脐带血诱导的多能干细胞的软骨形成颗粒形成

摘要

在这里，我们提出了一种软骨细胞分化从脐带血单核细胞衍生的人诱导多能干细胞的方案。

摘要

人关节软骨缺乏修复能力。因此软骨变性不是通过治疗而是通过保守治疗来治疗。目前，正在努力用离体扩增的软骨细胞或骨髓间充质干细胞（BMSCs）再生损伤的软骨。然而，这些细胞的有限生存力和不稳定性限制了其在软骨重建中的应用。人类诱导的多能干细胞（hiPSCs）作为再生应用的新替代品已经受到科学的关注。具有无限自我更新能力和多功能性，hiPSC已被强调为软骨修复的新替代细胞来源。然而，获得高质量的软骨细胞颗粒是其临床应用的主要挑战。在本研究中，我们使用胚状体（EB）衍生的生长细胞进行软骨形成分化。通过PCR确认成功的软骨形成d染色阿片蓝，甲苯胺蓝和针对I型和II型胶原的抗体（分别为COL1A1和COL2A1）。我们提供了将脐带血单核细胞衍生的iPSC（CBMC-hiPSC）分化成软骨形成颗粒的详细方法。

引言

hiPSCs的使用代表了各种疾病的药物筛选和机械研究的新策略。从再生的角度来看，hiPSC也是替代受损组织的潜在来源，其受损愈合能力有限，如关节软骨^1,2 。

天然关节软骨的再生是数十年来的挑战。关节软骨是一种柔软的白色组织，其覆盖骨骼的末端，保护其免受摩擦。然而，损坏时的再生能力有限，几乎不可能进行自我修复。因此，关注软骨再生的研究已经持续了几十年。

以前，通常使用从膝关节³分离的骨髓基质干细胞或天然软骨细胞进行体外分化成软骨形态谱系。到期o它们的软骨形成潜能，BMSCs和天然软骨细胞具有许多优点，支持它们在软骨形成中的应用。然而，由于它们的扩增和表型不稳定，这些细胞在关节软骨缺损的重建中面临着一些限制。在体外培养条件下，3-4代后，这些细胞往往失去自身特征，最终影响其分化能力。此外，在天然软骨细胞的情况下，当获得这些细胞时，对膝关节的附加损伤是不可避免的。

与BMSCs或天然软骨细胞不同，hiPSC可以在体外无限扩张。在适当的培养条件下，hiPSC作为软骨形成分化的替代来源具有巨大的潜力。然而，改变hiPSC的固有特性是很困难的。此外，它需要几个复杂的体外 steps将hiPSC的命运指向特定的单元格类型。尽管出现这些并发症，仍然推荐使用hiPSC，因为它们具有较高的自我更新能力及其分化成靶细胞的能力，包括软骨细胞⁶ 。

软骨形成分化通常使用三维培养系统进行，例如使用MSC样祖细胞的沉淀培养或微粒培养。如果使用hiPSC，生成MSC样祖细胞的方案与现有协议不同。一些群体使用hiPSC的单层培养物将表型直接转化为MSC样细胞⁷ 。然而，大多数研究使用EBs产生类似MSCs 8,9,10,11的生长细胞。

使用各种类型的生长因子诱导软骨NESIS。通常，单独或组合使用BMP和TGFβ家族蛋白。其他因素，如GDF5，FGF2和IGF1都有诱导分化12,13,14,15。已经显示TGFβ1在MSCs ¹⁶中以剂量依赖的方式刺激软骨形成。与其他同种型相比，TGFβ3，TGFβ1通过增加前软骨间充质细胞的冷凝来诱导软骨形成.TGFβ3通过显着增加间充质细胞增殖而诱导软骨形成。然而，TGFβ3比TGFβ17,10,18,19更频繁地被研究人员使用。 BMP2增强人类软骨形成基质成分相关基因的表达体外条件下关节软骨细胞 ²⁰ 。 BMP2增加了与TGFβ蛋白²¹结合的MSC中软骨形成至关重要的基因表达。还已经显示BMP2通过Smad和MAPK途径协同增强TGFβ3的作用²² 。

在本研究中，CBMC-hiPSC在低附着培养皿中使用EB培养基聚集成EB。通过将EB附着到明胶包被的培养皿中诱导生长细胞。使用生长细胞进行软骨形成分化。用BMP2和TGFβ3处理成功地浓缩细胞并诱导细胞外基质（ECM）蛋白质积累，用于软骨形成颗粒形成。本研究提出使用CBMC-hiPSCs的简单而有效的软骨形成分化方案。

研究方案

该协议由韩国天主教大学机构审查委员会批准（KC12TISI0861）。用于重新编程的CBMC直接从首尔圣玛丽医院的脐血库获得。

来自iPSCs的软骨形成分化

1. CBMC-iPSC一代
   1. 使用我们以前的工作²³所示的协议生成CBMC-hiPSC。
   2. 将血细胞收集在15 mL锥形管中，并使用血细胞计数器进行计数。
   3. 准备3×10 ^5个细胞，并在515×g和RT下离心5分钟。通过抽吸弃去上清液，并将细胞重新悬浮于0.5mL血细胞培养基中。
   4. 将细胞转移到未包被的24孔板的孔中，并按照制造商的建议添加仙台病毒混合物。
   5. 在1150 xg和30℃下将板离心30分钟。
   6. 前前后后离心，将细胞在37℃，5％CO ₂中孵育过夜（O / N）。
   7. 第二天，将转导的细胞转移到基质涂层的孔中。在30℃下以1,150×g离心板30分钟。
   8. 离心后，取出上清液，加入1mL iPSC培养基，并将细胞O / N在37℃下保持在5％CO _2中 。
   9. 在37℃和5％CO ₂下保持连接的细胞。每天更换培养基，用新鲜的iPSC培养基更换培养基。
      注意:殖民地将在转导后第14-21天出现。
2. EB一代
   1. 在37℃和5％CO ₂下保持hiPSC。每天更换培养基，用新鲜的Essential 8（E8）培养基代替。
   2. 在E8培养基中的玻连蛋白包被的100毫米皿中制备2×10 ⁶个hiPSC。
   3. 从培养皿中取出E8培养基，用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤。
   4. 添加1mL的1mM乙二胺四乙酸（EDTA），并在37℃和5％CO ₂下孵育2分钟。
   5. 用3mL E8培养基收获细胞并将其转移到新的15-mL锥形管中。在250×g室温（RT）下将细胞离心2分钟。
   6. 吸出上清液而不干扰细胞沉淀，并将细胞重悬于5mL E8培养基中。
   7. 使用血细胞计数器计数细胞，并为每100 mm培养皿制备2×10 ^6个细胞。将制备的细胞重悬于10μME8和EB培养基（1:1）与10μMrho相关激酶（ROCK）抑制剂的混合物中。
   8. 孵育细胞O / N用于在37℃和5％CO ₂下聚集。
   9. 在第二天，通过吸移收集聚集的EB。以250 xg离心细胞1分钟。去除上清液并将EB重悬于10mL新鲜E8培养基中。
   10. 将生成的EB放大5天，每日更换一次h E8中等。为了进一步成熟，将培养基更换为E7培养基。将EB保持在37℃和5％CO ₂另外5天，用新鲜E7培养基进行每日中等变化。
       注意:E7培养基是不含FGF2的E8培养基。
3. 来自EBs的生长细胞诱导
   1. 加入6 mL 1％明胶至100 mm培养皿，37℃和5％CO ₂孵育30分钟。
   2. 取出明胶，然后将其完全干燥2-3小时，然后再使用。
   3. 将EB转移到50mL锥形管中。允许EB沉降到锥形管的底部。去除上清液而不干扰EBs。
   4. 将EB重悬于10mL含有20％胎牛血清（FBS）的Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）中。将EB转移到明胶包被的100毫米的盘子上。加入10μMROCK抑制剂。
   5. 孵育并保持细胞在37℃和5％CO ₂ 7天。改变主题每隔一天进行一次，不添加ROCK抑制剂。
4. 软骨形成颗粒形成
   1. 从培养皿中吸取培养基，用PBS洗涤细胞三次。
   2. 应用1mL的1mM EDTA，并在37℃和5％CO ₂下孵育2分钟。
   3. 使用5 mL含20％FBS的DMEM收获细胞，并将其转移到新的15 mL锥形管中。
   4. 以250×g和RT离心细胞2分钟。丢弃上清液并将沉淀重悬于10mL含有20％FBS的DMEM中。
   5. 使用40μm的细胞过滤器过滤和丢弃细胞团，并收获单个细胞。使用血细胞计数器计数单细胞。
   6. 以250×g和RT离心细胞2分钟。取出上清液，每粒沉淀在带有300μL软骨形成分化培养基（CDM）的15mL锥形管中种子3×10 ^5个细胞。
   7. 对于沉淀物形成，将细胞离心5分钟680 xg和RT。
      注意:在软骨形成颗粒的分化期间，颗粒保持在15mL锥形管中。
   8. 在37℃和5％CO ₂下孵育细胞过夜。
   9. 每2-3天更换一次CDM。 3天内，颗粒呈现扁平的球形形态。在37℃和5％CO ₂下保持颗粒21天。

2.染色体软骨细胞表征

1. 软骨形成嵌入
   1. 在包埋之前，在58℃制备和熔融石蜡。
   2. 将小丸固定在1mL的4％多聚甲醛中，在室温下在1.5mL管中固定2小时。
      注意:多聚甲醛是剧毒的。避免接触眼睛，皮肤或粘膜。尽量减少暴露并避免吸入，同时准备。
   3. 将一层纱布放在盒上，并使用移液管转移固定的颗粒。通过折叠覆盖颗粒请将纱布盖好并关上盒盖。
   4. 在100ml 70％乙醇（EtOH）中开始脱水两次，每次10分钟。通过在80％和95％EtOH中连续10分钟洗涤来使沉淀物脱水。
   5. 将颗粒转移到100％乙醇中10分钟。用新鲜的EtOH重复三次。
   6. 对于"清除"，将溶液与EtOH和二甲苯的100mL 1:1:1混合物，然后用1:2的EtOH和二甲苯混合物交换10分钟。通过在100％二甲苯中孵育两次，每次10分钟，清除剩余的EtOH。
   7. 对于石蜡浸润，将颗粒在连续的二甲苯和石蜡混合物中孵育。在58°C进行整个石蜡浸润过程。将颗粒在100ml二甲苯和石蜡的2:1混合物中孵育30分钟。
   8. 将溶液换成100ml 1:1的二甲苯和石蜡混合物，并孵育30分钟。
   9. 将溶液换成100mL的二甲苯和石蜡混合物，并孵育3次0分钟
   10. 为了最终的渗透，将颗粒转移到100％石蜡的第一浴中并孵育2小时。
   11. 将颗粒转移到100％石蜡的第二浴中，并在58℃下孵育O / N。
   12. 第二天，使用镊子轻轻地将颗粒转移到模具上。从石蜡分离器中将石蜡加入到模具中。在4℃下固化石蜡30分钟。
   13. 将部分切割成7μm，并将部分转移到载玻片上。让幻灯片干燥过夜，并将载玻片存放在RT中，直到它们准备使用。
2. 幻灯片准备
   1. 通过将100 mL，100％，90％，80％和70％EtOH依次移动5 min，使载玻片脱蜡。
   2. 将载玻片放在玻璃瓶中，用自来水冲洗5分钟。
3. 阿蓝染色
   1. 将载玻片在50mL的1％阿尔卑斯蓝溶液中孵育30分钟。
      不E:将Alcian蓝在3％乙酸溶液中稀释。使用乙酸将pH调节至2.5。
   2. 将载玻片放在玻璃瓶中，用自来水冲洗2分钟。
   3. 用去离子水（DW）冲洗载玻片并用核快速红色溶液复染2分钟。
   4. 将载玻片放在玻璃瓶中，用自来水冲洗1分钟。
   5. 2.3.5）在步骤2.6中进行脱水和安装幻灯片。
4. 甲苯胺蓝染色
   1. 将载玻片在50mL甲苯胺蓝溶液中孵育4分钟。
   2. 将载玻片放在玻璃瓶中，用自来水冲洗5分钟。
   3. 在步骤2.6中继续脱水并安装幻灯片。
5. 免疫组织化学染色
   1. 在3％H ₂ O ₂中孵育载玻片15分钟用于内源性过氧化物酶阻断。
   2. 应用200μl在tris-bu中以1:100稀释的一抗（COL1A1和-COL2A1抗体）将含有1％牛血清白蛋白（BSA）和5％正常山羊血清（NGS）的盐水（TBS）置于载玻片上并在4℃下孵育O / N。
   3. 第二天将载玻片置于玻璃瓶中，用含有0.1％聚山梨酯20（TBST）的TBS洗涤三次，每次5分钟。
   4. 将200μL二抗（山羊抗兔IgG抗体，在含有1％BSA和5％NGS的TBS中1:200稀释）稀释至载玻片中并在室温下孵育40分钟。
   5. 将载玻片放在玻璃瓶中，用50 mL洗涤3次，每次5分钟。
   6. 对于信号扩增，应用HRP-偶联物链亲和素溶液至载玻片并孵育10分钟。
   7. 将载玻片放在玻璃瓶中，用50 mL洗涤3次，每次5分钟。
   8. 混合DAB-过氧化物酶底物溶液，每个载玻片应用200μL溶液，孵育1分钟。
   9. 将载玻片放在玻璃瓶中，用自来水冲洗5分钟。
   10. 染液用Mayer's苏木精处理1分钟。
   11. 用DW清洗幻灯片。
   12. 在步骤2.6中继续脱水并安装幻灯片。
6. 脱水和安装
   1. 通过将它们依次移动通过100mL的70％，80％，90％和100％EtOH，每次30s，使载玻片脱水。
   2. 将载玻片浸入两个二甲苯变化中，每次1分钟。
   3. 在盖玻片上加入50μL安装溶液，并将幻灯片放在顶部。

结果

在本研究中，我们通过从EBs诱导生长细胞，从CBMC-hiPSC产生软骨细胞团。使用具有确认的高多能性的CBMC-hiPSC诱导软骨形成分化¹¹ 。我们的协议的简单方案如图1A所示 。在分化前，iPSC菌落扩大（ 图1B ）。扩展的iPSC被组装为EB以启动分化（ 图1C ）。将生成的EB连接到明胶包被的培养皿以诱导...

讨论

该协议成功地从CBMCs生成了hiPSC。我们使用含有山中因素的仙台病毒载体²⁴重新编程CBMCs到hiPSC。分化使用3例，所有实验均使用该方案成功生成软骨细胞团。许多研究报道了hiPSC分化为软骨细胞25,26,27,28的方案。然而，需要进一步的研究来确认使用CBMC-hiPSCs作为软骨再生和恢复的候选者。

使用由各种体细胞类型11,25,26,27,29产生的hiPSC证实软骨形成。许多报告显示?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
Name	Company	Catalog Number	Description
E8 Medium Materials
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	E8 Medium (500 mL)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	E8 Medium  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	E8 Medium  (Conc.: 100 ng/mL)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	E8 Medium  (Conc.: 64 μg/mL)
DPBS	Life Technologies	14190-144
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Name	Company	Catalog Number	Description
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-Collagen II antibody	abcam	ab34712	1:100
Alcian blue	Sigma Aldrich	A3157-10G
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252-25G
Safranin O	Sigma Aldrich	090m0039v
Nuclear fast red	Americanmastertech	STNFR100
xylene	Duksan	115
Ethanol	Duksan	64-17-5
Mayer's hematoxylin solution	wako pure chemical industries	LAK7534
DAP	VECTOR LABORATORIES	SK-4100
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
Name	Company	Catalog Number	Description
Chondrogenic Differentiation Materials
DMEM	Life Technologies	11885	Chondrogenic media component (500 mL)
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050	Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2	R&D	355-BM-050	Chondrogenic media component (Conc.:100 ng/ml)
Recombinant Hman TGF-beta3	R&D	243-B3-002	Chondrogenic media component (Conc.:10 ng/ml)
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
ITS+ Premix	BD	354352	Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
Dexamethasone-Water Soluble	Sigma Aldrich	D2915-100MG	Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M)
GlutaMAX Supplement	Life Technologies	35050-061	Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
Sodium pyruvate solution	Sigma Aldrich	S8636	Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
L-Proline	Sigma Aldrich	P5607-25G	Chondrogenic media component (40 μg/ml)