Escaneo Retroviral: Mapeo de sitios de integración MLV para definir regiones reguladoras específicas de células

Resumen

Aquí, describimos un protocolo para el genoma de la cartografía de los sitios de integración Moloney murino leucemia virus basados ​​en retrovirus vectores en células humanas.

Resumen

Los vectores retrovirales basados ​​en virus de la leucemia murina de Moloney (MLV) se integran predominantemente en potenciadores y promotores acetilados. Por esta razón, los sitios de integración mLV pueden usarse como marcadores funcionales de elementos reguladores activos. Aquí, presentamos una herramienta de exploración retroviral, que permite la identificación a nivel genoma de potenciadores y promotores específicos de células. En resumen, la población de células diana se transduce con un vector derivado de mLV y el ADN genómico se digiere con una enzima de restricción de corte frecuente. Después de la ligación de fragmentos genómicos con un enlazador de ADN compatible, la reacción en cadena de polimerasa mediada por enlazador (LM-PCR) permite la amplificación de las uniones genómicas virus-huésped. La secuenciación masiva de los amplicones se utiliza para definir el perfil de integración de mLV en todo el genoma. Finalmente, se definen grupos de integraciones recurrentes para identificar regiones reguladoras específicas de células, responsables de la activación de programas transcripcionales específicos de tipo celular.

por ejemplo, células madre somáticas) que carecen de marcadores robustos para el aislamiento prospectivo.

Introducción

La identidad celular se determina mediante la expresión de conjuntos específicos de genes. El papel de los elementos reguladores cis, tales como promotores y potenciadores, es crucial para la activación de programas de transcripción específicos de tipo celular. Estas regiones reguladoras se caracterizan por características específicas de la cromatina, tales como modificaciones peculiares de las histonas, factores de transcripción y unión de co-factores, y accesibilidad a la cromatina, que han sido ampliamente utilizados para su identificación genómica en varios tipos de células ^{1 , 2 , 3} . En particular, el perfil genómico de la acetilación de histona H3 lisina 27 (H3K27ac) se utiliza comúnmente para definir promotores activos, potenciadores y super-potenciadores ^{4 , 5 , 6} .

El virus de la leucemia murina de Moloney (MLV) es un gamma-retrovirus que es ampliamente utilizado para el genTransferencia en células de mamíferos. Después de infectar una célula diana, el genoma del ARN retroviral se retrotranscribe en una molécula de ADN de doble cadena que se une a las proteínas víricas y celulares para ensamblar el complejo de preinteligencia (PIC). El PIC entra en el núcleo y se une a la cromatina de la célula huésped. En este caso, la integrasa viral, un componente clave de PIC, media la integración del ADN proviral en el genoma de la célula huésped. MlV integración en el ADN genómico no es al azar, pero se produce en elementos activos cis-reguladores, tales como promotores y potenciadores, en una célula de forma específica ^{7 , 8 , 9 , 10} . Este peculiar perfil de integración está mediada por una interacción directa entre la integrasa mLV y las proteínas celulares de bromodominio y dominio extraterminal (BET) ^{11 , 12 , 13} . Las proteínas BET (BRD2, BRD3 yBRD4) actúan como puente entre la cromatina del huésped y el PIC mlV: a través de sus bromodominios reconocen regiones cis-reguladoras altamente acetiladas, mientras que el dominio extraterminal interactúa con la integrasa mLV ^{11 , 12 , 13} .

Aquí, describimos el escaneo retroviral, una herramienta novedosa para mapear regiones reguladoras cis-activas basadas en las propiedades de integración de mLV. Brevemente, las células se transducen con el vector retroviral derivado de mlV que expresa el gen indicador de proteína fluorescente verde (eGFP) mejorada. Después de la extracción del ADN genómico, las uniones entre la repetición terminal larga (LTR) de 3 'del vector mlV y el ADN genómico se amplifican mediante PCR (LM-PCR) mediada por enlazadores y se secuencian masivamente. MlV sitios de integración se asignan al genoma humano y las regiones genómicas altamente objetivo de mLV se definen como grupos de mlV sitios de integración.

Escaneo retroviralNing se utilizó para definir la célula específica de los elementos reguladores activos en varias células primarias humanas [ ^{14 , 15]} . MlV clusters co-mapeados con epigenéticamente definidos promotores y potenciadores, la mayoría de los cuales albergan histonas marcas activas, como H3K27ac, y fueron específicos de células. El escaneo retroviral permite la identificación en todo el genoma de los elementos reguladores del ADN en poblaciones de células purificadas prospectivamente 7,14 ^, así como en poblaciones celulares definidas de forma retrospectiva, como las células madre de queratinocitos, que carecen de marcadores efectivos para el aislamiento prospectivo ¹⁵ .

Protocolo

1. Transducción MLV de células humanas

1. Aislar las células diana y transducirlos con un vector retroviral derivado de mlV que alberga el gen reportero eGFP y pseudotipado con el virus de la estomatitis vesicular G (VSV-G) o la glicoproteína de la envoltura anfotrópica ¹⁶ .
   1. Mantenga las células simuladas transducidas como un control negativo para los siguientes análisis. Dado que los vectores retrovirales basados ​​en mLV pueden transducir células que se dividen eficazmente, cultivan la población de células diana en condiciones que estimulan la división celular. Las condiciones de transducción necesitan ser optimizadas específicamente para cada tipo de célula bajo estudio. Las condiciones de crecimiento celular y de transducción para progenitores hematopoyéticos humanos, células T y células epidérmicas se describen en las Referencias 7, 14, 15 y 17.
2. 48 h después de la transducción, resuspender 100.000 células en 300 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 2% de suero bovino fetal y medir la expresión de eGFP por fAnálisis de baja citometría (láser de excitación de 488 nm). Utilizar células transducidas simulando como control negativo. Para una recuperación óptima del sitio de integración, purifique las células GFP ⁺ mediante Clasificación Celular Activada por Fluorescencia (FACS).
3. Recoger 0,5 a 5 millones de células para la preparación del ADN genómico. Se prefiere un período de cultivo más largo (> 7 días) para diluir el provirus no integrado y es necesario cuando se analiza la progenie a largo plazo de células madre bona fide (véase la sección de discusión y la referencia ¹⁵ ). Los gránulos de células pueden congelarse instantáneamente y almacenarse a -80 ° C hasta su uso.

2. Amplificación de los sitios de integración de mLV mediante PCR-PCR (LM-PCR)

1. Preparación de ADN genómico (gDNA)
   1. Extraer gDNA utilizando un kit de extracción de ADN a base de columna y seguir el protocolo para las células cultivadas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Enzima de restricción digestien
   1. Preparar 4 digestiones de enzimas de restricción por muestra en tubos de 1,5 mL. Digerir 0,1 a 1 μg de gDNA en cada tubo añadiendo 1 μl de Tru9I (10 U) y 1 μl de Tampón M en un volumen final de 10 μl. Incubar las reacciones a 65 ° C durante 6 h o durante la noche.
   2. Añadir a cada reacción 1 μl de PstI (10 U), 1 μl de Tampón H y 8 μl de agua. Incubar las reacciones a 37 ° C durante 6 h o durante la noche. Las muestras pueden almacenarse a -20 ° C hasta su uso.
3. Enlazador ligadura
   1. Preparar una solución madre Tru9I 100 μM de enlace en un tubo de 1,5 ml mezclando los oligonucleótidos de hebra más ligando y ligador menos una concentración de 100 μM. Poner el tubo en un conjunto de agua a 100 ° C y dejar enfriar a temperatura ambiente. La solución madre de ligante Tru9I se puede almacenar a -20 ° C hasta su uso.
   2. Establecer 8 reacciones de ligadura de ligadores en tubos de 1,5 mL. Para cada reacción, añada el siguiente componenteS a 10 μl de digestión con enzimas de restricción: 1,4 μl de tampón de reacción de 10 μg de ADN-ligasa T4, 1 μl de Tru9I de ligante 10 μM, 1 μL (2.000 U) de T4 DNA ligasa y 0,6 μl de agua. Incubar a 16 ° C durante 3 a 6 h. Las muestras pueden almacenarse a -20 ° C hasta su uso.
4. Primera PCR
   1. Establecer 48 reacciones de PCR (6 reacciones de cada tubo de ligadura) en tubos de 0,2 ml. Para cada PCR, añada los siguientes reactivos a 2 μl de reacción de ligadura: 5 μl de tampón de PCR 10X, 2 μl de sulfato de magnesio 50 mM, 1 μl de desoxinucleótido 10 mM (dNTP), 1 μl de cebador 10 μM de ligante, Μl de cebador LTR mLV-3 '10 μM, 0,3 μl (1,5 U) de Taq DNA Polimerasa y 37,7 μl de agua. Las secuencias de cebador se proporcionan en la Tabla 1.
   2. Realizar la reacción de PCR en un termociclador con tapa calentada, como sigue: 95 ° C durante 2 min; 25 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 55 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 1 min; 72 °; C durante 5 min; Mantener a 4 ° C. Las muestras pueden almacenarse a -20 ° C hasta su uso.
5. Segunda PCR
   1. Establecer 48 reacciones de PCR (1 de cada "primer tubo de PCR") en tubos de 0,2 ml. Para cada PCR, añada los siguientes componentes a 2 μL de la primera reacción de PCR: 5 μl de tampón de PCR 10X, 2 μL de Sulfato de Magnesio 50 mM, 1 μl de Mezcla de dNTP 10 mM, 1 μl de cebador anidado de ligante 10 μM, Μl de cebador anidado de 10 μM mLV-3 'LTR, 0,3 μL de Taq DNA Polimerasa (1,5 U) y 37,7 μl de agua. Utilizar cebadores anidados diseñados para la estrategia de secuenciación masiva específica elegida: (i) cebador anidado de enlace y cebador anidado de mLV-3 'LTR compatible con la plataforma Illumina; (Ii) cebador anidado de enlace y cebador anidado de LTR mLV-3 'compatible con la plataforma de Roche. Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla 1 .
   2. Realizar la reacción de PCR en un termociclador con tapa calentada, como sigue: 95 ° C durante 2 min; 25Ciclos de 95 ° C durante 15 s, 58 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 1 min; 72ºC durante 5 min; Mantener a 4 ° C. Las muestras pueden almacenarse a -20 ° C hasta su uso.
   3. Agrupe las 48 reacciones de PCR anidadas en un tubo de 15 ml (volumen final de ~ 2,4 ml). Las muestras pueden almacenarse a -20 ° C hasta su uso.
6. Determinar la presencia y el tamaño de los productos de LM-PCR mediante electroforesis en gel de agarosa.
   1. Añadir 4 μl de tampón de carga a 20 μL de productos LM-PCR y cargar la muestra en un gel de agarosa al 1%, junto con una escala de ADN de 100 bp. Hacer funcionar el gel a 5 V / cm durante 30 a 60 minutos y visualizar los productos de PCR mediante tinción con bromuro de etidio.
   2. Ejecutar una reacción LM-PCR de la muestra de transducción simulada como control negativo.
7. Se precipitaron los amplicones añadiendo 0,1 volúmenes de solución de acetato de sodio (3 M, pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Mezclar y congelar a -80 ° C durante 20 min.
   1. Giro en fuLl en una microcentrífuga estándar a 4 ° C durante 20 min. Desechar el sobrenadante y lavar el sedimento con etanol al 70%. Girar a toda velocidad en una microcentrífuga estándar a 4 ° C durante 5 min.
   2. Desechar el sobrenadante y secar al aire el pellet. Añadir 200 μl de agua de grado PCR y resuspender el ADN. Las muestras pueden almacenarse a -20 ° C hasta su uso.
8. Añadir 20 μl de tampón de carga a 100 μL de los productos de LM-PCR y cargar la muestra en un gel de agarosa al 1%, junto con una escalera de ADN de 100 bp.
   1. Se hace funcionar el gel a 5 V / cm durante 30 a 60 minutos y se corta la porción del gel que contiene 150 a 500 bp de largo amplicones.
   2. Purificar los productos LM-PCR con un kit de extracción de gel a base de columna y medir la concentración usando un espectrofotómetro UV.
9. Utilice 1 μl de biblioteca para evaluar la longitud de los productos de LM-PCR usando un instrumento de bioanalizador, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
10. Clonación con escopeta de amplicones
    1. Utilizar 20 ng de los productos LM-PCR purificados y clonarlos en el vector pCR2.1-TOPO, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Realizar reacciones de secuenciación utilizando el cebador universal M13, seguido de la cartografía genómica de las secuencias resultantes, para revelar la presencia de las uniones del genoma viral (incluido el cebador anidado de mLV-3 'LTR) en> 50% de los clones para identificar muestras adecuadas Para la secuenciación masiva. Ejemplo de una unión viral-genoma:
       
       MLV-3 'LTR iniciador anidado 454 y el iniciador anidado de ligador 454 ( Tabla 1 ) se indican en negrita y el extremo 3' del LTR viral en cursiva. La secuencia genómica humana se destaca en texto rojo (chr10: 6439408 - 6439509, hg19).

3. Secuenciación masiva de los sitios de integración de mLV

NOTA: Producto LM-PCRLos procesos pueden ser secuenciados usando plataformas comerciales (eligiendo el par anidado apropiado en la segunda reacción PCR, véase la subsección 2.5.1). Para la secuenciación por Roche GS-FLX pyrosequencing plataforma, consulte a los documentos anteriores ^{7 , 14 , 15} . En esta sección, se describe un protocolo recién optimizado para la plataforma de secuenciación de Illumina.

1. Preparación de la biblioteca
   1. Establecer una reacción de PCR de indexación por muestra en tubos de 0,2 ml. Para cada PCR, a~nadir los siguientes reactivos a 5 μl (150-170 ng) de producto LM-PCR purificado: 5 μl de Primer Indice 1, 5 μl de Indice Primer 2, 25 μL de 2X Master Mix y 10 μL de PCR- Grado de agua. Utilice una combinación de índice diferente para cada muestra.
   2. Realizar reacciones de PCR en un termociclador con tapa calentada, como sigue: 95 ° C durante 3 min; 8 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 30 s; 72 ° C durante 5 men; Mantener a 4 ° C.
   3. Purificar los productos de PCR usando un protocolo de aislamiento de perlas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI): en tubos nuevos de 1,5 ml, agregar 56 μL de perlas a cada muestra y proceder siguiendo las instrucciones del fabricante. Eluir en 25 μl de Tris-HCl 10 mM. Las bibliotecas pueden almacenarse a -20 ° C hasta su uso.
2. Comprobación de la biblioteca
   1. Utilice 1 μl de muestra para evaluar el tamaño de la biblioteca utilizando un instrumento de bioanalizador.
   2. Utilizar 1 μl de muestra para cuantificar la molaridad de la biblioteca usando un ensayo de PCR en tiempo real basado en fluorescencia, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
3. Dilución y secuenciación de la biblioteca
   1. Diluir las bibliotecas hasta 10 nM usando Tris-HCl 10 mM. Para la agrupación de las bibliotecas, transferir 5 μ l de cada biblioteca diluida a un nuevo tubo de 1,5 ml y luego diluir la piscina a 4 nM en Tris-HCl 10 mM.
   2. Mezclar 5 μL de la mezcla diluida con 5 μl de NaOH 0,2 N en un nuevo 1,5 mL, vórtice brevemente, centrifugue e incube durante 5 min a temperatura ambiente para desnaturalizar las bibliotecas.
   3. Ponga los tubos en hielo y agregue 990 μl de tampón de hibridación pre-enfriado (HT1). Alícuota de 300 μ l de piscina desnaturalizada en un nuevo tubo de 1,5 ml y añadir 300 μ l de pre-refrigerados HT1 para obtener una biblioteca final de 10 pM.
   4. En paralelo, mezclar 2 μl de biblioteca de control PhiX (10 nM) con 3 μl de Tris-HCl 10 mM en un tubo de 1,5 ml. Añadir 5 μL de NaOH 0,2 N, agitar brevemente vórtice, centrifugar e incubar durante 5 min a temperatura ambiente para desnaturalizar la PhiX diluida. Coloque el tubo sobre hielo y añada 990 μl de HT1 previamente enfriado.
   5. Alícuote 300 μl de PhiX desnaturalizada en un nuevo tubo de 1,5 ml y añada 300 μl de HT1 previamente enfriado para obtener una PhiX final de 10 μM.
   6. En un nuevo tubo de 1,5 ml, mezclar 510 μL de la piscina de la biblioteca desnaturalizada con 90 μL de la biblioteca PhiX desnaturalizada, obteniendo así un pool final de 10 μM con un 15% de control PhiX.
   7. Pipetear estos 600 μl de muestraDe volumen en el depósito de carga de muestra del cartucho de reactivo de secuenciación descongelado y proceda inmediatamente a realizar un ciclo de 150 ciclos.
      NOTA: Los reactivos críticos y secuencias de cebadores requeridos para este protocolo se enumeran en la Tabla 1 .

Resultados

Flujo de trabajo del procedimiento de exploración retroviral

El flujo de trabajo del procedimiento de exploración retroviral se esquematiza en la Figura 1 . La población de células diana se purifica y transduce con un vector retroviral derivado de mlV que expresa un gen informador eGFP. El transgén está flanqueado por las dos repeticiones terminales largas idénticas (5 'y 3' LTR), aseg...

Discusión

Aquí, hemos descrito un protocolo para el genoma de la cartografía de los sitios de integración de mLV, un retrovirus que las regiones de la cromatina objetivo, epigenéticamente marcado como promotores activos y potenciadores. Los pasos críticos y / o limitaciones del protocolo incluyen: (i) transducción mLV de la población de células diana; (Ii) amplificación de las uniones huésped-virus por LM-PCR; (Iii) recuperación de una alta fracción de sitios de integración. Los vectores retrovirales basados ​​en...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS, pH 7.4	ThermoScientific	10010031	or equivalent
Fetal Bovine Serum	ThermoScientific	16000044	or equivalent
0.2 ml tubes	general lab supplier
1.5 ml tubes	general lab supplier
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit	QIAGEN	51306	or equivalent
T4 DNA ligase	New England BioLabs	M0202T
T4 DNA Ligase Reaction buffer	New England BioLabs	M0202T
Linker Plus Strand oligonucleotide	general lab supplier		5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’  (Purification grade: SDS-PAGE)
Linker Minus Strand oligonucleotide	general lab supplier		5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE)
Tru9I	Roche-Sigma-Aldrich	11464825001
SuRE/Cut Buffer M	Roche-Sigma-Aldrich	11417983001
PstI	Roche-Sigma-Aldrich	10798991001
SuRE/Cut Buffer H	Roche-Sigma-Aldrich	11417991001
Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity	Invitrogen	11304011
10 mM dNTP Mix	Invitrogen	18427013	or equivalent
PCR grade water	general lab supplier
96-well thermal cycler (with heated lid)	general lab supplier
linker primer	general lab supplier		5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade)
MLV-3’ LTR primer	general lab supplier		5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade)
linker nested primer 454	general lab supplier		5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer 454	general lab supplier		5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
linker nested primer Illumina	general lab supplier		5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer Illumina	general lab supplier		5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2	general lab supplier
Ethanol (absolute) for molecular biology	Sigma-Aldrich	E7023	or equivalent
Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector)	Invitrogen	K4500-01
QIAquick Gel Extraction kit	QIAGEN	28704
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	or equivalent
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	or equivalent
100 bp DNA ladder	Invitrogen	15628019	or equivalent
6x Loading Buffer	ThermoScientific	R0611	or equivalent
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	ThermoScientific	ND-2000
Nextera XT Index kit	Illumina	FC-131-1001 or FC-131-1002
2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix	KAPA Biosystems	KK2601
Dynal magnetic stand for 2 ml tubes	Invitrogen	12321D	or equivalent
Agencourt AMPure XP 60 ml kit	Beckman Coulter Genomics	A63881
Tris-HCl 10 mM, pH 8.5	general lab supplier
Agilent 2200 TapeStation system	Agilent Technologies	G2964AA	or equivalent
D1000 ScreenTape	Agilent Technologies	5067-5582	or equivalent
D1000 Reagents	Agilent Technologies	5067-5583	or equivalent
KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism)	KAPA Biosystems	KK4835
ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4329003
NaOH 1.0 N, molecular biology-grade	general lab supplier
HT1 (Hybridization Buffer)	Illumina	Provided in the MiSeq Reagent Kit
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles)	Illumina	MS-102-3001
MiSeq System	Illumina	SY-410-1003
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001