Formation de granulés chondrogéniques à partir de cellules souches pluripotentes induites par sang de cordon

Résumé

Ici, nous proposons un protocole pour la différenciation chondrogénique des cellules souches pluripotentes induites par les cellules mononucléaires du sang du cordon de l'omble.

Résumé

Le cartilage articulaire humain n'a pas la capacité de se réparer. La dégénérescence du cartilage est donc traitée non par traitement curatif mais par des traitements conservateurs. Actuellement, des efforts sont déployés pour régénérer le cartilage endommagé avec des chondrocytes expansés ex vivo ou des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BMSC). Cependant, la viabilité et l'instabilité restreintes de ces cellules limitent leur application dans la reconstruction du cartilage. Les cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) ont reçu l'attention scientifique comme nouvelle alternative pour les applications regénératives. Avec une capacité d'auto-renouvellement illimitée et multipotence, les hiPSC ont été mis en évidence comme une nouvelle source de cellules de remplacement pour la réparation du cartilage. Cependant, l'obtention d'une quantité élevée de granulés chondrogéniques de haute qualité est un défi majeur pour leur application clinique. Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules de descendance dérivées du corps embryoïde (EB) pour la différenciation chondrogénique. Une chondrogénèse réussie a été confirmée par PCR etD coloration avec bleu alcian, bleu de toluidine et anticorps contre les collagènes types I et II (COL1A1 et COL2A1, respectivement). Nous fournissons une méthode détaillée pour la différenciation des iPSC à base de cellules mononucléaires du sang du cordon de cordon (CBMC-hiPSC) en pastilles chondrogéniques.

Introduction

L'utilisation de hiPSCs représente une nouvelle stratégie pour le dépistage de drogue et les études mécanistes de diverses maladies. Du point de vue de la régénération, les hiPSC sont également une source potentielle de remplacement des tissus endommagés qui ont une capacité de guérison limitée, comme le cartilage articulaire ^{1 , 2} .

La régénération du cartilage articulaire natif a été un défi depuis plusieurs décennies. Le cartilage articulaire est un tissu doux et blanc qui recouvre la fin des os, les protégeant des frottements. Cependant, il a une capacité de régénération limitée lorsqu'il est endommagé, ce qui rend l'auto-réparation presque impossible. Par conséquent, la recherche axée sur la régénération du cartilage est en cours depuis plusieurs décennies.

Auparavant, la différenciation in vitro dans la lignée chondrogénique était habituellement réalisée avec des BMSC ou des chondrocytes indigènes isolés de l'articulation du genou ³ . Due tO leur potentiel de chondrogenic, BMSC et chondrocytes indigènes ont de nombreux mérites soutenant leur utilisation dans la chondrogénèse. Cependant, en raison de leur expansion limitée et de leur phénotype instable, ces cellules sont confrontées à plusieurs limitations dans la reconstruction des défauts du cartilage articulaire. Dans des conditions de culture in vitro , ces cellules ont tendance à perdre leurs propres caractéristiques après 3 à 4 passages, ce qui finit par affecter leurs capacités de différenciation ⁴ . En outre, dans le cas des chondrocytes indigènes, des dommages supplémentaires à l'articulation du genou sont inévitables lors de l'obtention de ces cellules.

Contrairement aux BMSC ou aux chondrocytes indigènes, les hiPSC peuvent se développer indéfiniment in vitro . Avec les conditions de culture appropriées, les hiPSC ont un grand potentiel en tant que source de remplacement pour la différenciation chondrogénique. Cependant, il est difficile de modifier les caractéristiques intrinsèques des hiPSC ⁵ . En outre, il faut plusieurs essais in vitro compliqués.Ps pour diriger le sort des hiPSC vers un type de cellule spécifique. Malgré ces complications, l'utilisation de hiPSC est toujours recommandée en raison de leur capacité d'auto-renouvellement élevé et de leur capacité à se différencier en cellules ciblées, y compris les chondrocytes ⁶ .

La différenciation chondrogénique est généralement effectuée avec des systèmes de culture tridimensionnels, tels que la culture de pastilles ou la culture de micromasses, en utilisant des cellules progénitrices de type MSC. Si vous utilisez le système HiPSC, le protocole pour générer des cellules progénitrices MSC diffère des protocoles existants. Certains groupes utilisent une culture monocouche de hiPSC pour convertir directement le phénotype en cellules MSC ⁷ . Cependant, la plupart des études utilisent les EB pour générer des cellules secondaires qui ressemblent aux MSC ^{8 , 9 , 10 , 11} .

Différents types de facteurs de croissance sont utilisés pour induire ChondrogeNesis. Habituellement, les protéines de famille BMP et TGFβ sont utilisées, seules ou en combinaison. La différenciation a également été induite avec d'autres facteurs, tels que GDF5, FGF2 et IGF1 ^{12 , 13 , 14 , 15} . On a montré que le TGFß1 stimule la chondrogénèse de manière dose-dépendante dans les MSC ¹⁶ . Par rapport à l'autre isotype, le TGFβ3, le TGFß1 induit une chondrogénèse en augmentant la condensation de la cellule mésenchymateuse pré-cartilagineuse. Le TGFβ3 induit la chondrogénèse en augmentant significativement la prolifération des cellules mésenchymateuses ¹⁷ . Cependant, le TGFβ3 est utilisé plus fréquemment par les chercheurs que TGFβ1 ^{7 , 10 , 18 , 19} . BMP2 améliore l'expression de gènes liés aux composants de la matrice chondrogénique chez l'hommeChondrocytes articulaires dans des conditions in vitro ²⁰ . BMP2 augmente l'expression de gènes critiques pour la formation de cartilage dans les MSC en combinaison avec des protéines TGFβ ²¹ . Il a également été démontré que BMP2 améliore de manière synergique l'effet du TGFβ3 par les voies Smad et MAPK ²² .

Dans cette étude, les CBMC-hiPSC ont été agrégés en EB en utilisant du milieu EB dans une boîte de Petri à faible fixation. Les cellules de dépassement ont été induites en fixant les EB à un plat revêtu de gélatine. La différenciation chondrogénique à l'aide de cellules secondaires a été réalisée par culture de pastilles. Le traitement à la fois avec le BMP2 et le TGFß3 a condensé avec succès les cellules et a induit une accumulation de protéines de la matrice extracellulaire (ECM) pour la formation de granules chondrogéniques. Cette étude suggère un protocole de différenciation chondrogénique simple mais efficace utilisant CBMC-hiPSCs.

Protocole

Ce protocole a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de l'Université catholique de Corée (KC12TISI0861). Les CBMC utilisés pour la reprogrammation ont été obtenus directement de la banque de sang de cordon de l'hôpital St. Mary's de Seoul.

1. Différenciation chondrogénique des iPSC

1. Production CBMC-iPSC
   1. Générer des CBMC-hiPSC en utilisant le protocole montré dans nos travaux antérieurs ²³ .
   2. Recueillir les globules sanguins dans un tube conique de 15 ml et les compter en utilisant un hémocytomètre.
   3. Préparer 3 x 10 ⁵ cellules et centrifuger pendant 5 min à 515 xg et RT. Jeter le surnageant par aspiration et ré-endiguer les cellules dans 0,5 ml de milieu sanguin.
   4. Transférer les cellules dans un puits d'une plaque non-revêtue à 24 puits et ajouter le mélange de virus Sendai, en suivant les recommandations du fabricant.
   5. Centrifuger la plaque pendant 30 min à 1.150 xg et 30 ° C.
   6. En arrièreEr centrifugation, incuber les cellules pendant une nuit (O / N) à 37 ° C dans 5% de CO ₂ .
   7. Le lendemain, transférez les cellules transduites vers un puits revêtu de matrice. Centrifuger la plaque à 1 150 xg pendant 30 min à 30 ° C.
   8. Après centrifugation, éliminer le surnageant, ajouter 1 mL de milieu iPSC et maintenir les cellules O / N à 37 ° C dans 5% de CO ₂ .
   9. Maintenir les cellules attachées à 37 ° C et 5% de CO ₂ . Changez le support tous les jours, en le remplaçant par un support iPSC frais.
      NOTE: Les colonies apparaîtront au jour 14-21 après la transduction.
2. Génération EB
   1. Maintenir les hiPSC à 37 ° C et 5% de CO ₂ . Changez le milieu tous les jours, en le remplaçant par du Essential Essential 8 (E8) moyen.
   2. Préparez 2 x 10 ⁶ hiPSC dans un plat 100 mm en revêtement de vitronectine en milieu E8.
   3. Retirer le milieu E8 du plat de culture et laver avec une solution salée tamponnée au phosphate stérile (PBS).
   4. Ajouter 1Ml d'acide éthylènediaminetétracétique 1 mM (EDTA) et incuber à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 2 min.
   5. Récoltez les cellules avec 3 ml de milieu E8 et transférez-les à un nouveau tube conique de 15 ml. Centrifuger les cellules à 250 xg à température ambiante (RT) pendant 2 min.
   6. Aspirer le surnageant sans perturber le culot cellulaire et ré-endiguer les cellules dans 5 ml de milieu E8.
   7. Comptez les cellules en utilisant un hémocytomètre et préparez 2 x 10 ⁶ cellules pour chaque boîte de Petri de 100 mm. Remettre en suspension les cellules préparées dans un mélange de 10 ml de milieu E8 et EB (1: 1) avec un inhibiteur de la kinase associée au rho 10 μM (ROCK).
   8. Incuber les cellules O / N pour l'agrégation à 37 ° C et 5% de CO ₂ .
   9. Le lendemain, récoltez les EB agrégées par pipettage. Centrifuger les cellules à 250 xg pendant 1 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension les EB dans 10 ml de milieu E8 frais.
   10. Agrandir les EB générés pendant 5 jours, effectuer des changements quotidiens avec fresH E8 moyen. Pour une maturation supplémentaire, changer le milieu de culture en milieu E7. Maintenir les EB à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 5 jours supplémentaires, en effectuant des modifications quotidiennes moyennes avec du moyen E7 frais.
       REMARQUE: Le support E7 est E8 moyen sans FGF2.
3. Induction des cellules de décrochage des EB
   1. Ajouter 6 ml de gélatine à 1% dans un plat 100 mm et incuber à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 30 min.
   2. Retirez la gélatine et séchez complètement le plat pendant 2-3 h avant utilisation.
   3. Transférer les EB à un tube conique de 50 ml. Permettre aux EB de s'installer au bas du tube conique. Retirer le surnageant sans déranger les EB.
   4. Remettre en suspension les EB dans 10 mL de milieu de Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 20% de sérum bovin fœtal (FBS). Transférer les EB sur le plat en gelée et 100 mm. Ajouter 10 μM ROCK inhibiteur.
   5. Incuber et maintenir les cellules à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 7 jours. Change le thèmeTous les deux jours sans addition d'inhibiteur de ROCK.
4. Formation de culot chromatographique
   1. Aspirer le milieu de culture du plat et laver les cellules trois fois avec du PBS.
   2. Appliquer 1 mL d'EDTA 1 mM et incuber à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 2 min.
   3. Récoltez les cellules en utilisant 5 mL de DMEM avec 20% de FBS et transférez-les dans un nouveau tube conique de 15 mL.
   4. Centrifuger les cellules pendant 2 min à 250 xg et RT. Jeter le surnageant et remettre à nouveau le culot dans 10 mL de DMEM avec 20% de FBS.
   5. Filtrer et jeter les grappes cellulaires en utilisant une crépine cellulaire de 40 μm et récolter les cellules individuelles. Comptez les cellules individuelles à l'aide d'un hémocytomètre.
   6. Centrifuger les cellules pendant 2 min à 250 xg et RT. Retirer le surnageant et semer 3 x 10 ⁵ cellules par pellet dans un tube conique de 15 ml avec 300 μL de milieu de différenciation chondrogénique (MDP).
   7. Pour la formation de pastilles, centrifuger les cellules pendant 5 min à680 xg et RT.
      REMARQUE: Les granulés sont maintenus dans des tubes coniques de 15 mL lors de la différenciation des pastilles chondrogéniques.
   8. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO ₂ .
   9. Changez le MDP tous les 2-3 jours. Dans les 3 jours, les granulés présenteront des morphologies sphéroïdales aplaties. Maintenir les pastilles pendant 21 jours à 37 ° C et 5% de CO ₂ .

2. Caractérisation des granulés chondrogéniques par coloration

1. Incorporation chondrogénique
   1. Avant d'incorporer, préparer et faire fondre la paraffine à 58 ° C.
   2. Fixer les pastilles dans 1 mL de paraformaldéhyde à 4% pendant 2 h à la température ambiante dans un tube de 1,5 ml.
      Attention: le paraformaldéhyde est très toxique. Éviter tout contact avec les yeux, la peau ou les muqueuses. Minimiser l'exposition et éviter l'inhalation tout en la préparant.
   3. Placez une couche de gaze sur la cassette et transférez les pastilles fixes à l'aide d'une pipette. Couvrir la pastille en pliantÉgentez et fermez le couvercle de la cassette.
   4. Initier la déshydratation dans 100 ml d'éthanol à 70% (EtOH) deux fois, 10 min chacun. Déhydrate les pastilles à travers des lavages séquentiels de 10 minutes dans 80% et 95% d'EtOH.
   5. Transférer les pastilles à 100% d'EtOH pendant 10 min. Répétez trois fois avec de l'EtOH frais.
   6. Pour "nettoyer", échanger la solution pour un mélange 100 mL, 1: 1 d'EtOH et de xylene, suivi d'un mélange 1: 2 d'EtOH et de xylène pendant 10 minutes chacun. Effacer l'EtOH restant en incubant les pastilles deux fois dans 100% de xylene, 10 min chacun.
   7. Pour l'infiltration de paraffine, incuber les pastilles dans des mélanges de xylène et de paraffine séquentiels. Effectuer l'ensemble du processus d'infiltration de paraffine à 58 ° C. Incuber les pastilles dans 100 ml d'un mélange 2: 1 de xylène et de paraffine pendant 30 minutes.
   8. Échangez la solution pour 100 ml d'un mélange 1: 1 de xylène et de paraffine et incuberez pendant 30 min.
   9. Échangez la solution pour 100 ml d'un mélange 1: 2 de xylène et de paraffine et incuberez pendant 30 min.
   10. Pour l'infiltration finale, transférer les pastilles au premier bain de 100% de paraffine et incuber pendant 2 h.
   11. Transférer les pastilles au deuxième bain de 100% de paraffine et incuber O / N à 58 ° C.
   12. Le lendemain, transférez doucement les pastilles à un moule à l'aide d'une pince. Ajouter de la paraffine au moule du distributeur de paraffine. Solidifier la paraffine pendant 30 min à 4 ° C.
   13. Coupez les sections à 7 μm et transférez les sections sur la glissière. Laissez les diapositives sécher pendant la nuit et rangez les diapositives à la température ambiante jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à l'emploi.
2. Préparation de la diapositive
   1. Déparaffiner les diapositives en les déplaçant à travers 100 mL de 100%, 90%, 80% et 70% d'EtOH séquentiellement pendant 5 min chacun.
   2. Placez les glissières dans un pot en verre et rincez avec de l'eau du robinet pendant 5 min.
3. Coloration bleue Alcian
   1. Incuber les glissières dans 50 ml d'une solution de bleu alice à 1% pendant 30 minutes.
      NE PASE: Le bleu Alcian est dilué dans une solution à 3% d'acide acétique. Ajuster le pH à 2,5 en utilisant de l'acide acétique.
   2. Placez les glissières dans un pot en verre et rincez avec de l'eau du robinet pendant 2 min.
   3. Rincer les lames dans de l'eau déminéralisée (DW) et contraster avec une solution nucléaire rapide et rouge pendant 2 min.
   4. Placez les glissières dans un pot en verre et rincer à l'eau du robinet pendant 1 min.
   5. 2.3.5) Procédez pour déshydrater et montez les diapositives à l'étape 2.6.
4. Teinture de bleu de toluidine
   1. Incuber des lames dans 50 ml de solution de bleu de toluidine pendant 4 min.
   2. Placez les glissières dans un pot en verre et rincez avec de l'eau du robinet pendant 5 min.
   3. Procédez pour déshydrater et montez les diapositives à l'étape 2.6.
5. Coloration immunohistochimique
   1. Incuber les diapositives dans 3% de H ₂ O ₂ pendant 15 minutes pour le blocage de peroxydase endogène.
   2. Appliquer 200 μl d'anticorps primaire (anti-COL1A1 et -COL2A1) dilué 1: 100 en tris-bu(TBS) contenant 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) et 5% de sérum de chèvre normal (NGS) aux lames et incuber à O / N à 4 ° C.
   3. Le lendemain, placez les diapositives dans un pot en verre et lavez-les avec 50 ml de TBS contenant 0,1% de polysorbate 20 (TBST) trois fois pendant 5 min chacun.
   4. Appliquer 200 μl d'anticorps secondaire (anticorps IgG anti-lapin de chèvre, dilué 1: 200 dans du TBS contenant 1% de BSA et 5% de NGS) aux diapositives et incuber à TA pendant 40 min.
   5. Placez les glissières dans un pot en verre et lavez-les trois fois avec 50 mL, 5 minutes chacune.
   6. Pour l'amplification du signal, appliquer une solution de streptavidine conjugue HRP aux lames et incuber pendant 10 min.
   7. Placez les glissières dans un pot en verre et lavez-les trois fois avec 50 mL, 5 minutes chacune.
   8. Mélanger la solution de substrat DAB-peroxydase, appliquer 200 μL de solution à chaque diapositive et incuber pendant 1 min.
   9. Placez les glissières dans un pot en verre et rincez avec de l'eau du robinet pendant 5 min.
   10. CounterstainAvec l'hématoxyline de Mayer pendant 1 min.
   11. Lavez les diapositives avec DW.
   12. Procédez pour déshydrater et montez les diapositives à l'étape 2.6.
6. Déshydratation et montage
   1. Déshydratez les diapositives en les déplaçant séquentiellement dans 100 mL de 70%, 80%, 90% et 100% d'EtOH, 30 s chacun.
   2. Trempez les diapositives en deux changements de xylène pendant 1 min chacun.
   3. Ajoutez 50 μL de solution de montage aux lamelles et placez les diapositives sur le dessus.

Résultats

Dans cette étude, nous avons généré des granulés chondrogéniques provenant de CBMC-hiPSC en induisant des cellules secondaires des EB. La différenciation chondrogénique a été induite par CBMC-hiPSC avec une forte pluripotence confirmée ¹¹ . Un schéma simple de notre protocole est illustré à la figure 1A . Avant la différenciation, les colonies iPSC ont été développées ( figure 1B ). Les...

Discussion

Ce protocole a généré avec succès des hiPSC à partir de CBMC. Nous avons reprogrammé les CBMC aux hiPSC en utilisant un vecteur viral Sendai contenant des facteurs Yamanaka ²⁴ . Trois cas ont été utilisés en différenciation, et toutes les expériences ont généré avec succès des granulés chondrogéniques avec ce protocole. De nombreuses études ont rapporté des protocoles pour la différenciation des hiPSC en chondrocytes ^{25 , 26...}

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
Name	Company	Catalog Number	Description
E8 Medium Materials
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	E8 Medium (500 mL)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	E8 Medium  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	E8 Medium  (Conc.: 100 ng/mL)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	E8 Medium  (Conc.: 64 μg/mL)
DPBS	Life Technologies	14190-144
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Name	Company	Catalog Number	Description
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-Collagen II antibody	abcam	ab34712	1:100
Alcian blue	Sigma Aldrich	A3157-10G
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252-25G
Safranin O	Sigma Aldrich	090m0039v
Nuclear fast red	Americanmastertech	STNFR100
xylene	Duksan	115
Ethanol	Duksan	64-17-5
Mayer's hematoxylin solution	wako pure chemical industries	LAK7534
DAP	VECTOR LABORATORIES	SK-4100
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
Name	Company	Catalog Number	Description
Chondrogenic Differentiation Materials
DMEM	Life Technologies	11885	Chondrogenic media component (500 mL)
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050	Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2	R&D	355-BM-050	Chondrogenic media component (Conc.:100 ng/ml)
Recombinant Hman TGF-beta3	R&D	243-B3-002	Chondrogenic media component (Conc.:10 ng/ml)
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
ITS+ Premix	BD	354352	Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
Dexamethasone-Water Soluble	Sigma Aldrich	D2915-100MG	Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M)
GlutaMAX Supplement	Life Technologies	35050-061	Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
Sodium pyruvate solution	Sigma Aldrich	S8636	Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
L-Proline	Sigma Aldrich	P5607-25G	Chondrogenic media component (40 μg/ml)