Numérisation Retroviral: Mapping des sites d'intégration MLV pour définir des régions réglementaires spécifiques à une cellule

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour la cartographie génomique des sites d'intégration des vecteurs rétroviraux à base de virus de la leucémie murine Moloney dans les cellules humaines.

Résumé

Les vecteurs rétroviraux à base de virus de la leucémie murine Moloney (MLV) s'intègrent principalement dans les agents améliorant et promoteurs acétylés. Pour cette raison, les sites d'intégration mLV peuvent être utilisés comme marqueurs fonctionnels des éléments réglementaires actifs. Ici, nous présentons un outil de balayage rétroviral, qui permet l'identification du génome des amplificateurs et des promoteurs spécifiques de cellules. En bref, la population de cellules cibles est transduit avec un vecteur dérivé de mLV et l'ADN génomique est digéré avec une enzyme de restriction souvent coupante. Après ligature de fragments génomiques avec un lieur d'ADN compatible, la réaction en chaîne par polymérase (LM-PCR) médiée par un lieur permet l'amplification des jonctions génome virus-hôte. Un séquençage massif des amplicons est utilisé pour définir le profil d'intégration de mLV en fonction du génome. Enfin, des grappes d'intégrations récurrentes sont définies pour identifier les régions réglementaires spécifiques aux cellules, responsables de l'activation des programmes de transcription spécifiques aux cellules.

p. Ex. Cellules souches somatiques) qui manquent de marqueurs robustes pour l'isolement prospectif.

Introduction

L'identité cellulaire est déterminée par l'expression d'ensembles spécifiques de gènes. Le rôle des éléments cis-régulateurs, tels que les promoteurs et les amplificateurs, est crucial pour l'activation de programmes de transcription spécifiques au type cellulaire. Ces régions réglementaires sont caractérisées par des caractéristiques spécifiques de la chromatine, telles que les modifications particulières des histones, les facteurs de transcription et la liaison des co-facteurs, et l'accessibilité à la chromatine, qui ont été largement utilisés pour leur identification à l'échelle du génome dans plusieurs types de cellules ^{1 , 2 , 3} . En particulier, le profil génomique de l'acétylation de l'histone H3 lysine 27 (H3K27ac) est couramment utilisé pour définir des promoteurs actifs, des amplificateurs et des super-amplificateurs ^{4 , 5 , 6} .

Le virus de la leucémie murine Moloney (MLV) est un retrovirus gamma largement utilisé pour le gèneTransfert dans des cellules de mammifères. Après avoir infecté une cellule cible, le génome d'ARN rétroviral est rétro-transcrit dans une molécule d'ADN double brin qui se lie aux protéines virales et cellulaires pour assembler le complexe de pré-intégration (PIC). La PIC entre dans le noyau et lie la chromatine de la cellule hôte. Ici, l'intégrase virale, un composant clé PIC, sert à faciliter l'intégration de l'ADN proviral dans le génome de la cellule hôte. L'intégration de mLV dans l'ADN génomique n'est pas aléatoire, mais se produit dans des éléments actifs régulateurs cis, tels que des promoteurs et des amplificateurs, de manière spécifique aux cellules ^{7 , 8 , 9 , 10} . Ce profil d'intégration particulier est médié par une interaction directe entre l'intégrase de mLV et les protéines de domaine de bromodomane cellulaire et de domaine extraterminal (BET) ^{11 , 12 , 13} . Les protéines BET (BRD2, BRD3 etBRD4) agissent comme un pont entre la chromatine de l'hôte et la PIC de mLV: à travers leurs bromodomains, ils reconnaissent des régions régulatrices cis cisées, fortement acceptées, tandis que le domaine extraterminal interagit avec l'intégrase de mLV ^{11 , 12 , 13} .

Ici, nous décrivons le balayage rétroviral, un nouvel outil pour mapper les régions actives cis-régulatrices en fonction des propriétés d'intégration de mLV. Brièvement, les cellules sont transduites avec un vecteur rétroviral dérivé de mLV exprimant le gène rapporteur de la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP). Après l'extraction de l'ADN génomique, les jonctions entre la répétition terminale de 3 '(LTR) du vecteur mLV et l'ADN génomique sont amplifiées par une PCR médiatisée (LM-PCR) et séquencées massivement. Les sites d'intégration mLV sont mappés au génome humain et les régions génomiques hautement ciblées par mLV sont définies comme des grappes de sites d'intégration mLV.

Analyse rétroviraleA été utilisé pour définir des éléments régulateurs actifs spécifiques de cellules dans plusieurs cellules primaires humaines ^{14 , 15} . Les grappes de mLV ont été co-mappées avec des promoteurs et des amplificateurs définis de manière épigénétique, dont la plupart abritaient des marques d'histones actives, telles que H3K27ac, et étaient spécifiques de cellules. Le balayage rétroviral permet l'identification à l'échelle du génome des éléments de régulation de l'ADN dans les populations de cellules prospectivement purifiées ^{7 , 14} ainsi que dans les populations de cellules rétrospectivement définies, telles que les cellules souches de kératinocytes, qui ne présentent pas de marqueurs efficaces pour l'isolement prospectif ¹⁵ .

Protocole

1. Transduction MLV des cellules humaines

1. Isoler les cellules cibles et les transduire avec un vecteur retroviral dérivé de mLV hébergeant le gène rapporteur eGFP et pseudotypé avec le virus de la stomatite vésiculaire G (VSV-G) ou la glycoprotéine de l'enveloppe amphotrope ¹⁶ .
   1. Gardez les cellules transduites par défaut comme un contrôle négatif pour les analyses suivantes. Puisque les vecteurs rétroviraux à base de mLV peuvent transduire efficacement les cellules en division, culturez la population de cellules cibles dans des conditions qui stimulent la division cellulaire. Les conditions de transduction doivent être spécifiquement optimisées pour chaque type de cellule étudié. La croissance cellulaire et les conditions de transduction pour les progéniteurs hématopoïétiques humains, les lymphocytes T et les cellules épidermiques sont décrites dans les références 7, 14, 15 et 17.
2. 48 h après la transduction, ré-endiguer 100 000 cellules dans 300 μL de solution salée tamponnée au phosphate (PBS) contenant 2% de sérum bovin fœtal et mesurer l'expression de l'eGFP par fFaible analyse cytométrique (laser d'excitation de 488 nm). Utiliser des cellules transduites simulées comme témoins négatifs. Pour une récupération optimale du site d'intégration, purifiez les cellules GFP ⁺ par le tri de cellules activées par fluorescence (FACS).
3. Recueillir 0,5 à 5 millions de cellules pour la préparation d'ADN génomique. Une période de culture plus longue (> 7 jours) est préférée pour diluer le provirus non intégré et nécessaire lors de l'analyse de la descendance à long terme de cellules souches de bonne foi (voir la section de discussion et la référence ¹⁵ ). Les granulés cellulaires peuvent être congelés instantanément et stockés à -80 ° C jusqu'à leur utilisation.

2. Amplification des sites d'intégration mLV par PCR par médiateur (LM-PCR)

1. Préparation de l'ADN génomique (ADN gDNA)
   1. Extraire gDNA en utilisant un kit d'extraction d'ADN à base de colonne et suivre le protocole pour les cellules cultivées, selon les instructions du fabricant.
2. Digestion enzymatique de restrictionsur
   1. Mettre en place 4 digestion par enzyme de restriction par échantillon dans des tubes de 1,5 mL. Digérer 0,1 à 1 μg d'ADNg dans chaque tube en ajoutant 1 μL de Tru9I (10U) et 1 μL de tampon M dans un volume final de 10 μL. Incuber les réactions à 65 ° C pendant 6 h ou pendant la nuit.
   2. Ajouter à chaque réaction 1 μl de PstI (10U), 1 μL de tampon H et 8 μL d'eau. Incuber les réactions à 37 ° C pendant 6 h ou pendant la nuit. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à l'utilisation.
3. Ligature des ligands
   1. Préparer une solution mère linker Tru9I à 100 μM dans un tube de 1,5 ml en mélangeant les oligonucleotides de brin plus de fil et linker moins à une concentration de 100 μM. Mettez le tube dans une eau réglée à 100 ° C et laissez-le refroidir à température ambiante. La solution mère linker Tru9I peut être stockée à -20 ° C jusqu'à son utilisation.
   2. Mettre en place 8 réactions de ligature de linker dans des tubes de 1,5 mL. Pour chaque réaction, ajoutez le composant suivantS à 10 μL de digestion enzymatique de restriction: 1,4 μL de 10X T4 DNA Ligase Reaction buffer, 1 μL de 10 μM de liaison Tru9I, 1 μL (2 000 U) d'ADN ligase T4 et 0,6 μL d'eau. Incuber à 16 ° C pendant 3 à 6 h. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à l'utilisation.
4. Première PCR
   1. Mettre en place 48 réactions PCR (6 réactions de chaque tube de ligature) dans des tubes de 0,2 ml. Pour chaque PCR, ajouter les réactifs suivants à 2 μL de réaction de ligature: 5 μL de tampon de PCR 10X, 2 μL de sulfate de magnésium 50 mM, 1 μL de mélange de désoxynucléotide 10 mM (dNTP), 1 μL d'amorce de liaison 10 μM 1 ΜL d'amorce LTR 10 μM mLV-3 ', 0,3 μL (1,5 U) de Taq DNA Polymerase et 37,7 μl d'eau. Les séquences d'amorces sont fournies dans le tableau 1.
   2. Effectuer la réaction de PCR dans un thermocycleur avec couvercle chauffé, comme suit: 95 ° C pendant 2 min; 25 cycles de 95 ° C pendant 15 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 1 min; 72 °; C pendant 5 min; Maintenez à 4 ° C. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à l'utilisation.
5. Deuxième PCR
   1. Mettre en place 48 réactions PCR (1 de chaque tube "première PCR") dans des tubes de 0,2 ml. Pour chaque PCR, ajouter les composants suivants à 2 μl de la première réaction de PCR: 5 μL de tampon de PCR 10X, 2 μL de sulfate de magnésium 50 mM, 1 μl de mélange de dNTP 10 mM, 1 μL d'amorce imbriquée liant 10 μM, 1 ΜL d'amorce imbriquée LTR de 10 μM mLV-3 ', 0,3 μl de Taq DNA Polymerase (1,5 U) et 37,7 μL d'eau. Utilisez des amorces imbriquées conçues pour la stratégie de séquençage massif spécifique choisie: (i) amorce imbriquée et amorce imbriquée LTR de mLV-3 compatible avec la plate-forme Illumina; (Ii) l'amorce imbriquée et l'amorce imbriquée LTR de mLV-3 'compatible avec la plate-forme Roche. Les séquences d'amorces sont listées dans le tableau 1 .
   2. Effectuer la réaction de PCR dans un thermocycleur avec couvercle chauffé, comme suit: 95 ° C pendant 2 min; 25Cycles de 95 ° C pendant 15 s, 58 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 1 min; 72 ° C pendant 5 min; Maintenez à 4 ° C. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à l'utilisation.
   3. Associez les 48 réactions de PCR imbriquées dans un tube de 15 mL (volume final de ~ 2,4 mL). Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à l'utilisation.
6. Déterminer la présence et la taille des produits LM-PCR par électrophorèse sur gel d'agarose.
   1. Ajouter 4 μL de tampon de chargement à 20 μL de produits LM-PCR et charger l'échantillon sur un gel d'agarose à 1%, avec une échelle d'ADN de 100 pb. Faire fonctionner le gel à 5 ​​V / cm pendant 30 à 60 min et visualiser les produits de PCR par coloration au bromure d'éthidium.
   2. Effectuer une réaction LM-PCR à partir de l'échantillon transduit comme un contrôle négatif.
7. Précipiter les amplicons en ajoutant 0,1 volume de solution d'acétate de sodium (3 M, pH 5,2) et 2,5 volumes d'éthanol à 100%. Mélanger et congeler à -80 ° C pendant 20 min.
   1. Rotation à fuVitesse dans une microcentrifugeuse standard à 4 ° C pendant 20 min. Jeter le surnageant et laver la pastille à 70% d'éthanol. Faire tourner à pleine vitesse dans une microcentrifugeuse standard à 4 ° C pendant 5 min.
   2. Jeter le surnageant et sécher à l'air la pastille. Ajouter 200 μl d'eau de qualité PCR et ré-endiguer l'ADN. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à l'utilisation.
8. Ajouter 20 μL de tampon de chargement à 100 μL des produits LM-PCR et charger l'échantillon sur un gel d'agarose à 1%, conjointement avec une échelle d'ADN de 100 pb.
   1. Faire fonctionner le gel à 5 ​​V / cm pendant 30 à 60 min et couper la partie du gel contenant des amplicons de 150 à 500 pb.
   2. Purifier les produits LM-PCR avec un kit d'extraction de gel à base de colonne et mesurer la concentration en utilisant un spectrophotomètre UV.
9. Utilisez 1 μL de bibliothèque pour évaluer la longueur des produits LM-PCR à l'aide d'un instrument de bioanalyseur, selon les instructions du fabricant.
10. clonage de fusils de chasse d'amplicons
    1. Utiliser 20 ng des produits de LM-PCR purifiés et les cloner dans le vecteur pCR2.1-TOPO, conformément aux instructions du fabricant.
    2. Effectuer des réactions de séquençage à l'aide de l'amorce M13 Universal, suivie d'une cartographie génomique des séquences résultantes, pour révéler la présence des jonctions virales-génomes (y compris l'amorce imbriquée LTR de mLV-3) dans> 50% des clones pour identifier les échantillons appropriés Pour un séquençage massif. Exemple de jonction du génome viral:
       
       L'amorçage imbriqué LTR MLV-3 '454 et l'amorce imbriquée lieur 454 ( tableau 1 ) sont indiqués en gras et l'extrémité 3' de la LTR virale en italique. La séquence génomique humaine est mise en évidence en texte rouge (chr10: 6439408-6439509, hg19).

3. Séquençage massif des sites d'intégration mLV

REMARQUE: produit LM-PCRLes ucts peuvent être séquencés à l'aide de plates-formes commerciales (en choisissant la paire d'amorces imbriquées appropriée dans la deuxième réaction de PCR, voir la sous-section 2.5.1). Pour le séquençage par la plate-forme pyrosequencing Roche GS-FLX, reportez-vous aux documents précédents ^{7 , 14 , 15} . Dans cette section, un protocole nouvellement optimisé pour la plate-forme de séquençage Illumina est décrit.

1. Préparation de la bibliothèque
   1. Mettre en place 1 réaction de PCR d'indexation par échantillon dans des tubes de 0,2 ml. Pour chaque PCR, ajouter les réactifs suivants à 5 μL (150-170 ng) de produit LM-PCR purifié: 5 μL d'Primer Index 1, 5 μL d'Index Primer 2, 25 μL de 2X Master Mix et 10 μL de PCR- Eau de qualité. Utilisez une combinaison d'index différente pour chaque échantillon.
   2. Effectuer des réactions de PCR dans un thermocycleur avec couvercle chauffé, comme suit: 95 ° C pendant 3 min; 8 cycles de 95 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 30 s; 72 ° C pendant 5 mdans; Maintenez à 4 ° C.
   3. Purifier les produits de PCR en utilisant un protocole d'isolement de perles réversibles en phase solide (SPRI): dans de nouveaux tubes de 1,5 mL, ajouter 56 μL de perles à chaque échantillon et procéder conformément aux instructions du fabricant. Eluir dans 25 μL de Tris-HCl 10 mM. Les bibliothèques peuvent être stockées à -20 ° C jusqu'à leur utilisation.
2. Vérification de la bibliothèque
   1. Utilisez 1 μl d'échantillon pour évaluer la taille de la bibliothèque en utilisant un instrument de bioanalyseur.
   2. Utiliser 1 μl d'échantillon pour quantifier la molarité de la bibliothèque en utilisant un test de PCR en temps réel à base de fluorescence, conformément aux instructions du fabricant.
3. Dilution et séquençage de la bibliothèque
   1. Diluer les bibliothèques à 10 nM en utilisant Tris-HCl 10 mM. Pour regrouper des bibliothèques, transférez 5 μL de chaque banque diluée dans un nouveau tube de 1,5 ml puis diluez le bassin à 4 nM dans du Tris-HCl 10 mM.
   2. Mélanger 5 μL de pool dilué avec 5 μL de NaOH 0,2 N dans un nouveau 1,5 mL, vortex brièvement, centrifuger et incuber pendant 5 min à température ambiante pour dénaturer les bibliothèques.
   3. Mettez des tubes sur de la glace et ajoutez 990 μl de tampon d'hybridation pré-refroidi (HT1). Aliquoter 300 μL de pool dénaturé dans un nouveau tube de 1,5 ml et ajouter 300 μL de HT1 pré-refroidi pour obtenir un pool de bibliothèque finale de 10 pM.
   4. En parallèle, mélanger 2 μL de la banque de contrôle PhiX (10 nM) avec 3 μL de Tris-HCl 10 mM dans un tube de 1,5 ml. Ajouter 5 μL de NaOH 0,2 N, vortex brièvement, centrifuger et incuber pendant 5 min à température ambiante pour dénaturer le PhiX dilué. Mettre le tube sur de la glace et ajouter 990 μl de HT1 pré-refroidi.
   5. Aliquoter 300 μL de PhiX dénaturé dans un nouveau tube de 1,5 ml et ajouter 300 μL de HT1 pré-refroidi pour obtenir un PhiX final de 10 pM.
   6. Dans un nouveau tube de 1,5 ml, mélanger 510 μL de pool de bibliothèque dénaturé avec 90 μL de bibliothèque PhiX dénaturée, obtenant ainsi un pool final de 10 pM avec 15% de contrôle PhiX.
   7. Pipeter ces 600 μl d'échantillonVolume dans le réservoir Load Sample de la cartouche de réactif de séquençage décongelée et procédez immédiatement pour effectuer une exécution de 150 cycles à lecture unique.
      REMARQUE: Les réactifs critiques et les séquences d'amorces requises pour ce protocole sont listées dans le tableau 1 .

Résultats

Flux de travail de la procédure de balayage rétroviral

Le flux de travail de la procédure de balayage rétroviral est schématisé à la figure 1 . La population de cellules cibles est purifiée et transduit avec un vecteur rétroviral dérivé de mLV exprimant un gène rapporteur d'eGFP. Le transgène est flanqué par les deux répétitions terminales longues identiques (LTR 5 'et 3')...

Discussion

Ici, nous avons décrit un protocole pour la cartographie génomique des sites d'intégration de mLV, un rétrovirus qui cible les régions de chromatine, marquées épigénétiquement en tant que promoteurs et amplificateurs actifs. Les étapes critiques et / ou les limitations du protocole comprennent: (i) la transduction de mLV de la population de cellules cibles; (Ii) l'amplification des jonctions virus-hôte par LM-PCR; (Iii) récupération d'une fraction élevée des sites d'intégration. Les vecte...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS, pH 7.4	ThermoScientific	10010031	or equivalent
Fetal Bovine Serum	ThermoScientific	16000044	or equivalent
0.2 ml tubes	general lab supplier
1.5 ml tubes	general lab supplier
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit	QIAGEN	51306	or equivalent
T4 DNA ligase	New England BioLabs	M0202T
T4 DNA Ligase Reaction buffer	New England BioLabs	M0202T
Linker Plus Strand oligonucleotide	general lab supplier		5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’  (Purification grade: SDS-PAGE)
Linker Minus Strand oligonucleotide	general lab supplier		5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE)
Tru9I	Roche-Sigma-Aldrich	11464825001
SuRE/Cut Buffer M	Roche-Sigma-Aldrich	11417983001
PstI	Roche-Sigma-Aldrich	10798991001
SuRE/Cut Buffer H	Roche-Sigma-Aldrich	11417991001
Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity	Invitrogen	11304011
10 mM dNTP Mix	Invitrogen	18427013	or equivalent
PCR grade water	general lab supplier
96-well thermal cycler (with heated lid)	general lab supplier
linker primer	general lab supplier		5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade)
MLV-3’ LTR primer	general lab supplier		5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade)
linker nested primer 454	general lab supplier		5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer 454	general lab supplier		5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
linker nested primer Illumina	general lab supplier		5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer Illumina	general lab supplier		5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2	general lab supplier
Ethanol (absolute) for molecular biology	Sigma-Aldrich	E7023	or equivalent
Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector)	Invitrogen	K4500-01
QIAquick Gel Extraction kit	QIAGEN	28704
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	or equivalent
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	or equivalent
100 bp DNA ladder	Invitrogen	15628019	or equivalent
6x Loading Buffer	ThermoScientific	R0611	or equivalent
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	ThermoScientific	ND-2000
Nextera XT Index kit	Illumina	FC-131-1001 or FC-131-1002
2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix	KAPA Biosystems	KK2601
Dynal magnetic stand for 2 ml tubes	Invitrogen	12321D	or equivalent
Agencourt AMPure XP 60 ml kit	Beckman Coulter Genomics	A63881
Tris-HCl 10 mM, pH 8.5	general lab supplier
Agilent 2200 TapeStation system	Agilent Technologies	G2964AA	or equivalent
D1000 ScreenTape	Agilent Technologies	5067-5582	or equivalent
D1000 Reagents	Agilent Technologies	5067-5583	or equivalent
KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism)	KAPA Biosystems	KK4835
ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4329003
NaOH 1.0 N, molecular biology-grade	general lab supplier
HT1 (Hybridization Buffer)	Illumina	Provided in the MiSeq Reagent Kit
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles)	Illumina	MS-102-3001
MiSeq System	Illumina	SY-410-1003
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001