Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites zur Definition zellspezifischer Regulierungsregionen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur genomweiten Kartierung der Integrationsorte von Moloney murinen Leukämie-Virus-basierten retroviralen Vektoren in menschlichen Zellen.

Zusammenfassung

Moloney murine Leukämie (MLV) Virus-basierte retrovirale Vektoren integrieren sich überwiegend in acetylierte Enhancer und Promotoren. Aus diesem Grund können mLV-Integrationsorte als funktionale Marker aktiver regulatorischer Elemente verwendet werden. Hier präsentieren wir ein retrovirales Scan-Tool, das die genomweite Identifizierung von zellspezifischen Enhancern und Promotoren ermöglicht. Kurz gesagt wird die Zielzellpopulation mit einem mLV-abgeleiteten Vektor transduziert und genomische DNA wird mit einem häufig schneidenden Restriktionsenzym verdaut. Nach der Ligation von genomischen Fragmenten mit einem kompatiblen DNA-Linker ermöglicht die Linker-vermittelte Polymerase-Kettenreaktion (LM-PCR) die Amplifikation der Virus-Host-Genom-Übergänge. Die massive Sequenzierung der Ampullen wird verwendet, um das mLV-Integrationsprofil genomweit zu definieren. Schließlich werden Cluster von wiederkehrenden Integrationen definiert, um zellspezifische regulatorische Regionen zu identifizieren, die für die Aktivierung von zelltypspezifischen Transkriptionsprogrammen verantwortlich sind.

z. B. somatische Stammzellen) dar, die keine robusten Marker für eine prospektive Isolation aufweisen.

Einleitung

Die Zellidentität wird durch die Expression spezifischer Gene bestimmt. Die Rolle von cis-regulatorischen Elementen wie Promotoren und Enhancern ist entscheidend für die Aktivierung von zelltypspezifischen Transkriptionsprogrammen. Diese regulatorischen Regionen zeichnen sich durch spezifische Chromatin-Merkmale aus, wie z. B. eigenartige Histon-Modifikationen, Transkriptionsfaktoren und Co-Faktoren-Bindung und Chromatin-Zugänglichkeit, die für ihre genomweite Identifizierung in mehreren Zelltypen ^{1 , 2 , 3} weit verbreitet sind. Insbesondere wird das genomweite Profil der Acetylierung von Histon H3-Lysin 27 (H3K27ac) üblicherweise zur Definition von aktiven Promotoren, Enhancern und Super-Enhancern ^{4 , 5 , 6} verwendet.

Moloney murine Leukämie-Virus (MLV) ist ein Gamma-Retrovirus, das weit verbreitet für Gen verwendet wirdTransfer in Säugetierzellen. Nach der Infektion einer Zielzelle wird das retrovirale RNA-Genom in einem doppelsträngigen DNA-Molekül retro-transkribiert, das virale und zelluläre Proteine ​​bindet, um den Vorintegrationskomplex (PIC) zu bilden. Der PIC tritt in den Kern ein und bindet das Wirtszellchromatin. Hier vermittelt die virale Integrase, eine Schlüssel-PIC-Komponente, die Integration der proviralen DNA in das Wirtszellgenom. Die mLV-Integration in die genomische DNA ist nicht zufällig, sondern tritt in aktiven cis-regulatorischen Elementen wie Promotoren und Enhancern in zellspezifischer Weise ^{7 , 8 , 9 , 10 auf} . Dieses eigenartige Integrationsprofil wird durch eine direkte Wechselwirkung zwischen der mLV-Integrase und den zellulären Bromodomain- und extraterminalen Domänen (BET) -Proteinen ^{11 , 12 , 13} vermittelt. BET - Proteine ​​(BRD2, BRD3 undBRD4) als Brücke zwischen Wirtschromatin und mLV PIC: Durch ihre Bromodomänen erkennen sie hoch acetylierte cis-regulatorische Regionen, während die extraterminalen Domäne mit der mLV-Integrase ^{11 , 12 , 13} wechselwirkt.

Hier beschreiben wir das retrovirale Scannen, ein neuartiges Werkzeug, um aktive cis-regulatorische Regionen auf der Basis der Integrationseigenschaften von mLV abzubilden. Kurz gesagt werden die Zellen mit einem mLV-abgeleiteten retroviralen Vektor transduziert, der das verstärkte rekonstruierte Gen (EGFP) -Reporter-Gen des grünen fluoreszierenden Proteins exprimiert. Nach der genomischen DNA-Extraktion werden die Übergänge zwischen der 3'-langen terminalen Wiederholung (LTR) des mLV-Vektors und der genomischen DNA durch Linker-vermittelte PCR (LM-PCR) amplifiziert und massiv sequenziert. MLV-Integrationsstandorte werden dem menschlichen Genom zugeordnet, und genomische Regionen, die stark von mLV gezielt sind, werden als Cluster von mLV-Integrationsstellen definiert.

Retroviraler ScanNing wurde verwendet, um zellspezifische aktive regulatorische Elemente in mehreren menschlichen Primärzellen ^{14 , 15 zu} definieren. MLV-Cluster, die mit epigenetisch definierten Promotoren und Enhancern co-mapped waren, von denen die meisten aktive Histonmarken wie H3K27ac enthielten und zellspezifisch waren. Das retrovirale Scannen ermöglicht die genomweite Identifizierung von DNA-regulatorischen Elementen in prospektiv gereinigten Zellpopulationen ^{7 , 14} sowie in retrospektiv definierten Zellpopulationen wie Keratinozyten-Stammzellen, die keine wirksamen Marker für die prospektive Isolation fehlen ¹⁵ .

Protokoll

1. MLV-Transduktion von menschlichen Zellen

1. Isolieren Sie die Zielzellen und transduzieren sie mit einem mVV-abgeleiteten retroviralen Vektor, der das eGFP-Reportergen beherbergt und mit dem vesikulären Stomatitisvirus G (VSV-G) oder dem amphotropen Hüllglykoprotein ¹⁶ pseudotypisiert ist.
   1. Halten Sie mock-transduzierte Zellen als Negativkontrolle für die folgenden Analysen. Da mVV-basierte retrovirale Vektoren effizient transduzierende Zellen transduzieren können, Kultur die Zielzellpopulation unter Bedingungen, die die Zellteilung stimulieren. Die Transduktionsbedingungen müssen für jeden untersuchten Zelltyp spezifisch optimiert werden. Zellwachstum und Transduktionsbedingungen für menschliche hämatopoetische Vorläufer, T-Zellen und epidermale Zellen sind in den Literaturstellen 7, 14, 15 und 17 beschrieben.
2. 48 h nach der Transduktion werden 100.000 Zellen in 300 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 2% fötalem Rinderserum resuspendiert und die eGFP-Expression mit f gemessenNiedrige zytometrische Analyse (488-nm-Anregungslaser). Verwenden Sie mock-transduzierte Zellen als Negativkontrolle. Zur optimalen Integrationsstelle retrieval, reinigen Sie GFP ⁺ -Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS).
3. Sammeln Sie 0,5 bis 5 Millionen Zellen für die genomische DNA-Präparation. Eine längere Kulturperiode (> 7 Tage) wird bevorzugt, um das unintegrierte Provirus zu verdünnen und notwendig, wenn man die Langzeit-Nachkommenschaft von bona fide Stammzellen analysiert (siehe Diskussionsteil und Referenz ¹⁵ ). Die Zellpellets können bei -80 ° C bis zur Verwendung eingefroren und gelagert werden.

2. Amplifikation von mLV-Integrationsstellen durch Linker-vermittelte PCR (LM-PCR)

1. Vorbereitung der genomischen DNA (gDNA)
   1. Extrahieren von gDNA unter Verwendung eines säulenbasierten DNA-Extraktionskits und folgen dem Protokoll für kultivierte Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Restriktionsenzym Digestiauf
   1. Richten Sie 4 Restriktionsenzymverdauungen pro Probe in 1,5 ml Röhrchen ein. Digest 0,1 bis 1 μg gDNA in jedem Röhrchen durch Zugabe von 1 μl Tru9I (10U) und 1 μl Puffer M in einem Endvolumen von 10 μl. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 65 ° C für 6 h oder über Nacht.
   2. Zu jeder Reaktion werden 1 μl PstI (10U), 1 μl Puffer H und 8 μl Wasser gegeben. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 ° C für 6 h oder über Nacht. Proben können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
3. Linker ligation
   1. Vorbereitung einer 100 & mgr; M Tru9I-Linker-Stammlösung in einem 1,5 ml-Röhrchen durch Mischen der Linker plus Strang- und Linker-Minus-Strang-Oligonukleotide bei einer Konzentration von 100 & mgr; M. Setzen Sie das Röhrchen in ein Wasser auf 100 ° C und lassen Sie es bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Tru9I Linker-Stammlösung kann bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
   2. Richten Sie 8 Linker Ligationsreaktionen in 1,5 ml Röhrchen ein. Fügen Sie für jede Reaktion die folgende Komponente hinzuS bis 10 μl Restriktionsenzymverdauung: 1,4 μl 10X T4 DNA Ligase Reaction Puffer, 1 μl 10 μM Linker Tru9I, 1 μL (2.000U) T4 DNA Ligase und 0,6 μl Wasser. Inkubieren bei 16 ° C für 3 bis 6 h. Proben können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
4. Erste PCR
   1. Stellen Sie 48 PCR-Reaktionen (6 Reaktionen von jedem Ligaturrohr) in 0,2 ml Röhrchen auf. Für jede PCR fügen Sie die folgenden Reagenzien zu 2 μl Ligationsreaktion hinzu: 5 μl 10X PCR Puffer, 2 μl 50 mM Magnesiumsulfat, 1 μl 10 mM Desoxynukleotid (dNTP) Mix, 1 μl 10 μM Linker Primer, 1 & Mgr; l 10 & mgr; M mLV-3 'LTR-Primer, 0,3 & mgr; l (1,5 U) Taq-DNA-Polymerase und 37,7 & mgr; l Wasser. Primer-Sequenzen sind in Tabelle 1 angegeben.
   2. Die PCR-Reaktion in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel wie folgt durchführen: 95 ° C für 2 min; 25 Zyklen von 95 ° C für 15 s, 55 ° C für 30 s, 72 ° C für 1 min; 72 °C für 5 min; Bei 4 ° C halten. Proben können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
5. Zweite PCR
   1. Stellen Sie 48 PCR-Reaktionen (1 von jedem "ersten PCR" -Rohr) in 0,2 ml Röhrchen auf. Für jede PCR fügen Sie die folgenden Komponenten zu 2 μl der ersten PCR-Reaktion hinzu: 5 μl 10X PCR-Puffer, 2 μl 50 mM Magnesiumsulfat, 1 μl 10 mM dNTP Mix, 1 μl 10 μM Linker verschachtelter Primer, 1 & Mgr; l 10 & mgr; M mLV-3 'LTR-verschachtelter Primer, 0,3 & mgr; l Taq-DNA-Polymerase (1,5 U) und 37,7 & mgr; l Wasser. Verwenden Sie verschachtelte Primer, die für die gewählte massive Sequenzierungsstrategie entwickelt wurden: (i) Linker verschachtelte Primer und mLV-3 'LTR verschachtelte Primer kompatibel mit Illumina Plattform; (Ii) Linker verschachtelte Primer und mLV-3 'LTR verschachtelte Primer kompatibel mit Roche-Plattform. Primer-Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgelistet.
   2. Die PCR-Reaktion in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel wie folgt durchführen: 95 ° C für 2 min; 25Zyklen von 95 ° C für 15 s, 58 ° C für 30 s, 72 ° C für 1 min; 72 ° C für 5 min; Bei 4 ° C halten. Proben können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
   3. Beide die 48 verschachtelten PCR-Reaktionen in einem 15-ml-Röhrchen (Endvolumen von ~ 2,4 ml). Proben können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
6. Bestimmen Sie die Anwesenheit und die Größe der LM-PCR-Produkte durch Agarose-Gelelektrophorese.
   1. Man gibt 4 μl Ladepuffer auf 20 μl LM-PCR-Produkte und beladen die Probe auf ein 1% Agarosegel zusammen mit einer 100 bp DNA Leiter. Führen Sie das Gel bei 5 V / cm für 30 bis 60 min und visualisieren Sie die PCR-Produkte durch Ethidiumbromid-Färbung.
   2. Führen Sie eine LM-PCR-Reaktion aus der mock-transduzierten Probe als Negativkontrolle aus.
7. Die Amplifikate durch Zugabe von 0,1 Volumina Natriumacetatlösung (3 M, pH 5,2) und 2,5 Volumina 100% igem Ethanol abfließen lassen. Mischen und Einfrieren bei -80 ° C für 20 min.
   1. Spin bei fuGeschwindigkeit in einer Standard-Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 20 min. Den Überstand verwerfen und das Pellet mit 70% Ethanol waschen. Mit hoher Geschwindigkeit in einer Standard-Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 5 min drehen.
   2. Den Überstand verwerfen und das Pellet an der Luft trocknen. 200 μl PCR-Wasser geben und die DNA resuspendieren. Proben können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
8. Füge 20 μl Ladepuffer auf 100 μl der LM-PCR-Produkte hinzu und lade die Probe auf ein 1% Agarosegel zusammen mit einer 100 bp DNA Leiter.
   1. Führen Sie das Gel bei 5 V / cm für 30 bis 60 min und schneiden Sie den Teil des Gels mit 150 bis 500 bp-langen Ampullen.
   2. Reinigen Sie die LM-PCR-Produkte mit einem säulenbasierten Gel-Extraktionskit und messen Sie die Konzentration mit einem UV-Spektrophotometer.
9. Verwenden Sie 1 μl Bibliothek, um die Länge der LM-PCR-Produkte mit einem Bioanalyzer-Instrument nach den Anweisungen des Herstellers zu bewerten.
10. Schrotflinte Klonen von Ampullen
    1. Verwenden Sie 20 ng der gereinigten LM-PCR-Produkte und klonen sie im pCR2.1-TOPO-Vektor gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    2. Führen Sie Sequenzierungsreaktionen mit dem M13 Universal-Primer durch, gefolgt von einer genomischen Kartierung der resultierenden Sequenzen, um die Anwesenheit der Virus-Genom-Übergänge (einschließlich des mLV-3 'LTR-verschachtelten Primers) in> 50% der Klone zu identifizieren, um die geeigneten Proben zu identifizieren Für massive sequenzierung. Beispiel einer Virus-Genom-Kreuzung:
       
       MLV-3 'LTR verschachtelte Primer 454 und Linker verschachtelte Primer 454 ( Tabelle 1 ) sind fett markiert und das 3'-Ende des viralen LTR kursiv. Die menschliche genomische Sequenz wird im roten Text hervorgehoben (chr10: 6439408-6439509, hg19).

3. Massive Sequenzierung von mLV Integration Sites

HINWEIS: LM-PCR prodKönnen mit kommerziellen Plattformen sequenziert werden (Auswahl des richtigen verschachtelten Primerpaares in der zweiten PCR-Reaktion, siehe Abschnitt 2.5.1). Zur Sequenzierung der Roche GS-FLX Pyrosequenzierungsplattform siehe vorherige Papiere ^{7 , 14 , 15} . In diesem Abschnitt wird ein neu optimiertes Protokoll für die Illumina-Sequenzplattform beschrieben.

1. Bibliotheksvorbereitung
   1. Stellen Sie 1 Indexing PCR Reaktion pro Probe in 0,2 ml Röhrchen ein. Für jede PCR fügen Sie die folgenden Reagenzien zu 5 μl (150-170 ng) gereinigtem LM-PCR-Produkt hinzu: 5 μl Index Primer 1, 5 μl Index Primer 2, 25 μl 2X Master Mix und 10 μl PCR- Klasse Wasser. Verwenden Sie für jede Probe eine andere Indexkombination.
   2. Durchführen von PCR-Reaktionen in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel wie folgt: 95 ° C für 3 min; 8 Zyklen von 95 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 s, 72 ° C für 30 s; 72 ° C für 5 mim; Bei 4 ° C halten.
   3. Reinigen Sie die PCR-Produkte mit einem Festphasen-Reversible Immobilisierungsprotokoll (SPRI) -Wulst-Isolationsprotokoll: In neuen 1,5-ml-Röhrchen werden 56 μl Perlen zu jeder Probe gegeben und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Eluieren in 25 & mgr; l Tris-HCl 10 mM. Bibliotheken können bei -20 ° C bis zum Gebrauch gelagert werden.
2. Bibliotheksprüfung
   1. Verwenden Sie 1 μl Probe, um die Bibliotheksgröße mit einem Bioanalyzer-Instrument zu beurteilen.
   2. Verwenden Sie 1 & mgr; l Probe, um die Bibliotheksmolarität unter Verwendung eines Fluoreszenz-basierten Echtzeit-PCR-Tests gemäß den Anweisungen des Herstellers zu quantifizieren.
3. Bibliotheksverdünnung und Sequenzierung
   1. Verdünnen Sie Bibliotheken auf 10 nM mit Tris-HCl 10 mM. Zur Bündelung von Bibliotheken werden 5 μl jeder verdünnten Bibliothek in ein neues 1,5 mL Röhrchen gegeben und dann den Pool auf 4 nM in Tris-HCl 10 mM verdünnt.
   2. Mischen Sie 5 μl verdünntes Pool mit 5 μl 0,2 N NaOH in einer neuen 1,5 mL-Röhrchen, kurz vorspülen, abschleudern und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, um die Bibliotheken zu denaturieren.
   3. Die Röhrchen auf Eis geben und 990 μl vorgekühlter Hybridisierungspuffer (HT1) zugeben. Aliquotieren Sie 300 & mgr; l denaturierten Pool in einem neuen 1,5 ml-Röhrchen und fügen Sie 300 & mgr; l vorgekühltes HT1 hinzu, um ein 10 pF-Endbibliothekspool zu erhalten.
   4. Parallel dazu werden 2 μl PhiX-Kontrollbibliothek (10 nM) mit 3 μl Tris-HCl 10 mM in einem 1,5 mL-Röhrchen vermischt. 5 μl NaOH 0,2 N zugeben, kurz vorspülen, abschleudern und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, um das verdünnte PhiX zu denaturieren. Setzen Sie das Röhrchen auf Eis und fügen Sie 990 μl vorgekühltes HT1 hinzu.
   5. Aliquotieren Sie 300 & mgr; l denaturierten PhiX in einem neuen 1,5 ml-Röhrchen und fügen Sie 300 & mgr; l vorkühlendes HT & sub1; hinzu, um ein 10 pM EndphiX zu erhalten.
   6. In einem neuen 1,5-ml-Röhrchen werden 510 μl denaturierter Bibliothekspool mit 90 μl denaturierter PhiX-Bibliothek vermischt und damit ein endgültiges 10 pM-Pool mit 15% PhiX-Kontrolle erhalten.
   7. Pipettieren Sie diese 600 μl ProbeVolumen in das Load Sample Reservoir der aufgetauten Sequenzreagenzkartusche ein und fährt sofort fort, um einen einmal gelesenen 150-Zyklus-Lauf durchzuführen.
      HINWEIS: Die für dieses Protokoll benötigten kritischen Reagenzien und Primer-Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgelistet.

Ergebnisse

Arbeitsablauf des retroviralen Scanvorgangs

Der Arbeitsablauf des retroviralen Abtastvorgangs ist in Abbildung 1 schematisiert. Die Zielzellpopulation wird gereinigt und mit einem mLV-abgeleiteten retroviralen Vektor transduziert, der ein eGFP-Reportergen exprimiert. Das Transgen wird von den beiden identischen langen terminalen Wiederholungen (5 'und 3' LTR) flankiert, was die Synthese, die ...

Diskussion

Hier haben wir ein Protokoll zur genomweiten Kartierung der Integrationsstellen von mLV beschrieben, ein Retrovirus, das Chromatinregionen anspricht, epigenetisch als aktive Promotoren und Enhancer markiert. Kritische Schritte und / oder Einschränkungen des Protokolls umfassen: (i) mLV-Transduktion der Zielzellpopulation; (Ii) Amplifikation von Virus-Host-Übergängen durch LM-PCR; (Iii) Abrufen eines hohen Anteils an Integrationsstellen. MLV-basierte retrovirale Vektoren effizient transduzierende Zellen. Die geringe E...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS, pH 7.4	ThermoScientific	10010031	or equivalent
Fetal Bovine Serum	ThermoScientific	16000044	or equivalent
0.2 ml tubes	general lab supplier
1.5 ml tubes	general lab supplier
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit	QIAGEN	51306	or equivalent
T4 DNA ligase	New England BioLabs	M0202T
T4 DNA Ligase Reaction buffer	New England BioLabs	M0202T
Linker Plus Strand oligonucleotide	general lab supplier		5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’  (Purification grade: SDS-PAGE)
Linker Minus Strand oligonucleotide	general lab supplier		5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE)
Tru9I	Roche-Sigma-Aldrich	11464825001
SuRE/Cut Buffer M	Roche-Sigma-Aldrich	11417983001
PstI	Roche-Sigma-Aldrich	10798991001
SuRE/Cut Buffer H	Roche-Sigma-Aldrich	11417991001
Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity	Invitrogen	11304011
10 mM dNTP Mix	Invitrogen	18427013	or equivalent
PCR grade water	general lab supplier
96-well thermal cycler (with heated lid)	general lab supplier
linker primer	general lab supplier		5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade)
MLV-3’ LTR primer	general lab supplier		5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade)
linker nested primer 454	general lab supplier		5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer 454	general lab supplier		5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
linker nested primer Illumina	general lab supplier		5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer Illumina	general lab supplier		5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2	general lab supplier
Ethanol (absolute) for molecular biology	Sigma-Aldrich	E7023	or equivalent
Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector)	Invitrogen	K4500-01
QIAquick Gel Extraction kit	QIAGEN	28704
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	or equivalent
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	or equivalent
100 bp DNA ladder	Invitrogen	15628019	or equivalent
6x Loading Buffer	ThermoScientific	R0611	or equivalent
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	ThermoScientific	ND-2000
Nextera XT Index kit	Illumina	FC-131-1001 or FC-131-1002
2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix	KAPA Biosystems	KK2601
Dynal magnetic stand for 2 ml tubes	Invitrogen	12321D	or equivalent
Agencourt AMPure XP 60 ml kit	Beckman Coulter Genomics	A63881
Tris-HCl 10 mM, pH 8.5	general lab supplier
Agilent 2200 TapeStation system	Agilent Technologies	G2964AA	or equivalent
D1000 ScreenTape	Agilent Technologies	5067-5582	or equivalent
D1000 Reagents	Agilent Technologies	5067-5583	or equivalent
KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism)	KAPA Biosystems	KK4835
ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4329003
NaOH 1.0 N, molecular biology-grade	general lab supplier
HT1 (Hybridization Buffer)	Illumina	Provided in the MiSeq Reagent Kit
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles)	Illumina	MS-102-3001
MiSeq System	Illumina	SY-410-1003
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001