading Buffer 4 μL를 넣고 샘플을 100 bp DNA 사다리와 함께 1 % 아가 로스 겔에로드하십시오. 30 ~ 60 분 동안 5 V / cm에서 겔을 실행하고 ethidium 브로마이드 얼룩에 의해 PCR 제품을 시각.
   2. 모의 - transduced 샘플에서 부정적인 컨트롤로 LM - PCR 반응을 실행하십시오.
7. 0.1 아세트산 나트륨 용액 (3 M, pH 5.2)과 2.5 부피의 100 % 에탄올을 가하여 증폭 물을 침전시킨다. -80에서 20 분 동안 혼합하고 동결시킨다.
   1. 푸에서 스핀표준 미세 원심 분리기에서 4 ° C에서 20 분간 속도. 상등액을 버리고 70 % 에탄올로 펠렛을 씻는다. 5 분 동안 4 ° C에서 표준 미세 원심 분리기에서 최대 속도로 스핀하십시오.
   2. 뜨는을 버리고 펠렛을 공기 건조하십시오. PCR 급수 200 μL를 추가하고 DNA를 resuspend. 샘플은 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다.
8. 100 μL의 LM-PCR 제품에 Loading Buffer 20 μL를 첨가하고 샘플을 100 bp DNA 사다리와 함께 1 % 아가 로스 겔에로드하십시오.
   1. 30 ~ 60 분 동안 5 V / cm에서 겔을 실행하고 150 ~ 500 BP의 긴 amplicons을 포함하는 젤의 부분을 자르십시오.
   2. 칼럼 기반 젤 추출 키트로 LM-PCR 제품을 정제하고 UV 분광 광도계를 사용하여 농도를 측정하십시오.
9. 제조사의 지침에 따라 bioanalyzer 악기를 사용하여 LM-PCR 제품의 길이를 평가하기 위해 1 μL의 라이브러리를 사용하십시오.
10. 산탄 총 복제
    1. 정제 LM-PCR 제품 20 ng을 사용하고 제조 업체의 지침에 따라 pCR2.1 - TOPO 벡터에서 복제.
    2. 최종 샘플을 확인하기 위해 클론의> 50 %에서 바이러스 게놈 접합부 (mLV-3 'LTR 중첩 프라이머 포함)의 존재를 밝히기 위해 결과 서열의 게놈지도 작성 후 M13 유니버셜 프라이머를 사용하여 시퀀싱 반응 수행 대규모 시퀀싱. 바이러스 - 게놈 접합의 예 :
       
       MLV-3 'LTR 내포 프라이머 454 및 링커 내포 프라이머 454 ( 표 1 )는 굵게 표시하고 바이러스 성 LTR의 3'말단은 이탤릭체로 표시 하였다. 인간 게놈 서열은 붉은 색 텍스트로 강조 표시됩니다 (chr10 : 6439408-6439509, hg19).

3. mLV 통합 사이트의 대규모 시퀀싱

참고 : LM-PCR 제품상업용 플랫폼을 사용하여 서열을 분석 할 수 있습니다 (두 번째 PCR 반응에서 적절한 중첩 프라이머 쌍을 선택하십시오, 2.5.1 절 참조). Roche GS-FLX pyrosequencing 플랫폼을 이용한 시퀀싱에 대해서는 이전 논문 ^{7 , 14 , 15를} 참조하십시오. 이 섹션에서는 Illumina 시퀀싱 플랫폼에 대해 새로 최적화 된 프로토콜에 대해 설명합니다.

1. 도서관 준비
   1. 0.2 ML 튜브에서 샘플 당 1 색인 PCR 반응을 설정합니다. 각 PCR에 대해 5 μL (150-170 ng)의 정제 LM-PCR 제품에 다음 시약을 첨가하십시오 : 5 μL의 Index Primer 1, 5 μL의 Index Primer 2, 25 μL의 2X Master Mix 및 10 μL의 PCR- 학년 물. 각 견본마다 다른 색인 조합을 사용하십시오.
   2. 다음과 같이 열 뚜껑이있는 열 순환 장치에서 PCR 반응을 수행하십시오 : 95 ℃에서 3 분; 95 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 30 초의 8 사이클; 72 ° C에서 5m에서; 4 ° C에서 유지.
   3. 고상 가역 고정 (SPRI) 비드 격리 프로토콜을 사용하여 PCR 제품을 정화 : 새로운 1.5 ML 튜브에서 각 샘플에 비즈 56 μL를 추가하고 제조 업체의 지침에 따라 진행합니다. Tris-HCl 10 mM 25 μL로 용출시킨다. 라이브러리는 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다.
2. 도서관 수표
   1. Bioanalyzer 장비를 사용하여 라이브러리 크기를 평가하기 위해 1 μL 샘플을 사용하십시오.
   2. 제조사의 지침에 따라 형광 기반 실시간 PCR 분석을 사용하여 라이브러리 몰 농도를 계량하기 위해 1 μL 샘플을 사용하십시오.
3. 라이브러리 희석 및 시퀀싱
   1. Tris-HCl 10 mM을 사용하여 10 nM까지 라이브러리를 희석하십시오. 라이브러리를 풀링하려면 각 희석 라이브러리 5 μL를 새로운 1.5 mL 튜브에 옮기고 10 mM Tris-HCl에서 4 nM으로 풀을 희석하십시오.
   2. 희석 된 풀 5 μL와 새로운 1.5 m의 0.2 N NaOH 5 μL를 섞는다.L 튜브에 넣고 간단히 보텍스로 스핀 - 다운하고 실온에서 5 분 동안 배양하여 라이브러리를 변성시킨다.
   3. 얼음에 튜브를 넣어 사전 냉각 하이브 리다이 제이션 버퍼 (HT1) 990 μL를 추가합니다. 새로운 1.5 ML 튜브에 300 μl의 변성 풀을 나누어 주며 미리 냉각 된 HT1 300 μL를 첨가하여 10 pM 최종 라이브러리 풀을 얻습니다.
   4. 병렬로 PhiX 컨트롤 라이브러리 (10nM) 2 μL와 1.5 mL 튜브에 3 μL의 Tris-HCl 10 mM을 섞으십시오. NaOH 0.2 N 5 μL를 가볍게 넣고 스핀 - 다운하고 상온에서 5 분 동안 배양하여 희석 된 PhiX를 변성시킨다. 얼음에 튜브를 넣고 미리 냉장 된 HT1 990 μL를 넣으십시오.
   5. 분분한 PhiX 300 μL를 새로운 1.5 mL 튜브에 넣고 미리 냉각 된 HT1 300 μL를 첨가하여 최종 PhiX 10 pM을 얻습니다.
   6. 새로운 1.5 mL 튜브에서 변성 라이브러리 풀 510 μL와 변성 PhiX 라이브러리 90 μL를 혼합하여 15 % PhiX 컨트롤을 갖춘 최종 10 pM 풀을 얻습니다.
   7. 샘플 600μL를 피펫볼륨을 해동 된 시퀀싱 시약 카트리지의로드 샘플 저장고에 넣고 즉시 단일 판독 150 사이클 실행을 수행하십시오.
      참고 :이 프로토콜에 필요한 중요한 시약 및 프라이머 서열은 표 1 에 나와 있습니다.

결과

레트로 바이러스 스캐닝 절차의 워크 플로우

레트로 바이러스 스캐닝 절차의 워크 플로가 그림 1 에 나와 있습니다. 표적 세포 집단을 정제하고 eGFP 리포터 유전자를 발현하는 mLV 유래 레트로 바이러스 벡터로 형질 감염시켰다. 형질 도입 유전자는 2 개의 동일한 긴 말단 반복 (5 '?...

토론

여기에서 우리는 염색질 부위를 표적으로하는 레트로 바이러스 인 mLV의 통합 사이트의 게놈 - 전체 매핑을위한 프로토콜을 설명했으며, 활성 프로모터 및 인핸서로 후생적으로 표시했습니다. 프로토콜의 중요한 단계 및 / 또는 한계는 다음을 포함합니다 : (i) 표적 세포 집단의 mLV 형질 도입; (ii) LM-PCR에 의한 바이러스 - 숙주 접합부의 증폭; (iii) 통합 사이트의 높은 비율의 검색. mLV- 기반 레트로 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS, pH 7.4	ThermoScientific	10010031	or equivalent
Fetal Bovine Serum	ThermoScientific	16000044	or equivalent
0.2 ml tubes	general lab supplier
1.5 ml tubes	general lab supplier
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit	QIAGEN	51306	or equivalent
T4 DNA ligase	New England BioLabs	M0202T
T4 DNA Ligase Reaction buffer	New England BioLabs	M0202T
Linker Plus Strand oligonucleotide	general lab supplier		5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’  (Purification grade: SDS-PAGE)
Linker Minus Strand oligonucleotide	general lab supplier		5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE)
Tru9I	Roche-Sigma-Aldrich	11464825001
SuRE/Cut Buffer M	Roche-Sigma-Aldrich	11417983001
PstI	Roche-Sigma-Aldrich	10798991001
SuRE/Cut Buffer H	Roche-Sigma-Aldrich	11417991001
Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity	Invitrogen	11304011
10 mM dNTP Mix	Invitrogen	18427013	or equivalent
PCR grade water	general lab supplier
96-well thermal cycler (with heated lid)	general lab supplier
linker primer	general lab supplier		5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade)
MLV-3’ LTR primer	general lab supplier		5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade)
linker nested primer 454	general lab supplier		5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer 454	general lab supplier		5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
linker nested primer Illumina	general lab supplier		5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer Illumina	general lab supplier		5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2	general lab supplier
Ethanol (absolute) for molecular biology	Sigma-Aldrich	E7023	or equivalent
Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector)	Invitrogen	K4500-01
QIAquick Gel Extraction kit	QIAGEN	28704
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	or equivalent
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	or equivalent
100 bp DNA ladder	Invitrogen	15628019	or equivalent
6x Loading Buffer	ThermoScientific	R0611	or equivalent
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	ThermoScientific	ND-2000
Nextera XT Index kit	Illumina	FC-131-1001 or FC-131-1002
2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix	KAPA Biosystems	KK2601
Dynal magnetic stand for 2 ml tubes	Invitrogen	12321D	or equivalent
Agencourt AMPure XP 60 ml kit	Beckman Coulter Genomics	A63881
Tris-HCl 10 mM, pH 8.5	general lab supplier
Agilent 2200 TapeStation system	Agilent Technologies	G2964AA	or equivalent
D1000 ScreenTape	Agilent Technologies	5067-5582	or equivalent
D1000 Reagents	Agilent Technologies	5067-5583	or equivalent
KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism)	KAPA Biosystems	KK4835
ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4329003
NaOH 1.0 N, molecular biology-grade	general lab supplier
HT1 (Hybridization Buffer)	Illumina	Provided in the MiSeq Reagent Kit
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles)	Illumina	MS-102-3001
MiSeq System	Illumina	SY-410-1003
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001