激光多普勒: 一种测量胰岛微血管血管舒缩体内的工具

摘要

胰岛微血管血管舒缩调节胰岛血液分布, 维持胰岛β细胞的生理功能。本协议描述了使用激光多普勒显示器测定胰岛微血管血管舒缩在体内的功能状态, 并评估胰岛微循环对胰腺相关疾病的贡献。

摘要

微血管血管舒缩作为微循环的功能性状态, 对于氧气和养分的输送以及二氧化碳和废弃物的去除具有重要意义。微血管血管舒缩的损伤可能是微循环相关疾病发展的关键步骤。此外, 高血管化胰岛适应内分泌功能。在这方面, 似乎可以推断胰岛微血管血管舒缩的功能状态可能影响胰岛功能。胰岛微血管血管舒缩功能状态的病理变化分析可能是确定胰岛微循环对相关疾病如糖尿病的贡献的可行策略,胰腺炎,等。因此, 本协议描述使用激光多普勒血流监测仪确定胰岛微血管血管舒缩的功能状态, 建立参数 (包括平均血流灌注、振幅、频率和相对胰岛微血管血管舒缩的速度, 用于评价微循环功能状态。在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中, 我们观察到胰岛微血管血管舒缩功能状态受损。总之, 这种评估胰岛微血管血管舒缩在体内的方法可能揭示与胰岛疾病有关的机制。

引言

微血管血管舒缩作为微循环功能状态的一个参数, 负责氧气、营养素和荷尔蒙的传递和交换, 对去除代谢产物, 如二氧化碳和细胞浪费至关重要。¹. 微血管血管舒缩还调节血液流量分布和组织灌注, 从而影响局部微循环血压和炎症反应, 可诱发多种疾病的水肿。因此, 微血管血管舒缩对维持器官的生理功能非常^重要2, 3, 4, 组织和组件单元格.微血管血管舒缩的损害可能是发展微循环相关疾病的关键步骤^之一5。

激光多普勒初步发展为观察和定量在微循环研究领域的⁶。该技术与其他技术方法 (例如,激光散斑⁷, 经皮氧,等) 一起被认为是评价微循环血流的黄金标准。根据多普勒移位原理, 用激光多普勒装置测定局部微循环 (即,毛细血管, 动脉, 静脉,等) 的血流灌注的基本原理。当光粒子遇到微血管中的运动血细胞时, 受激发射光的波长和频率会发生变化, 或者保持不变。因此, 在微循环中, 血细胞的数量和速度是与多普勒转移光的大小和频率分布有关的关键因素, 而微血管血流方向则无关紧要。使用不同的方法, 各种组织已被用于微循环研究, 包括 mesenteries 和背皮脂室的小鼠, 大鼠, 仓鼠, 甚至人类⁸。然而, 在本协议中, 我们重点研究胰岛微血管血管舒缩的功能状态, 用激光多普勒和自制的评价参数系统进行评价。

胰岛微循环主要由胰岛微血管构成, 表现出鲜明的特征。胰岛毛细血管网络显示五倍以上的密度比毛细管网络的外分泌对应⁹。胰岛内皮细胞提供输入葡萄糖和传播胰岛素的导管, 将氧气传递给胰岛β细胞代谢活性细胞。此外, 新的证据也表明, 胰岛微血管不仅涉及调节胰岛素基因表达和β细胞生存, 而且还影响β细胞功能;促进β细胞增殖;并产生一些血管活性、血管生成物质和生长因子¹⁰。因此, 在这方面, 我们推断胰岛微血管血管舒缩的功能状态可能影响胰岛β细胞功能, 并参与疾病的发病机制, 如急性/慢性胰腺炎, 糖尿病等与胰腺有关的疾病。

分析胰岛微血管血管舒缩功能状态的病理变化可能是确定胰岛微循环对上述疾病贡献的可行策略。详细的分步过程描述的方法, 以确定胰岛微血管血管舒缩在体内提供这里。然后, 将在代表性结果中显示典型的度量值。最后, 在讨论中突出显示方法的优点和限制, 以及进一步的应用程序。

研究方案

所有动物实验都是按照所有相关的指导方针、法规和监管机构执行的。目前正在示范的这项议定书是在北京协和医学院 (PUMC) 的微循环动物伦理委员会 (IMAEC) 的指导和批准下进行的。

1. 动物

1. 实验开始前, 在 5%-小时的光暗循环下, 保持每笼三 BALB 小鼠, 控制温度 (24 1 摄氏度) 和湿度 (55 @ 12)。允许老鼠免费获得正常的食物和水。
2. 将小鼠随机分为非糖尿病对照组和糖尿病组。用每只老鼠的身体质量准确地称量每只老鼠并计算注射量。
3. 在4小时内快速的小鼠在链脲佐菌素 (STZ) 注射和提供常规水正常的实验日1。
4. 在 pH 值4.3 上制备0.1 米柠檬酸钠缓冲液。将1毫升的溶液放入一个1.5 毫升的离心管中, 用铝箔包裹离心管, 以避免光线暴露。
5. 在使用前, 将在柠檬酸钠缓冲液 (pH 4.3) 中的 STZ 分解为5毫克/毫升的最终工作浓度。
6. 用1毫升注射器和25克针, 用40毫克/千克的剂量, 给糖尿病组腹腔注射 STZ 的老鼠。用相同体积的柠檬酸钠缓冲液注射非糖尿病控制的小鼠 (pH 为 4.3)。
7. 把老鼠放回笼子里, 用普通的食物和10% 的蔗糖水供给它们。
8. 在实验日2到 5 (即,连续4天) 重复步骤 1.3-1.7。
9. 在最后一次注射后, 用常规水代替10% 的蔗糖水。
10. 将小鼠快速6小时, 但给他们免费获得水, 并测量他们的血糖水平九天后 (实验日 14)。从尾部静脉收集血液样本, 用血糖监测系统确认高血糖。
    注: 血糖水平 > 200 毫克/dL 的老鼠被认为是糖尿病。

2. 文书的编写

1. 用软的非研磨布清洁激光多普勒装置探头尖端和探头接头的光学表面, 以除去任何灰尘或微粒。将电缆插入仪器的端口 (图 1A)。
2. 通过允许焊剂标准与实验环境 (室温, 通常为30分钟) 的热平衡来装配校准架。轻轻摇动焊剂标准十年代, 让它休息2分钟。
3. 将通量标准容器放置在校准基座的中间。将夹具调整到最大高度, 并将夹具中的探头固定, 使其向下指向容器。确保磁通标准正确定位在探头下方。
4. 慢慢地将探头向下移动, 直到刀尖正确地浸入通量标准中。选择并按下激光多普勒装置的 "校准", 选择探头连接到的工作通道。运行校准程序, 直到 "校准成功" 的通知显示在屏幕上的激光多普勒仪器。
5. 使用探头持有者来保护探头。手动保护探头以避免移动。
6. 保持实验室恒温 (24 1 摄氏度) 和湿度 (~ 50-60%)。
7. 在进行实验前, 关闭任何外部光源 (如荧光灯和光斑灯), 以避免外部光线诱发的变化。

3. 动物的准备

1. 对手术器械进行高压灭菌, 在使用前使其降温至室温。
2. 用激光多普勒检测胰岛微血管血管舒缩, 给小鼠10分钟的适应实验环境。
3. 用1毫升3% 戊巴比妥钠填充1毫升注射器。注射戊巴比妥钠溶液 (75 毫克/千克 ip) 麻醉小鼠。
4. 用预湿的医用纱布遮住老鼠的眼睛, 以防干燥。
5. 确保鼠标完全失去知觉, 不再响应尾巴或 hindfoot 捏钳。在麻醉和手术中每15分钟监测麻醉情况, 必要时补充10% 的戊巴比妥溶液的初始注射量。
6. 在动物下方放置一个半绝缘层的加热垫, 将动物置于仰卧位置, 将其转移到激光多普勒装置的工作台。用手术胶带将鼠标固定在工作平台上。
7. 用 betadine 拭去老鼠的腹部皮肤, 然后用75% 乙醇擦拭腹部清洁。
8. 注射2% 利多卡因/0.5% 布比卡因 (50/50) 混合物皮下。 在纱布海绵的中心切一个直径为3厘米的孔。用纱布海绵覆盖腹部区域。
9. 用手术刀或皮剪刀在腹部中线上用镊子抬起腹部皮肤。
10. 用钳和切口抓住底层肌肉进入腹腔。不要伤害任何器官。将皮肤和底层肌肉折叠在胸前, 露出腹腔。用一双钝鼻钳轻轻地将胰体和脾脏暴露出来。

4. 数据获取分析

1. 通过点击 "文件" → "新建" 来创建一个新的测量文件, 运行激光多普勒装置的软件。要配置已连接的监视器, 请在 "常规" 选项卡下, 将监视持续时间设置为 "自由运行"。使用出厂默认值 "监视器" 选项卡. 单击 "下一步"。
2. 在 "显示设置" 对话框中设置图形显示。通过检查各个框, 选择 "通量、轻质、速度" 通道。选择以下参数: "通道的数据源" 和 "标签、单位和颜色"。单击 "下一步"。
3. 在 "文件信息" 对话框中输入有关主题和度量 (即名称和主题编号、运算符、监视时间、注释、等) 的用户信息, 然后单击 "下一步" 以完成测量配置。
   注意: 测量窗口由软件自动创建 (图 1B)。
4. 手动将电极推进胰腺。确保探头与胰腺组织之间的距离在1毫米以内。不适当的距离会人为地增加或减少血流读数。
5. 单击 "开始" 工具栏图标开始记录微血管血流灌注单元 (PU) 数据。每次运行时连续收集 PU 数据1分钟。单击 "停止" 以停止测量。选择 "文件" → "另存为" 以命名并保存完成的测量文件。
6. 每次运行后手动重新定位探头, 以避免附加效果和收缩和松弛容量的局部耗尽。重复步骤 4.1-4.4 收获多点 (即,三随机选择点从胰腺组织) 微血管 PU 数据为每只老鼠。测量非反射板的 PU 数据作为基线控制。
7. 用缝合闭合腹部肌肉层和皮肤层。实验后把动物放在干净的笼子里。
8. 把恢复笼半放在加热垫上, 保持动物的保暖。
   注意: 注意保暖、卫生、液体和食物摄取, 以及感染。对2毫克/千克卡洛芬的小鼠进行48小时的术后疼痛管理。 当观察到小鼠处于严重的疼痛或窘迫状态时, 注射150毫克/千克戊巴比妥钠, 以此来进行安乐死。

5. 微血管血管舒缩参数的计算

1. 使用激光多普勒软件的 "导出" 命令将时间和 PU 原始数据导出为 xlsx 文件, 并在电子表格中打开该文件。
2. 计算平均基线灌注单元 (PU_b) (请参见步骤 4.6)。
3. 计算平均血液灌注 (pu_a) 的测量值为1分钟, 如下所示: 平均血液灌注 (pu_a) = 浦-浦_b (等式 1)。
4. 计算每1分钟测量的频率 (周期/分钟)。
   注: 微血管血管舒缩的频率定义为每分钟微血管血管舒缩波发生的峰值数。
5. 计算每1分钟测量的振幅 (ΔPU)。
   1. 计算微血管血管舒缩的振幅为最大值 (_浦max) 和最小值 (_浦min) 的差异: 振幅 (ΔPU) =_PU最大-_浦最小 (等式 2)。
6. 计算每1分钟测量的相对速度 (PU)。

结果

在图 1A中显示了配备半导体激光二极管的微血管血管舒缩测量激光多普勒装置的照片。用户界面软件显示在图 1B中。采用上述方法, 对非糖尿病对照和糖尿病小鼠胰岛微血管血管舒缩的血流动力学参数进行检测。许多技术, 包括激光多普勒血流仪, 反射和散射光, 红外光谱和成像技术, 已被用来研究微血管血管舒缩, 因为它是首次?...

讨论

在涉及微血管功能障碍的病例中 (例如,糖尿病、急性胰腺炎、周围微血管疾病、等), 一些疾病导致血流减少。除了血液流动的变化, 还有重要的指标, 如微血管血管舒缩, 反映微循环的功能状态。具体指标, 微血管血管舒缩, 一般被定义为微血管的音调在微血管床上的振荡。在本协议中, 微血管血流灌注监测系统允许对微血管血管舒缩的功能状态进行直接的可视化和定量分析。我们的微?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MoorVMS-LDF2	Moor Instruments	GI80	PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) can be used as an alternative apparatus to harvest data
MoorVMS-PC Software	Moor Instruments	GI80-1	Software of MoorVMS-LDF2
Calibration stand	Moor Instruments	GI-cal	Calibration tool
Calibration base	Moor Instruments	GI-cal	Calibration tool
Calibration flux standard	Moor Instruments	GI-cal	Calibration tool
One Touch UltraEasy glucometer	Johnson and Johnson	#1955685	Confirm hyperglycemia
One Touch UltraEasy strips	Johnson and Johnson	#1297006	Confirm hyperglycemia
Streptozotocin	Sigma-Aldrich	S0130	Dissolve in sodium citrate buffer (pH 4.3)
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	Working concentration 3 %
Ethanol	Sinopharm Inc.	200121	Working concentration 75 %
Sucrose	Amresco	335	Working concentration 10 %
Medical gauze	China Health Materials Co.	S-7112	Surgical
Blunt-nose forceps	Shang Hai Surgical Instruments Inc.	N-551	Surgical
Surgical tapes	3M Company	3664CU	Surgical
Gauze sponge	Fu Kang Sen Medical Device CO.	BB5447	Surgical
Scalpel	Yu Lin Surgical Instruments Inc.	175C	Surgical
Skin scissor	Carent	255-17	Surgical
Suture	Ning Bo Surgical Instruments Inc.	3325-77	Surgical
Syringe and 25-G needle	MISAWA Inc.	3731-2011	Scale: 1 ml