제대혈 유래 다 능성 줄기 세포로부터 연골 형성 펠렛 형성

요약

여기, 우리는 제대혈 단핵 세포 유래 인간 유도 pluripotent 줄기 세포에서 연골 분화에 대한 프로토콜을 제안합니다.

초록

인간 관절 연골 자체를 복구하는 능력이 부족합니다. 따라서 연골 퇴행은 치유 적 치료가 아니라 보존 적 치료로 치료됩니다. 현재, 생체 외 팽창 된 연골 세포 또는 골수 유래 중간 엽 줄기 세포 (BMSC)로 손상된 연골을 재생시키기위한 노력이 진행되고있다. 그러나, 이들 세포의 생존력 및 불안정성이 제한적이어서 연골 재건에 대한 적용이 제한적이다. 인간 유도 pluripotent 줄기 세포 (hiPSCs) 재생 응용 프로그램에 대한 새로운 대안으로 과학적 관심을 받았다. 무제한자가 재생 능력과 다 기능성을 가진 hiPSCs는 연골 수리를위한 새로운 대체 세포원으로 주목 받았다. 그러나 고품질의 연질 펠릿을 대량으로 얻는 것은 임상 적용에 중요한 과제입니다. 이 연구에서 우리는 연쇄상 구별을 위해 배아 체 (EB) 유래 증식 세포를 사용했다. 성공적인 연골 형성은 PCR 및알 시안 블루, 톨루이딘 블루, 콜라겐 타입 I 및 II에 대한 항체 (각각 COL1A1 및 COL2A1)로 염색 하였다. 우리는 제대혈 단핵 세포 유래 iPSCs (CBMC-hiPSCs)를 연골 알약으로 분화시키는 방법을 상세히 제시한다.

서문

hiPSC의 사용은 약물 스크리닝 및 다양한 질병에 대한 기계 론적 연구를위한 새로운 전략을 대표합니다. 재생산 관점에서, hiPSC는 또한 관절 연골 ^1,2 와 같은 치유력이 제한적인 손상된 조직의 대체를위한 잠재적 인 원천입니다.

네이티브 관절 연골의 재생은 수십 년 동안 도전 과제였습니다. 관절 연골은 부드럽고 하얀 조직으로 뼈의 끝 부분을 덮어 마찰로부터 보호합니다. 그러나 손상시 재생 능력이 제한되어있어자가 수리가 거의 불가능합니다. 따라서 연골 재생에 초점을 맞춘 연구가 수십 년 동안 진행되어왔다.

이전에, 연골 세포 계통으로의 시험 관내 분화는 보통 무릎 관절로부터 분리 된 BMSC 또는 천연 연골 세포로 수행되었다. 원인o 연골 세포의 잠재력, BMSC 및 천연 연골 세포는 연골 형성에서의 사용을 지원하는 많은 장점을 가지고있다. 그러나, 제한된 팽창 및 불안정한 표현형 때문에, 이들 세포는 관절 연골 결손의 재건에 몇 가지 한계점에 직면한다. 시험 관내 배양 조건 하에서,이 세포들은 3-4 계대 후 자신의 특성을 잃어 버리는 경향이 있으며, 결과적으로 분화 능력에 영향을 미친다. 또한, 천연 연골 세포의 경우, 이들 세포를 수득 할 때 무릎 관절에 부가적인 손상이 불가피하다.

BMSC 또는 천연 연골 세포와는 달리, hiPSC 는 시험 관내에서 무한히 확장 될 수있다. 적절한 배양 조건에서, hiPSC는 연골 분화의 대체 원으로서의 큰 가능성을 가지고있다. 그러나 hiPSCs ⁵ 의 본질적인 특성을 변경하는 것은 어렵습니다. 또한, 그것은 몇 가지 복잡한 in vitro steps는 특정 세포 유형으로 hiPSCs의 운명을 지시합니다. 이러한 합병증에도 불구하고, 높은 자체 재생 능력과 chondrocytes ⁶ 을 포함하여 표적화 된 세포로 분화 할 수있는 능력 때문에 hiPSCs의 사용이 권장됩니다.

연골 세포 분화는 일반적으로 펠렛 배양 또는 마이크로 럼 배양과 같은 3 차원 배양 시스템을 사용하여 MSC 유사 전구 세포를 사용하여 수행됩니다. hiPSCs를 사용하는 경우 MSC 유사 전구 세포를 생성하는 프로토콜은 기존 프로토콜과 다릅니다. 일부 그룹에서는 표현형을 MSC 유사 세포로 직접 변환하기 위해 hiPSC의 단일 층 배양액을 사용합니다. 그러나 대부분의 연구에서는 EBs를 사용하여 MSCs ^{8 , 9 , 10 , 11} 과 유사한 세포를 생성합니다.

다양한 형태의 성장 인자가 chondroge 유도에 사용됩니다.네 시스. 일반적으로, BMP 및 TGFβ 계열 단백질은 단독으로 또는 조합하여 사용됩니다. GDF5, FGF2, IGF1 12,13,14,15와 같은 다른 인자들도 분화가 유도되었다. TGFβ1은 MSCs ¹⁶ 에서 용량 의존적으로 연골 형성을 자극하는 것으로 나타났다. 다른 isotype, TGFβ3와 비교하여, TGFβ1은 연골 전엽 간질 농축을 증가시킴으로써 연골 형성을 유도한다. TGFβ3은 간엽 세포 증식을 유의 적으로 증가시킴으로써 연골 형성을 유도한다. 그러나 TGFβ3은 TGFβ1 ^{7 , 10 , 18 , 19} 보다 연구자들에 더 자주 사용된다. BMP2는 인간의 연골 기질 성분과 관련된 유전자 발현을 증가시킨다체외 조건 하에서 관절 연골 세포 ²⁰ . BMP2는 TGFβ 단백질 ²¹ 과 함께 MSCs에서 연골 형성에 중요한 유전자의 발현을 증가시킵니다. 또한 BMP2가 Smad와 MAPK 경로를 통해 TGFβ3의 효과를 상승적으로 향상 시킨다는 것이 밝혀졌다.

이 연구에서, CBMC-hiPSCs는 낮은 부착 배양 접시에서 EB 배지를 사용하여 EB로 응집되었다. EBs를 젤라틴 코팅 접시에 부착시킴으로써 외생 세포를 유도 하였다. outgrowth 세포를 이용한 연골 세포 분화는 pellet 배양으로 수행 하였다. BMP2와 TGFβ3 모두의 치료는 성공적으로 연축 성 펠렛 형성을 위해 세포를 응축시키고 세포 외 기질 (ECM) 단백질 축적을 유도했다. 이 연구는 CBMC-hiPSCs를 사용하여 간단하지만 효율적인 연골 세포 분화 프로토콜을 제안합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 한국 가톨릭 대학교의 기관 검토위원회 (KC12TISI0861)의 승인을 받았습니다. 리 프로그래밍에 사용 된 CBMC는 서울 성모 병원의 코드 혈액 은행에서 직접 입수했습니다.

1. iPSC와의 연동 분화

1. CBMC-iPSC 세대
   1. 이전 연구에서 보여준 프로토콜을 사용하여 CBMC-hiPSCs를 생성하십시오.
   2. 혈액 세포를 15 ML 원뿔 튜브에 수집하고 hemocytometer를 사용하여 그들을 계산합니다.
   3. 3 x 10 ⁵ 세포를 준비하고 515 xg 및 RT에서 5 분간 원심 분리하십시오. 흡인으로 상등액을 버리고 혈액 세포 매체 0.5 ML에 세포를 resuspend.
   4. 세포를 비 코팅 24- 웰 플레이트의 웰에 옮기고 제조자의 권고에 따라 센다이 바이러스 혼합물을 첨가한다.
   5. 1,150 xg 및 30 ° C에서 30 분 동안 플레이트를 원심 분리하십시오.
   6. 후미원심 분리기, 37 ° C에서 5 % CO ₂ 에서 밤새 세포를 배양하십시오.
   7. 다음날, 형질 도입 된 세포를 매트릭스로 코팅 된 웰로 옮긴다. 30 ℃에서 30 분 동안 1,150 xg에서 플레이트를 원심 분리하십시오.
   8. 원심 분리 후, 상등액을 제거하고, iPSC 배지 1 mL를 첨가하고, 37 ℃에서 5 % CO2에서 세포 O / N을 유지한다.
   9. 첨부 된 세포를 37 ° C 및 5 % CO ₂ 에서 유지하십시오. 매일 매체를 교체하고 신선한 iPSC 매체로 교체하십시오.
      참고 : 식민지는 형질 도입 후 14-21 일에 나타납니다.
2. EB 세대
   1. 37 ° C와 5 % CO ₂ 에서 hiPSC를 유지하십시오. 매일 매체를 교체하여 신선한 Essential 8 (E8) 매체로 교체하십시오.
   2. E8 배지에서 vitronectin 코팅, 100mm 접시에 2 x 10 ⁶ hiPSCs를 준비합니다.
   3. 배양 접시에서 E8 매체를 제거하고 멸균 인산 버퍼 식염수 (PBS)로 씻으십시오.
   4. 1 추가mL의 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)에 넣고 2 분 동안 37 ° C 및 5 % CO ₂ 에서 배양한다.
   5. 세포를 E8 배지 3 mL로 수확하고 새로운 15-mL 원뿔 튜브로 옮긴다. 2 분 동안 실온 (RT)에서 250 XG에서 세포를 원심 분리기.
   6. 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음 E8 매체 5 ML에있는 세포를 resuspend.
   7. hemocytometer를 사용하여 셀을 계산하고 각 100mm 페트리 접시 2 X 10 ⁶ 세포를 준비합니다. 10 μM ρ 관련 키나제 (록) 억제제와 E8 및 EB 매체 (1 : 1)의 10 ML 혼합물에 준비 세포를 Resuspend.
   8. 37 ° C와 5 % CO ₂ 에서 응집에 대한 세포 O / N를 품어.
   9. 다음 날, pipetting하여 집계 된 EB를 수확합니다. 1 분 250 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는를 제거하고 10 ML의 신선한 E8 매체에 EBs를 resuspend.
   10. 생성 된 EB를 5 일 동안 확대하여 일일 변경을 fres로 수행합니다.h E8 배지. 더 성숙을 위해, E7 매체로 문화 매체를 변경합니다. 새 E7 배지로 매일 중간 배지를 수행하여 37 ℃ 및 5 % CO2에서 EB를 5 일 동안 유지한다.
       참고 : E7 배지는 FGF2가없는 E8 배지입니다.
3. EBs로부터의 증식 세포 유도
   1. 100 mm 접시에 1 % 젤라틴 6 ML을 추가하고 37에서 품어 ° C와 30 분 5 % CO ₂ .
   2. 사용하기 전에 젤라틴을 제거하고 2-3 시간 동안 완전히 건조시킵니다.
   3. EB를 50 mL 원뿔 튜브로 옮긴다. EB가 원추형 튜브의 바닥에 고정되도록하십시오. EB를 방해하지 않고 뜨는 제거.
   4. 20 % 태아 소 혈청 (FBS)과 Dulbecco의 수정 이글의 매체 (DMEM) 10 ML에 EBs Resuspend. EB를 젤라틴 코팅 100mm 접시에 옮깁니다. 10 μM ROCK 억제제를 첨가하십시오.
   5. 37 ° C 및 5 % CO ₂ 에서 7 일 동안 세포를 인큐베이션하고 유지한다. 나를 바꾸어 라.ROCK 억제제를 첨가하지 않고 매일 격렬히 닦으십시오.
4. 연골 형성 펠릿 형성
   1. 접시에서 문화 매체를 대기음과 PBS로 세 번 세포를 씻으십시오.
   2. 1 MM EDTA 1 ML을 적용하고 2 분 37 ° C와 5 % CO ₂ 에서 품어.
   3. 20 % FBS와 DMEM 5 ML을 사용하여 세포를 수확하고 새로운 15 ML 원뿔 튜브로 전송.
   4. 250 XG와 RT에서 2 분 동안 세포를 원심 분리기. 뜨는을 버리고 20 % FBS와 DMEM 10 ML에 펠렛을 resuspend.
   5. 40 μm 셀 스트레이너를 사용하여 셀 덩어리를 걸러 내고 버리고 단일 세포를 수거하십시오. hemocytometer를 사용하여 단일 세포를 센다.
   6. 250 XG와 RT에서 2 분 동안 세포를 원심 분리기. chondrogenic 차별화 매체 (CDM) 300 μL와 15 ML 원추형 튜브에 펠렛 당 상등 및 종자 3 X 10 ⁵ 세포를 제거합니다.
   7. 펠렛 형성을 위해 5 분 동안 세포를 원심 분리하십시오.680 xg 및 RT.
      참고 : 펠렛은 연골 펠렛의 분화 동안 15 ML 원뿔 튜브에서 유지됩니다.
   8. 37 밤새 세포를 품어 ° C 5 % CO ₂ .
   9. 2-3 일마다 CDM을 변경하십시오. 3 일 이내에, 펠렛은 평평하고 회전 타원체 형태를 나타낼 것이다. 37 ° C 및 5 % CO ₂ 에서 21 일 동안 알약을 유지하십시오.

2. 염색에 의한 연골 형성 펠렛 특성

1. 연골 형성 매립
   1. 묻기 전에 58 ° C에서 파라핀을 준비하고 녹여주십시오.
   2. 1.5 ML 튜브에서 RT에서 2 H 4 % paraformaldehyde의 1 ML에 알약을 수정.
      주의 : 파라 포름 알데히드는 매우 독성이 있습니다. 눈, 피부 또는 점막과의 접촉을 피하십시오. 그것을 준비하는 동안 노출을 최소화하고 흡입을 피하십시오.
   3. 카세트에 거즈 한 층을 놓고 피펫을 사용하여 고정 된 알약을 옮깁니다. 접을 때 펠렛을 덮는다.e 거즈를 잡고 카세트 뚜껑을 닫으십시오.
   4. 70 % 에탄올 (EtOH) 100 mL에서 탈수를 2 회, 각각 10 분간 개시한다. 80 % 및 95 % EtOH에서 순차적 10 분 세척을 통해 펠렛을 탈수시킨다.
   5. 펠렛을 10 분 동안 100 % EtOH로 옮긴다. 신선한 EtOH로 3 회 반복한다.
   6. "제거"를 위해 용액을 EtOH와 크실렌의 100 mL, 1 : 1 혼합물에 교환 한 후 EtOH와 크실렌의 1 : 2 혼합물을 각각 10 분 동안 교환하십시오. 펠릿을 100 % 크실렌 (각 10 분)에 두 번 배양하여 남은 EtOH를 제거합니다.
   7. 파라핀 침투 들어, 연속 자일 렌과 파라핀 혼합물에 알약을 품어. 58 ° C에서 전체 파라핀 침투 과정을 수행하십시오. 쥐똥을 자일 렌과 파라핀의 2 : 1 혼합물 100mL에 30 분 동안 품어 둔다.
   8. 100 mL의 크실렌과 파라핀의 1 : 1 혼합물에 대한 용액을 교환하고 30 분 동안 항온 처리한다.
   9. 자일 렌과 파라핀의 1 : 2 혼합물 100mL에 대한 용액을 교환하고 30 분.
   10. 최종 침투 들어, 펠렛을 100 % 파라핀의 첫 목욕에 전송하고 2 시간 품어.
   11. 펠렛을 100 % 파라핀의 두 번째 목욕에 옮기고 58 ° C에서 O / N을 배양합니다.
   12. 다음날, 족집게를 사용하여 펠릿을 몰드에 부드럽게 옮긴다. 파라핀 디스펜서에서 파라핀을 몰드에 첨가하십시오. 4 ° C에서 30 분 동안 파라핀을 고형화하십시오.
   13. 섹션을 7 μm로 슬라이스하고 섹션을 슬라이드로 옮깁니다. 슬라이드를 하룻밤 건조시키고 사용 준비가 될 때까지 실온에서 슬라이드를 보관하십시오.
2. 슬라이드 준비
   1. 100 %, 90 %, 80 % 및 70 % EtOH를 각각 5 분 동안 순차적으로 이동시켜 슬라이드를 탈 파라핀 화시킵니다.
   2. 유리 항아리에 슬라이드를 놓고 5 분 동안 수돗물로 헹굽니다.
3. 알 시안 블루 염색
   1. 30 분 동안 1 % alcian 블루 솔루션 50 ML에 슬라이드를 품어.
      아니E : 알 시안 블루를 3 % 아세트산 용액으로 희석한다. 아세트산을 사용하여 pH를 2.5로 조정한다.
   2. 슬라이드를 유리 병에 넣고 2 분 동안 수돗물로 헹굽니다.
   3. 탈 이온수 (DW)에서 슬라이드를 헹구고 2 분 동안 핵 고속 적색 용액으로 대조 염색합니다.
   4. 유리 병에 슬라이드를 놓고 1 분 동안 수돗물로 헹굽니다.
   5. 2.3.5) 단계 2.6에서 슬라이드를 탈수 및 마운트합니다.
4. 톨루이딘 블루 염색
   1. 슬라이드를 50 mL의 톨루이딘 블루 용액에서 4 분 동안 인큐베이션한다.
   2. 유리 항아리에 슬라이드를 놓고 5 분 동안 수돗물로 헹굽니다.
   3. 단계 2.6에서 슬라이드를 탈수 및 마운트하십시오.
5. 면역 조직 화학 염색
   1. 내생 peroxidase 차단을 위해 15 분 동안 3 % H ₂ O ₂ 에서 슬라이드를 품어.
   2. 트리스 부에 1 : 100 희석 한 1 차 항체 (anti-COL1A1과 -COL2A1) 200 μL를가한다.슬라이드에 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)과 정상 염소 혈청 (NGS) 5 %를 함유 한 생리 식염수 (TBS)를 접종하고 4 ℃에서 O / N을 배양한다.
   3. 다음날, 슬라이드를 유리 병에 넣고 0.1 % 폴리 소르 베이트 20 (TBST)이 함유 된 TBS 50 mL로 5 분씩 각각 3 회 씻어냅니다.
   4. 2 차 항체 (염소 항 토끼 IgG 항체 200 μL를 1 % BSA 및 5 % NGS를 포함하는 TBS에서 1 : 200으로 희석)를 슬라이드에 가하고 40 분 동안 실온에서 배양한다.
   5. 유리 항아리에 슬라이드를 놓고 각각 5 분 50 ML 3 번 그들을 씻으십시오.
   6. 신호 증폭 들어, 슬라이드에 HRP - 복합 streptavidin 솔루션을 적용하고 10 분 동안 품어.
   7. 유리 항아리에 슬라이드를 놓고 각각 5 분 50 ML 3 번 그들을 씻으십시오.
   8. DAB - peroxidase 기판 솔루션을 섞어 각 슬라이드에 솔루션의 200 μL를 적용하고 1 분 동안 품어.
   9. 유리 항아리에 슬라이드를 놓고 5 분 동안 수돗물로 헹굽니다.
   10. 대항균Mayer의 hematoxylin과 1 분간 접촉시켰다.
   11. DW로 슬라이드를 씻으십시오.
   12. 단계 2.6에서 슬라이드를 탈수 및 마운트하십시오.
6. 탈수 및 장착
   1. 슬라이드를 70 %, 80 %, 90 % 및 100 % EtOH (각각 30 초) 100mL를 통해 순차적으로 이동시켜 탈수합니다.
   2. 슬라이드를 각각 1 분 동안 두 번의 크실렌 변화로 담그십시오.
   3. coverslips에 장착 솔루션 50 μL를 추가하고 상단에 슬라이드를 놓으십시오.

결과

이 연구에서, 우리는 EBs에서 번식 세포를 유도하여 CBMC - hiPSCs에서 연골 펠렛을 생성했습니다. 연골 형성 분화는 CBMC-hiPSCs를 사용하여 유도되었다. 우리의 프로토콜의 간단한 구성이 그림 1A 에 나와 있습니다. 분화하기 전에 iPSC 콜로니가 확장되었습니다 ( 그림 1B ). 확장 된 iPSCs는 EB로 분화를 시작하기 위...

토론

이 프로토콜은 CBMC로부터 hiPSCs를 성공적으로 생성했습니다. 야마나카 요인을 포함하는 센다이 바이러스 벡터를 사용하여 CBMCs를 hiPSCs로 재 프로그램 화했다. 세 가지 경우가 분화에 사용되었으며, 모든 실험은 성공적으로이 프로토콜을 사용하여 연골 펠릿을 생성했습니다. 많은 연구에 의해 hiPSC가 연골 세포로 분화되는 프로토콜이보고되었다 ^{25 , 26}

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
Name	Company	Catalog Number	Description
E8 Medium Materials
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	E8 Medium (500 mL)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	E8 Medium  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	E8 Medium  (Conc.: 100 ng/mL)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	E8 Medium  (Conc.: 64 μg/mL)
DPBS	Life Technologies	14190-144
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Name	Company	Catalog Number	Description
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-Collagen II antibody	abcam	ab34712	1:100
Alcian blue	Sigma Aldrich	A3157-10G
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252-25G
Safranin O	Sigma Aldrich	090m0039v
Nuclear fast red	Americanmastertech	STNFR100
xylene	Duksan	115
Ethanol	Duksan	64-17-5
Mayer's hematoxylin solution	wako pure chemical industries	LAK7534
DAP	VECTOR LABORATORIES	SK-4100
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
Name	Company	Catalog Number	Description
Chondrogenic Differentiation Materials
DMEM	Life Technologies	11885	Chondrogenic media component (500 mL)
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050	Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2	R&D	355-BM-050	Chondrogenic media component (Conc.:100 ng/ml)
Recombinant Hman TGF-beta3	R&D	243-B3-002	Chondrogenic media component (Conc.:10 ng/ml)
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
ITS+ Premix	BD	354352	Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
Dexamethasone-Water Soluble	Sigma Aldrich	D2915-100MG	Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M)
GlutaMAX Supplement	Life Technologies	35050-061	Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
Sodium pyruvate solution	Sigma Aldrich	S8636	Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
L-Proline	Sigma Aldrich	P5607-25G	Chondrogenic media component (40 μg/ml)