JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציעים פרוטוקול לבידול chondrogenic מ דם טבורי mononuclear תאים נגזר האדם המושרה בתאי גזע pluripotent.

Abstract

לסחוס המפרקי של האדם אין יכולת לתקן את עצמו. ניוון הסחוס ולכן מטופל לא על ידי טיפולים שמרניים אלא על ידי שמרני. נכון לעכשיו, המאמצים נעשים כדי לחדש סחוס פגום עם chivrocytes לשעבר vivo מורחבת או מוח העצם נגזר תאי גזע mesenchymal (BMSCs). עם זאת, המוגבלות הכדאיות וחוסר היציבות של תאים אלה להגביל את היישום שלהם שחזור סחוס. תאי גזע pluripotent האדם המושרה (hiPSCs) קיבלו תשומת לב מדעית כחלופה חדשה ליישומים משובי. עם יכולת חידוש עצמי בלתי מוגבלת ורב-יכולות, hiPSCs הודגשו כמקור חלופי חדש לתיקון סחוס. עם זאת, השגת כמות גבוהה של כדורי chondrogenic באיכות גבוהה היא אתגר גדול היישום הקליני שלהם. במחקר זה, השתמשנו בתאי גדילה של תאי גופרית (EB). CHondrogenesis מוצלח אושרה על ידי PCR אD מכתים עם כחול alcian, כחול toluidine, ונוגדנים נגד סוגי קולגן I ו- II (COL1A1 ו COL2A1, בהתאמה). אנו מספקים שיטה מפורטת להבדיל של דם טבורי mononuclear תא נגזר iPSCs (CBMC-hiPSCs) לתוך כדורי chondrogenic.

Introduction

השימוש hiPSCs מייצג אסטרטגיה חדשה עבור בדיקות סמים ומחקרים מכניסטיים של מחלות שונות. מנקודת מבט משובי, hiPSCs הם גם מקור פוטנציאלי להחלפת רקמות שנפגעו בעלי יכולת ריפוי מוגבלת, כגון סחוס מפרקי 1 , 2 .

התחדשות של סחוס articular יליד כבר אתגר במשך כמה עשרות שנים. סחוס המפרק הוא רקמה רכה, לבנה, המעטפת את קצה העצמות ומגינה עליהם מפני חיכוך. עם זאת, יש לו יכולת regenerative מוגבל כאשר פגום, מה שהופך תיקון עצמי כמעט בלתי אפשרי. לכן, מחקר התמקדות התחדשות הסחוס כבר מתמשך במשך כמה עשורים.

בעבר, ב מבחנה חוץ גופית לתוך השושלת chondrogenic בוצעה בדרך כלל עם BMSCs או chondrocytes יליד מבודד מפרק הברך 3 . בשל TO הפוטנציאל chondrogenic שלהם, BMSCs ו chondrocytes יליד יש יתרונות רבים התומכים בשימוש שלהם chondrogenesis. עם זאת, בשל ההתפשטות המוגבלת שלהם פנוטיפ יציב, תאים אלה בפני מספר מגבלות שחזור של מומים הסחוס המפרקי. תחת תנאים תרבות חוץ גופית , תאים אלה נוטים לאבד את המאפיינים שלהם לאחר 3-4 מעברים, אשר בסופו של דבר משפיע על יכולות ההבחנה שלהם 4 . כמו כן, במקרה של chondrocytes יליד, נזק נוסף למפרק הברך הוא בלתי נמנע בעת קבלת תאים אלה.

שלא כמו BMSCs או chondrocytes יליד, hiPSCs יכול להאריך ללא הגבלת במבחנה . עם התנאים תרבות נאותה, hiPSCs יש פוטנציאל גדול כמקור חלופי עבור בידול chondrogenic. עם זאת, זה מאתגר לשנות את המאפיינים המהותיים של hiPSCs 5 . יתר על כן, זה לוקח כמה מסובך במבחנה stePS לכוון את גורלם של hiPSCs לסוג תא מסוים. למרות סיבוכים אלה, השימוש hiPSCs עדיין מומלץ בשל יכולת ההתחדשות העצמית שלהם ואת יכולתם להבדיל תאים ממוקד, כולל chondrocytes 6 .

בידול chondrogenic נעשה בדרך כלל עם מערכות תרבות תלת מימדי, כגון תרבות גלולה או תרבות micromass, באמצעות תאים MSC כמו. אם באמצעות hiPSCs, פרוטוקול לייצר תאים כמו MSC כמו שונה הפרוטוקולים הקיימים. כמה קבוצות להשתמש בתרבות monolayer של hiPSCs כדי להמיר ישירות את הפנוטיפ לתוך תאים כמו MSC 7 . עם זאת, רוב המחקרים משתמשים ב- EBS כדי ליצור תאי תמותה הדומים ל- MSC 8 , 9 , 10 , 11 .

סוגים שונים של גורמי גדילה משמשים לגרום chondrogeNesis. בדרך כלל, BMP ו TGFβ משפחה חלבונים משמשים, לבד או בשילוב. הבידול גם הוא המושרה עם גורמים אחרים, כגון GDF5, FGF2, ו IGF1 12 , 13 , 14 , 15 . TGFβ1 הוכח לעורר chondrogenesis באופן תלוי מינון MSCs 16 . בהשוואה לאיזוטופיפ השני, TGFβ3, TGFβ1 גורם chondrogenesis על ידי הגדלת pre-cartilage תא התעבות mesenchymal מראש. TGFβ3 גורם chondrogenesis על ידי הגדלה משמעותית של התפשטות תאים mesenchymal 17 . עם זאת, TGFβ3 משמש לעתים קרובות יותר על ידי חוקרים מאשר TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19 . BMP2 משפר את הביטוי של גנים הקשורים רכיבים chondrogenic מטריקס האדםChondrocytes מפרקי תחת בתנאים חוץ גופית 20 . BMP2 מגביר את הביטוי של גנים קריטיים להיווצרות סחוס ב- MSCs בשילוב עם חלבונים TGFβ 21 . כמו כן הוכח כי BMP2 סינרגיסטי משפר את ההשפעה של TGFβ3 דרך מסלולי Smad ו- MAPK 22 .

במחקר זה, CBMC-hiPSCs היו מצטברים לתוך EBS באמצעות EB בינוני בצלחת פטרי מצורף נמוך. תאי תולדה נגרמו על ידי הצמדת ה- EBS לצלחת מצופה ג'לטין. בידול chondrogenic באמצעות תאים תולדה בוצעה על ידי תרבות גלולה. טיפול עם שני BMP2 ו TGFβ3 בהצלחה מרוכז התאים המושרה תאי מטריקס תאי (ECM) הצטברות חלבון עבור היווצרות chondrogenic גלולה. מחקר זה מציע פרוטוקול בידול chondrogenic פשוטה אך יעילה באמצעות CBMC-hiPSCs.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי המועצה המוסדית סקירה של האוניברסיטה הקתולית של קוריאה (KC12TISI0861). CBMCs המשמשים לתכנות מחדש הושגו ישירות מהבנק הטבורי של בית החולים סנט מרי בסיאול.

1. בידול Chondrogenic מ iPSCs

  1. הדור CBMC-iPSC
    1. צור CBMC-hiPSCs באמצעות פרוטוקול המוצג בעבודה הקודמת שלנו 23 .
    2. לאסוף את תאי הדם בצינור חרוטי 15 מ"ל לספור אותם באמצעות hemocytometer.
    3. הכן 3 x 10 5 תאים צנטריפוגה אותם 5 דקות ב 515 xg ו RT. מחק supernatant על ידי יניקה resuspend התאים 0.5 מ"ל של המדיום תא דם.
    4. מעבירים את התאים היטב של צלחת לא מצופה היטב 24-ולהוסיף את תערובת וירוס Sendai, בעקבות המלצות היצרן.
    5. צנטריפוגה צלחת במשך 30 דקות ב X150 1,50 ו 30 ° C.
    6. אחורהצנטריפוגה אה, דגירה התאים לילה (O / N) ב 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 .
    7. למחרת, להעביר את התאים transduced כדי מצופה היטב מטריצה. צנטריפוגה את הצלחת ב XG 1,150 במשך 30 דקות ב 30 מעלות צלזיוס.
    8. לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant, להוסיף 1 מ"ל של המדיום iPSC, ולשמור על התאים O / N ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 .
    9. שמור על התאים המצורפים על 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 . שנה את המדיום מדי יום, והחלפתו במדיום iPSC טרי.
      הערה: המושבות יופיעו ביום 14-21 לאחר התמרה.
  2. הדור EB
    1. לשמור על hiPSCs ב 37 ° C ו 5% CO 2 . שנה את המדיום היומי, להחליף אותו עם Essential 8 חדש (E8) בינוני.
    2. הכן 2 x 10 6 hiPSCs בצלחת vitronectin מצופה, 100 מ"מ ב E8 בינוני.
    3. הסר את המדיום E8 מהצלחת תרבות לשטוף עם מלוחים סטרילי פוספט שנאגרו (PBS).
    4. הוסף 1מ"ל של 1 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 עבור 2 דקות.
    5. קציר התאים עם 3 מ"ל של מדיום E8 ולהעביר אותם צינור חדש חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה התאים ב XG 250 בטמפרטורת החדר (RT) במשך 2 דקות.
    6. לשאוב את supernatant מבלי להפריע תא גלולה resuspend התאים 5 מ"ל של מדיום E8.
    7. לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולהכין 2 x 10 6 תאים עבור כל צלחת פטרי 100 מ"מ. Resuspend התאים מוכנים בתערובת 10 מ"ל של E8 ו EB בינוני (1: 1) עם 10 מיקרומטר rho- הקשורים מעכב Kinase (ROCK).
    8. דגירה התאים O / N עבור צבירה ב 37 ° C ו 5% CO 2 .
    9. ביום המחרת, למסוק את EBS המצטבר על ידי pipetting. צנטריפוגה התאים ב 250 xg במשך 1 דקות. הסר את supernatant ו resuspend EBS ב 10 מ"ל של מדיום E8 טרי.
    10. הגדל את EBS שנוצר במשך 5 ימים, ביצוע שינויים יומיים עם fresשעה E8 בינוני. להבשלה נוספת, לשנות את המדיום תרבות בינוני E7. שמור על EBS ב 37 ° C ו 5% CO 2 במשך 5 ימים נוספים, ביצוע שינויים בינוניים מדי יום עם בינוני E7 טרי.
      הערה: המדיום E7 הוא בינוני E8 ללא FGF2.
  3. אינדוקציה תא תא מתוך EBS
    1. הוסף 6 מ"ל של ג'לטין 1% למאכל 100 מ"מ ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 למשך 30 דקות.
    2. מוציאים את הג'לטין ומייבשים את התבשיל לחלוטין למשך 2-3 שעות לפני השימוש.
    3. מעבירים את EBS לצינור חרוטי 50 מ"ל. אפשר EBs להתיישב לתחתית של צינור חרוטי. הסר את supernatant מבלי להפריע EBS.
    4. Resuspend EBS ב 10 מ"ל של Dulbecco השתנה של נשר בינוני (DMEM) עם 20% בסרום שור עוברית (FBS). מעבירים את EBS לצלחת מצופה ג'לטין, 100 מ"מ. הוסף 10 מיקרומטר ROCK inhibitor.
    5. דגירה ולשמור על התאים ב 37 ° C ו 5% CO 2 במשך 7 ימים. לשנות נושאDium כל יום ללא הוספת מעכב ROCK.
  4. היווצרות chondrogenic גלולה
    1. לשאוב את המדיום תרבות מהצלחת לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.
    2. החל 1 מ"ל של 1 מ"מ EDTA ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 עבור 2 דקות.
    3. קציר התאים באמצעות 5 מ"ל של DMEM עם 20% FBS ולהעביר אותם צינור חדש חרוטי 15 מ"ל.
    4. צנטריפוגה התאים דקות 2 ב 250 xg ו RT. מחק supernatant ו resuspend גלולה ב 10 מ"ל של DMEM עם 20% FBS.
    5. סינון להשליך את גושי התא באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר ומסיק את התאים בודדים. ספירת תאים בודדים באמצעות hemocytometer.
    6. צנטריפוגה התאים דקות 2 ב 250 xg ו RT. הסר את supernatant וזרע 3 x 10 5 תאים לכל גלולה בצינור חרוטי 15 מ"ל עם μL 300 של המדידה בידול chondrogenic (CDM).
    7. עבור היווצרות גלולה, צנטריפוגה התאים במשך 5 דקות ב680 xg ו- RT.
      הערה: כדורי נשמרים ב 15 צינורות חרוטי מ"ל במהלך בידול של כדורי chondrogenic.
    8. דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 .
    9. שנה את ה- CDM כל 2-3 ימים. תוך 3 ימים, כדורי יציגו מורפולוגים שטוחים, spheroidal. לשמור על כדורי 21 ימים ב 37 ° C ו 5% CO 2 .

2. אפיון Chondrogenic גלולה על ידי מכתים

  1. הטבעה chondrogenic
    1. לפני הטבעה, להכין להמיס פרפין ב 58 ° C.
    2. תקן את כדורי 1 מ"ל של paraformaldehyde 4% עבור 2 שעות ב RT בצינור 1.5 מ"ל.
      זהירות: Paraformaldehyde הוא רעיל מאוד. הימנע ממגע עם עיניים, עור או ריריות. למזער את החשיפה ולמנוע שאיפה בעת הכנתו.
    3. מניחים שכבה אחת של גזה על הקלטת ולהעביר את כדורי קבוע באמצעות פיפטה. לכסות את גלולה על ידי קיפול thגזה וסוגר את מכסה הקלטת.
    4. ייזום התייבשות ב 100 מ"ל של 70% אתנול (EtOH) פעמיים, 10 דקות כל אחד. מייבשים את כדורי דרך שוטף 10 דקות שוטף 80% ו 95% EtOH.
    5. מעבירים את כדורי 100% EtOH למשך 10 דקות. חזור שלוש פעמים עם EtOH טרי.
    6. עבור "ניקוי", להחליף את הפתרון של 100 מ"ל, 1: 1 תערובת של EtOH ו קסילן, ואחריו תערובת של 1: 2 של EtOH ו קסילן במשך 10 דקות כל אחד. נקה את EtOH הנותרים על ידי דוגרים את כדורי פעמיים 100% xylene, 10 דקות כל אחד.
    7. עבור חדירת פרפין, דגירה של כדורי ב קסילן רציף תערובות פרפין. בצע את תהליך חדירת הפרפין כולו ב 58 ° C. לדגור את כדורי ב 100 מ"ל של תערובת 2: 1 של קסילן פרפין במשך 30 דקות.
    8. החלף את הפתרון עבור 100 מ"ל של תערובת 1: 1 של קסילן פרפין ו דגירה במשך 30 דקות.
    9. החלף את הפתרון עבור 100 מ"ל של תערובת 1: 2 של קסילן פרפין ו דגירה עבור 30 דקות.
    10. עבור חדירת הסופי, להעביר את כדורי לאמבט הראשון של פרפין 100% ו דגירה של 2 שעות.
    11. מעבירים את כדורי לאמבט השני של פרפין 100% ו דגירה O / N ב 58 ° C.
    12. למחרת, בעדינות להעביר את הכדורים עובש באמצעות פינצטה. הוסף פרפין כדי עובש מן מתקן פרפין. לחזק את הפרפין במשך 30 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
    13. פורסים את הסעיפים ב 7 מיקרומטר ולהעביר את החלקים על השקופית. אפשר את השקופיות לייבוש לילה ולאחסן את השקופיות ב RT עד שהם מוכנים לשימוש.
  2. הכנת שקופיות
    1. Deparaffinize שקופיות על ידי הזזת אותם דרך 100 מ"ל של 100%, 90%, 80%, ו 70% EtOH ברצף במשך 5 דקות כל אחד.
    2. מניחים את השקופיות בצנצנת זכוכית ולשטוף עם מי ברז במשך 5 דקות.
  3. כתמים כחולים Alcian
    1. דגירה השקופיות 50 מ"ל של תמיסה 1% alcian כחול במשך 30 דקות.
      לֹאE: כחול Alcian הוא מדולל פתרון חומצה אצטית 3%. התאם את pH ל 2.5 באמצעות חומצה אצטית.
    2. מניחים את השקופיות בתוך צנצנת זכוכית ולשטוף עם מי ברז במשך 2 דקות.
    3. שוטפים את השקופיות במים deionized (DW) ו counterstain עם פתרון גרעיני אדום מהיר במשך 2 דקות.
    4. מניחים את השקופיות בצנצנת זכוכית ולשטוף עם מי ברז במשך 1 דקות.
    5. 2.3.5) המשך להתייבש ולהרכיב את השקופיות בשלב 2.6.
  4. טולואידין כתם כחול
    1. דגירה שקופיות 50 מ"ל של תמיסה כחולה toluidine במשך 4 דקות.
    2. מניחים את השקופיות בצנצנת זכוכית ולשטוף עם מי ברז במשך 5 דקות.
    3. המשך לייבש ולהעלות את השקופיות בשלב 2.6.
  5. מכתים אימונוהיסטוכימיים
    1. דגירה שקופיות 3% H 2 O 2 במשך 15 דקות עבור חסימת peroxidase אנדוגני.
    2. החל 200 μL של נוגדנים ראשוניים (אנטי COL1A1 ו - COL2A1) מדולל 1: 100 ב tris-bu(TBS) המכיל 1% אלבומין בסרום שור (BSA) ו 5% סרום עזים נורמלי (NGS) את השקופיות דגירה O / N ב 4 ° C.
    3. למחרת, במקום שקופיות בצנצנת זכוכית ולשטוף אותם עם 50 מ"ל של כפות המכיל 0.1% polysorbate 20 (TBST) שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
    4. החל 200 μL של נוגדן משני (נוגדנים נגד ארנב IgG נוגדן, מדולל 1: 200 ב TBS המכיל 1% BSA ו 5% NGS) את השקופיות דגירה ב RT במשך 40 דקות.
    5. מניחים את השקופיות בצנצנת זכוכית ולשטוף אותם שלוש פעמים עם 50 מ"ל, 5 דקות כל אחד.
    6. עבור הגברה האות, להחיל HRP מצמידים פתרון streptavidin את השקופיות דגירה במשך 10 דקות.
    7. מניחים את השקופיות בצנצנת זכוכית ולשטוף אותם שלוש פעמים עם 50 מ"ל, 5 דקות כל אחד.
    8. מערבבים את תמיסת המצע DAB-peroxidase, להחיל 200 μL של פתרון לשקופית כל, דגירה במשך 1 דקות.
    9. מניחים את השקופיות בצנצנת זכוכית ולשטוף עם מי ברז במשך 5 דקות.
    10. קונטרסטאיןעם hematoxylin מאייר במשך 1 דקות.
    11. לשטוף את השקופיות עם DW.
    12. המשך לייבש ולהעלות את השקופיות בשלב 2.6.
  6. התייבשות הרכבה
    1. לייבש את השקופיות על ידי הזזת אותם ברצף דרך 100 מ"ל של 70%, 80%, 90%, ו 100% EtOH, 30 s כל אחד.
    2. טובלים את השקופיות לתוך שני שינויים של קסילן במשך 1 דקות כל אחד.
    3. הוסף 50 μL של פתרון הרכבה coverslips ומניחים את השקופיות על גבי.

תוצאות

במחקר זה, יצרנו כדורי chondrogenic מ CBMC-hiPSCs על ידי גרימת תאים outgrowth מ EBS. בידול chondrogenic היה המושרה באמצעות CBMC-hiPSCs עם pluripotency 1 אישר 11 . תוכנית פשוטה של ​​הפרוטוקול שלנו מוצג באיור 1A . לפני בידול, מושבות iPSC הורחבו ( איור 1 ב...

Discussion

פרוטוקול זה נוצר בהצלחה hiPSCs מ CBMCs. אנחנו תכנות מחדש CBMCs כדי hiPSCs באמצעות וקטור ויראלי Sendai המכיל גורמים Yamanaka 24 . שלושה מקרים שימשו בידול, וכל הניסויים בהצלחה נוצר chondrogenic pellets באמצעות פרוטוקול זה. מחקרים רבים דיווחו על פרוטוקולים להבחנה של hiPSCs לתוך chondrocytes

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהפרויקט למחקר ופיתוח של טכנולוגיה בקוריאה, משרד הבריאות, הרווחה והמשפחה, הרפובליקה של קוריאה (HI16C2177).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Plasticware
100 mm DishTPP93100
6-well PlateTPP92006
50 mL Cornical TubeSPL50050
15 mL Cornical TubeSPL50015
10 mL Disposable PipetteFalcon7551
5 mL Disposable PipetteFalcon7543
12-well PlateTPP92012
NameCompanyCatalog NumberDescription
E8 Medium Materials
DMEM/F12, HEPESLife Technologies11330-057E8 Medium (500 mL)
Sodium BicarbonateLife Technologies25080-094E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium SeleniteSigma AldrichS5261E8 Medium  (Conc.: 14 ng/mL)
Human TransfferinSigma AldrichT3705E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2Peprotech100-18BE8 Medium  (Conc.: 100 ng/mL)
Human InsulinLife Technologies12585-014E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1Peprotech100-21E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic AcidSigma AldrichA8960E8 Medium  (Conc.: 64 μg/mL)
DPBSLife Technologies14190-144
VitronectinLife TechnologiesA14700
ROCK InhibitorSigma AldrichY0503
NameCompanyCatalog NumberDescription
Quality Control Materials
18 mm Cover GlassSuperiorHSU-0111580
4% ParaformaldyhydeTech & InnovationBPP-9004
Triton X-100BIOSESANG9002-93-1
Bovine Serum AlbuminVector LabSP-5050
Anti-SSEA4 AntibodyMilliporeMAB4304
Anti-Oct4 AntibodySanta CruzSC9081
Anti-TRA-1-60 AntibodyMilliporeMAB4360
Anti-Sox2 AntibodyBiolegend630801
Anti-TRA-1-81 AntibodyMilliporeMAB4381
Anti-Klf4 AntibodyAbcamab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibodyMolecular ProbeA11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibodyMolecular ProbeA11037
DAPIMolecular ProbeD1306
Prolong gold antifade reagentInvitrogenP36934
4% ParaformaldyhydeTech & InnovationBPP-9004
Tween 20BIOSESANGT1027
Bovine Serum AlbuminVector LabSP-5050
Anti-Collagen II antibodyabcam ab347121:100
Alcian blueSigma AldrichA3157-10G
Fast Green FCFSigma AldrichF7252-25G
Safranin OSigma Aldrich090m0039v
Nuclear fast redAmericanmastertechSTNFR100 
xyleneDuksan115 
EthanolDuksan64-17-5
Mayer's hematoxylin solutionwako pure chemical industriesLAK7534
DAPVECTOR LABORATORIESSK-4100
Slide Glass, CoatedHyun Il Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
ChloroformSigma Aldrich366919
IsoprypylalcoholMillipore109634
EthanolDuksan64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kitThermo ScientficK1622
NameCompanyCatalog NumberDescription
Chondrogenic Differentiation Materials
DMEMLife Technologies11885Chondrogenic media component (500 mL)
Penicilin StreptomycinLife TechnologiesP4333Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
Ascorbic AcidSigma AldrichA8960Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL) 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Life Technologies11140-050Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2R&D355-BM-050Chondrogenic media component (Conc.:100 ng/ml)
Recombinant Hman TGF-beta3R&D243-B3-002Chondrogenic media component (Conc.:10 ng/ml)
KnockOut Serum ReplacementLife Technologies10828-028Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
ITS+ PremixBD354352Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
Dexamethasone-Water Soluble Sigma AldrichD2915-100MGChondrogenic media component (Conc.:10-7 M)
GlutaMAX SupplementLife Technologies35050-061Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
Sodium pyruvate solutionSigma AldrichS8636Chondrogenic media component (Conc.: 1%)
L-ProlineSigma AldrichP5607-25GChondrogenic media component (40 μg/ml)

References

  1. van Osch, G. J., et al. Cartilage repair: past and future--lessons for regenerative medicine. J Cell Mol Med. 13 (5), 792-810 (2009).
  2. Ahmed, T. A., Hincke, M. T. Strategies for articular cartilage lesion repair and functional restoration. Tissue Eng Part B Rev. 16 (3), 305-329 (2010).
  3. Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
  4. Solchaga, L. A., Penick, K., Goldberg, V. M., Caplan, A. I., Welter, J. F. Fibroblast growth factor-2 enhances proliferation and delays loss of chondrogenic potential in human adult bone-marrow-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1009-1019 (2010).
  5. Guzzo, R. M., Drissi, H. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Chondrocytes. Methods Mol Biol. 1340, 79-95 (2015).
  6. Drissi, H., Gibson, J. D., Guzzo, R. M., Xu, R. H. Derivation and Chondrogenic Commitment of Human Embryonic Stem Cell-Derived Mesenchymal Progenitors. Methods Mol Biol. 1340, 65-78 (2015).
  7. Nejadnik, H., et al. Improved approach for chondrogenic differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 11 (2), 242-253 (2015).
  8. Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
  9. Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
  10. Ko, J. Y., Kim, K. I., Park, S., Im, G. I. In vitro chondrogenesis and in vivo repair of osteochondral defect with human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (11), 3571-3581 (2014).
  11. Nam, Y., Rim, Y. A., Jung, S. M., Ju, J. H. Cord blood cell-derived iPSCs as a new candidate for chondrogenic differentiation and cartilage regeneration. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 16 (2017).
  12. Hotten, G. C., et al. Recombinant human growth/differentiation factor 5 stimulates mesenchyme aggregation and chondrogenesis responsible for the skeletal development of limbs. Growth Factors. 13 (1-2), 65-74 (1996).
  13. Murphy, M. K., Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. TGF-beta1, GDF-5, and BMP-2 stimulation induces chondrogenesis in expanded human articular chondrocytes and marrow-derived stromal cells. Stem Cells. 33 (3), 762-773 (2015).
  14. Shintani, N., Siebenrock, K. A., Hunziker, E. B. TGF-ss1 enhances the BMP-2-induced chondrogenesis of bovine synovial explants and arrests downstream differentiation at an early stage of hypertrophy. PLoS One. 8 (1), e53086 (2013).
  15. Fukumoto, T., et al. Combined effects of insulin-like growth factor-1 and transforming growth factor-beta1 on periosteal mesenchymal cells during chondrogenesis in vitro. Osteoarthritis Cartilage. 11 (1), 55-64 (2003).
  16. Worster, A. A., Nixon, A. J., Brower-Toland, B. D., Williams, J. Effect of transforming growth factor beta1 on chondrogenic differentiation of cultured equine mesenchymal stem cells. Am J Vet Res. 61 (9), 1003-1010 (2000).
  17. Knippenberg, M., et al. Differential effects of bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-beta1 on gene expression of collagen-modifying enzymes in human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 15 (8), 2213-2225 (2009).
  18. Jang, Y., et al. Centrifugal gravity-induced BMP4 induces chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells via SOX9 upregulation. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 184 (2016).
  19. Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Res Ther. 6, 144 (2015).
  20. Tao, H., et al. Biological evaluation of human degenerated nucleus pulposus cells in functionalized self-assembling peptide nanofiber hydrogel scaffold. Tissue Eng Part A. 20 (11-12), 1621-1631 (2014).
  21. Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Reger, R. L., Prockop, D. J. Comparison of effect of BMP-2, -4, and -6 on in vitro cartilage formation of human adult stem cells from bone marrow stroma. Cell Tissue Res. 320 (2), 269-276 (2005).
  22. Shen, B., Wei, A., Tao, H., Diwan, A. D., Ma, D. D. BMP-2 enhances TGF-beta3-mediated chondrogenic differentiation of human bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells in alginate bead culture. Tissue Eng Part A. 15 (6), 1311-1320 (2009).
  23. Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J Vis Exp. (118), (2016).
  24. Kim, Y., et al. The Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Blood Cells: An Efficient Protocol Using Serial Plating of Reprogrammed Cells by Centrifugation. Stem Cells Int. 2016, 1329459 (2016).
  25. Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
  26. Toh, W. S., et al. Differentiation and enrichment of expandable chondrogenic cells from human embryonic stem cells in vitro. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3570-3590 (2009).
  27. Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Derivation of chondrogenically-committed cells from human embryonic cells for cartilage tissue regeneration. PLoS One. 3 (6), e2498 (2008).
  28. Nakagawa, T., Lee, S. Y., Reddi, A. H. Induction of chondrogenesis from human embryonic stem cells without embryoid body formation by bone morphogenetic protein 7 and transforming growth factor beta1. Arthritis Rheum. 60 (12), 3686-3692 (2009).
  29. Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
  30. Rim, Y. A., Park, N., Nam, Y., Ju, J. H. Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients. J Vis Exp. (116), (2016).
  31. Pfaff, N., et al. Efficient hematopoietic redifferentiation of induced pluripotent stem cells derived from primitive murine bone marrow cells. Stem Cells Dev. 21 (5), 689-701 (2012).
  32. Xu, H., et al. Highly efficient derivation of ventricular cardiomyocytes from induced pluripotent stem cells with a distinct epigenetic signature. Cell Res. 22 (1), 142-154 (2012).
  33. Lee, S. B., et al. Contribution of hepatic lineage stage-specific donor memory to the differential potential of induced mouse pluripotent stem cells. Stem Cells. 30 (5), 997-1007 (2012).
  34. Hu, S., et al. Effects of cellular origin on differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells. JCI Insight. 1 (8), 1-12 (2016).
  35. Vonk, L. A., de Windt, T. S., Slaper-Cortenbach, I. C., Saris, D. B. Autologous, allogeneic, induced pluripotent stem cell or a combination stem cell therapy? Where are we headed in cartilage repair and why: a concise review. Stem Cell Res Ther. 6 (94), 1-11 (2015).
  36. Gomez-Leduc, T., et al. Chondrogenic commitment of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in collagen matrices for cartilage engineering. Sci Rep. 6, 32786 (2016).
  37. Mareschi, K., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells: bone marrow versus umbilical cord blood. Haematologica. 86 (10), 1099-1100 (2001).
  38. Wexler, S. A., et al. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal 'stem' cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. Br J Haematol. 121 (2), 368-374 (2003).
  39. Zhang, X., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood: reevaluation of critical factors for successful isolation and high ability to proliferate and differentiate to chondrocytes as compared to mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose tissue. J Cell Biochem. 112 (4), 1206-1218 (2011).
  40. Wagner, W., et al. Replicative senescence of mesenchymal stem cells: a continuous and organized process. PLoS One. 3 (5), e2213 (2008).
  41. Tarte, K., et al. Clinical-grade production of human mesenchymal stromal cells: occurrence of aneuploidy without transformation. Blood. 115 (8), 1549-1553 (2010).
  42. Chen, W. C., et al. Prediction of poor survival by cyclooxygenase-2 in patients with T4 nasopharyngeal cancer treated by radiation therapy: clinical and in vitro studies. Head Neck. 27 (6), 503-512 (2005).
  43. Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

124pluripotentchondrocyteschondrogenicchondrogenic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved