레이저 도플러: 췌 장 섬 Microvascular Vasomotion에 Vivo에서 측정 하기 위한 도구

요약

췌 장 섬 microvascular vasomotion 섬 혈액 분포를 조절 하 고 섬 β 세포의 생리 기능을 유지 합니다. 이 프로토콜은 췌 장 섬 microvascular vasomotion에 vivo에서 의 기능 상태를 확인 하 고 췌 장 섬 미세 췌 장 관련 질병에의 기여를 평가 하는 레이저 도플러 모니터를 사용 하 여 설명 합니다.

초록

미세 혈관의 기능 상태, microvascular vasomotion 산소와 영양분의 공급과 이산화탄소와 폐기물의 제거에 대 한 중요 하다. Microvascular vasomotion의 장애는 미세 혈관 관련 질병의 발달에 있는 중요 한 단계를 수 있습니다. 또한, 매우 vascularized 췌 장 섬 내 분 비 기능을 지원 하기 위해 적응입니다. 이 점에서 그것은 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 기능 상태 췌 장 섬 기능에 영향을 수 있습니다 추론 가능한 보인다. 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 기능 상태의 병 적인 변화를 분석 기여를 결정 하는 가능한 전략 있을 수 있습니다 그 췌 장 섬 미세 혈관 관련된 질환, 당뇨병 mellitus, 같은 게 췌 장 염, 등. 따라서,이 프로토콜은 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 기능 상태를 확인 하 고 설정 매개 변수 (평균 혈액 관류, 진폭, 주파수, 및 상대를 포함 하는 레이저 도플러 혈액 흐름 모니터를 사용 하 여 설명 합니다. 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 속도) microcirculatory 기능 상태의 평가 위해. Streptozotocin 유도 당뇨 마우스 모델에서 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 장애인된 기능 상태를 관찰합니다. 결론적으로, 췌 장 섬 microvascular vasomotion에 vivo에서 평가 하기 위한이 방법은 췌 장 섬 질병에 관련 된 메커니즘을 계시 할지도 모른다.

서문

미세 혈관의 기능 상태를 매개로 microvascular vasomotion 납품 및 산소, 영양분, 호르몬의 교환에 대 한 책임 및 대사 제품, 이산화 탄소, 세포 폐기물 등의 제거에 중요 한 ¹. microvascular vasomotion 또한 혈액 흐름 분포 및 따라서 로컬 microcirculatory 혈압과 염증, 부 종에 많은 질병을 일으킬 수 있는 응답을 영향을 미치는 조직 관류를 조절. 따라서, microvascular vasomotion 장기^2,3,4, 조직 및 구성 세포의 생리 기능을 유지 하기 위해 매우 중요 하다. Microvascular vasomotion의 장애는 미세 혈관 관련 질병⁵의 개발에 중요 한 단계 중 하나를 수 있습니다.

레이저 도플러 관측 및 미세 혈관 연구⁶의 분야에서 정량화 처음 개발 되었다. 이 기술은 다른 기술 방식 (예: 레이저 반점⁷, 경 피 성 산소, 등등), 함께 미세 혈관에 혈 류를 평가 하기 위한 황금 표준으로 여겨 왔다. 근거 (즉, 모 세관, arterioles, venules, 등) 로컬 미세의 혈액 관류 장치 레이저 도플러, 장비에 의해 결정 될 수 있다 도플러 이동 원리를 기반으로 합니다. 파장 및 유도 방출 빛의 주파수 변경 microvessels에서 이동 혈액 세포를 발생 하는 빛 입자 또는 그들은 변경 되지 않습니다. 따라서 미세 혈관, 혈액 세포의 속도 수 microvascular 혈액 흐름 방향은 관련 동안 크기 및 도플러 이동 빛의 주파수 분배에 관련 된 중요 한 요소는. 다른 방법을 사용 하 여, 다양 한 조직 microcirculatory 연구는 mesenteries를 포함 하 여 사용 되 고 지 느 러 미, 생쥐의 피부 집계로 챔버 쥐, 햄스터, 그리고 심지어 인간⁸. 그러나, 현재 프로토콜에서 우리는 기능에 초점을 사용 하 여 계산 되는 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 상태 레이저 도플러 및 수 제 평가 매개 변수 시스템.

췌 장 섬 미세 주로 췌 장 섬 microvessels의 구성 이며, 독특한 특징을 전시. 췌 장 섬 모 세관 네트워크의 exocrine 대응⁹의 모 세관 네트워크 보다 5 배 높은 밀도 보여 줍니다. 입력된 포도 당 및 인슐린은 목표에 대 한 도관을 제공, 섬 내 피 세포 제공 산소 metabolically 활성 셀 섬에 β 세포. 또한, 증거를 신흥 보여 섬 microvessels; β-세포의 기능에 영향을 미치는에서 뿐만 아니라 인슐린 유전자 발현과 β-세포 생존 조절에 뿐만 아니라 관련 된 β-세포 증식; 홍보 그리고, vasoactive 신생 물질 및 성장 요인¹⁰의 수를 생산. 따라서,이 점에서 우리는 추측할 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 기능 상태 섬 β-세포 기능에 영향을 미칠 수 있습니다 및 급성/만성 췌 장 염, 당뇨병 및 다른 질병의 병 인에 관여 췌 장 관련 질병입니다.

췌 장 섬 microvascular vasomotion의 기능 상태의 병 적인 변화를 분석 하는 것은 위에서 언급 한 질병에 췌 장 섬 미세의 기여를 결정 하는 가능한 전략 될 수도 있습니다. 여기 췌 장 섬 microvascular vasomotion에 vivo에서 결정 하는 접근을 설명 하는 자세한 단계별 절차를 제공 합니다. 일반적인 측정 대표 결과에 표시 됩니다. 마지막으로, 이점 및 방법의 제한 토론, 추가 응용 프로그램 함께 강조 표시 됩니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관에 따라 실행 했다. 지도 및 승인의는 연구소의 미세 동물 윤리 위원회 (IMAEC)에 베이징 조합 의학 대학 (PUMC) 현재 프로토콜 입증 되 고 수행 되었다.

1입니다. 동물

1. 실험을 시작 하기 전에 12-h 빛 어두운 주기의 아래 케이지, 제어 온도 (24 ± 1 ℃)와 습도 (55 ± 5%), 3 개의 BALB/c 마우스를 유지. 일반 식품 및 물 쥐를 수 있습니다.
2. 임의로 나눌 쥐 비 당뇨병 제어 그룹 및 당뇨병 그룹. 정확 하 게 각 개별 마우스 무게 고 각 마우스의 몸 질량을 사용 하 여 주입 볼륨을 계산.
3. Streptozotocin (STZ) 주입 하기 전에 4 h에 대 한 마우스를 빨리 하 고 실험 주 1에 정상적으로 정기적으로 물을 제공 합니다.
4. PH 4.3에서 0.1 M 나트륨 구 연산 염 버퍼를 준비 합니다. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에는 솔루션의 1 mL를 넣고 microcentrifuge 튜브 빛에 노출을 피하기 위해 알루미늄 호 일에 포장.
5. 나트륨 구 연산 염 버퍼 (pH 4.3) 사용 하기 전에 5 mg/mL의 최종 작업 집중에에서 STZ 해산.
6. 1 mL 주사기 25 G 바늘을 사용 하 여 40 mg/kg의 복용량에 STZ의 당뇨병 그룹 복 주사의 쥐를 제공 합니다. 나트륨 구 연산 염 버퍼 (pH 4.3)의 동일한 양으로 비 당뇨병 컨트롤의 마우스를 주사.
7. 다시 감 금 소에 쥐를 넣어 하 고 일반 식품 및 10% 자당 물 공급.
8. 실험적인 일 2-5 (즉, 다음 4 일 연속)에 1.3-1.7 단계를 반복 합니다.
9. 마지막 STZ 주입 후 10% 자당 물 일반 물으로 교체 합니다.
10. 빠른 6 h에 대 한 마우스는 하지만 그들에 게 물에 자유 접근을 9 일 후 (실험 하루 14) 그들의 혈액 포도 당 수치를 측정 합니다. 혈액 포도 당 모니터링 시스템을 사용 하 여 혈당을 확인 하는 꼬리 정 맥에서 혈액 샘플을 수집 합니다.
    참고: 마우스 혈액 포도 당 수준 > 200 mg/dL로 당뇨병 간주 됩니다.

2입니다. 악기의 준비

1. 프로브 팁의 광학 표면 및 입자 또는 어떤 먼지 든 지 제거 하는 부드러운, 비-연마 천으로 레이저 도플러 장치의 프로브 커넥터 청소. 악기 (그림 1A)의 포트에 케이블을 꽂습니다.
2. 플럭스를 실험 주위 (일반적으로 30 분 동안 실내 온도) 열 평형에 표준 함으로써 교정 스탠드를 조립. 유량을 흔들어 부드럽게 10 s 및 하자에 대 한 표준 2 분 동안 휴식.
3. 교정 자료 가운데 플럭스 표준 컨테이너를 배치 합니다. 최대 높이에 클램프를 조정 하 고 같은 컨테이너 아래쪽으로 가리키도록 클램프에 프로브를 보호. 플럭스 표준 프로브 아래 올바르게 놓였는지 확인 하십시오.
4. 팁은 제대로 플럭스 표준에 빠져들 때까지 천천히 아래로 프로브를 이동 합니다. 고 레이저 도플러 장치에 "교정"를 눌러 선택한 프로브에 연결 되어 작동 채널을 선택 합니다. "성공적인 교정" 통지 레이저 도플러 장치 화면에 표시 될 때까지 교정 프로그램을 실행 합니다.
5. 프로브 프로브 홀더를 사용 하 여 보호 합니다. 수동으로 보안을 피하기 위해 운동 조사.
6. 일정 온도 (24 ± 1 ° C)에서 실험 룸과 습도 (50 ~ 60%)를 유지 합니다.
7. 외부 빛 유도 된 변화를 피하기 위해 실험을 수행 하기 전에 모든 외부 빛 (형광등 및 스폿 램프) 등을 해제 합니다.

3입니다. 동물의 준비

1. 압력솥은 수술 장비와 사용 하기 전에 실내 온도에 냉각 하도록 허용.
2. 쥐에 게 췌 장 섬 microvascular vasomotion 레이저 도플러에 의해 검출 하기 전에 실험 환경에 순응을 10 분.
3. 3 %pentobarbital 나트륨의 1 mL에 1 mL 주사기를 채우십시오. Anesthetize 쥐 pentobarbital 나트륨 솔루션 (i.p. 75 mg/kg)을 주입.
4. 건조를 방지 하기 위해 미리 moistened 의료 거 즈와 마우스의 눈을 커버.
5. 마우스의 식을 완전히 잃는다 고 꼬리에 더 이상 응답 또는 hindfoot pinches 집게와 확인 하십시오. 필요한 경우 pentobarbital 솔루션의 초기 주입 볼륨의 10% 보완 하 여 마 취를 유지 하는 15 분 마다 마 취와 내부 요원 이벤트를 통해 마 취를 모니터링 합니다.
6. 동물 아래 반 격리 층을 가진 난방 패드를 배치 하 고 동물 부정사 위치에 놓고 레이저 도플러 장치 작업 역에 그것을 전송. 외과 테이프 작업 플랫폼에 마우스를 수정 합니다.
7. 면봉, betadine 그리고 75% 에탄올으로 마우스의 복 부 피부는 복 부 지역 깨끗 한 면봉을 사용 됩니다.
8. 2% lidocaine/0.5% bupivacaine (50/50) 혼합물을 피하 주사.  ~ 3 cm를 잘라-거 즈 갯 솜의 중앙에 직경 구멍. 거 즈 스폰지와 복 부 지역 커버.
9. 집게와 복 부 피부를 들어올리고 메스 또는 피부가 위를 사용 하 여 복 부의 정중 선 따라 초기 수직 절 개 합니다.
10. 집게와 기본 근육을 잡고 복 부 구멍을 입력을 incise. 어떤 장기를 다치게 하지 않습니다. 가슴 복 부 구멍을 통해 피부와 내부 근육을 접어. 부드럽게 췌 장 몸과 무딘 코 집게의 쌍을 사용 하 여 비장을 노출 합니다.

4. 데이터 수집 분석

1. 클릭 하 여 레이저 도플러 장치 소프트웨어를 실행 하 여 "파일" → "New" 새로운 측정 파일을 만듭니다. "일반" 탭에서 연결 된 모니터를 구성 하려면 설정 모니터링 기간을 "무료로 실행 합니다." "LDF 모니터" 탭 "다음"을 클릭에 대 한 기본값을 사용 하 여
2. "디스플레이 설정 대화 상자."에서 그래프 표시 설정 해당 상자를 선택 하 여 "플럭스, 광, 속도" 채널을 선택 합니다. 다음 매개 변수를 선택: "채널에 대 한 데이터 소스" 및 "레이블, 단위 그리고 색." 다음 클릭 합니다 "."
3. "파일 정보 대화 상자"에서 주제 및 측정 (즉, 이름 및 제목 번호, 연산자, 모니터링 시간, 의견, 등)에 대 한 사용자 정보를 입력 하 고 측정 구성 완료 "다음"을 클릭 합니다.
   참고: 측정 창 (그림 1B) 소프트웨어에 의해 자동으로 만들어집니다.
4. 수동으로 췌 전극 진행. 프로브 및 췌 장 조직 사이의 거리가 1 m m 이내 다는 것을 확인 하십시오. 부적 절 한 거리를 인위적으로 증가 또는 감소 혈액 흐름 읽기를 제공합니다.
5. Microvascular 혈액 관류 단위 (PU) 데이터를 녹음을 시작 "시작" 도구 모음 아이콘을 클릭 합니다. 모든 실행 1 분 동안 지속적으로 PU 데이터를 수집 합니다. "중지" 측정을 중지 하려면 클릭 합니다. 선택 "파일" → "다른 이름으로 저장" 이름 하 고 완성 된 측정 파일 저장.
6. 수동으로 첨가제 효과 수축의 지역화 된 피로 피하기 위해 각 실행 후 프로브를 위치 및 휴식. 각 마우스에 대 한 다 지점 (즉, 3 췌 장 조직에서 무작위로 선택한 포인트) microvascular PU 데이터 수확 4.1-4.4 단계 반복 합니다. 기준 컨트롤 아닌 반사 판의 PU 데이터를 측정 합니다.
7. 복 부 근육 층과 피부 레이어는 봉합 사를 닫습니다. 실험 후 깨끗 한 장에 동물을 놓습니다.
8. 난방 패드 절반에 복구 케이지를 배치 하 여 동물 따뜻한을 유지.
   참고: 주의 온 정, 위생, 액체 및 음식 섭취 및 감염. 수술 후 통증 관리로 2 mg/kg Carprofen 48 h와 마우스를 관리.  마우스는 심한 통증이 나 고통 완화 될 수 없는 상태에 있을 때 pentobarbital 나트륨 i.p. 150 mg/kg을 주입 하 여 안락사를 수행 합니다.

5. Microvascular Vasomotion의 매개 변수 계산

1. 레이저 도플러 소프트웨어의 "내보내기" 명령을 사용 하 여 시간 및 PU 원시 데이터를 *.xlsx 파일로 내보내고 스프레드시트에서 파일을 엽니다.
2. 평균 초기 관류 장치 (PU_b) 계산 (단계 4.6 참조).
3. 평균 혈액 관류 (PU_는) 측정의 1 분을 다음과 같이 계산: 혈액 관류 (PU_는) 평균 = PU-PU_b (식 1).
4. 측정 각 1 분에 대 한 주파수 (사이클/분)을 계산 합니다.
   참고: microvascular vasomotion의 주파수는 분당 microvascular vasomotion 웨이브에서 발생 한 봉우리의 수로 정의 됩니다.
5. 측정 각 1 분 진폭 (ΔPU)을 계산 합니다.
   1. Microvascular vasomotion의 진폭 (PU_최대) 최대 및 최소 (PU_분) 간의 차이 계산: 진폭 (ΔPU) = PU_최대 -PU_분 (식 2).
6. 측정 각 1 분에 대 한 상대 속도 (PU)를 계산 합니다.

결과

Microvascular vasomotion 측정 레이저 도플러 기기 반도체 레이저 다이오드를 장착 사진 그림 1A에 표시 됩니다. 그림 1B사용자 인터페이스 소프트웨어를 제공. 위에서 언급 한 방법을 사용 하 여, 췌 장 섬 microvascular vasomotion의 hemodynamic 매개 변수는 비 당뇨병 제어 및 당뇨병 쥐에 대 한 발견 했다. 다양 한 기술, 레이저 도플러 flowmetry?...

토론

Microvascular 역 기능 (예: 당뇨병, 급성 췌 장 염, 주변 microvascular 질병, 등)을 포함 하는 경우, 일부 질병 감소 혈액 흐름 이어질. 혈액의 흐름에 변화, 이외 중요 한 지표, microvascular vasomotion 같은 미세 혈관의 기능 상태를 반영 하는 있다. 특정 표시기, microvascular vasomotion, microvascular 침대에 microvascular 톤의 진동으로 일반적으로 정의 됩니다. 현재 프로토콜 모니터링 시스템 microvascular 혈액...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
MoorVMS-LDF2	Moor Instruments	GI80	PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) can be used as an alternative apparatus to harvest data
MoorVMS-PC Software	Moor Instruments	GI80-1	Software of MoorVMS-LDF2
Calibration stand	Moor Instruments	GI-cal	Calibration tool
Calibration base	Moor Instruments	GI-cal	Calibration tool
Calibration flux standard	Moor Instruments	GI-cal	Calibration tool
One Touch UltraEasy glucometer	Johnson and Johnson	#1955685	Confirm hyperglycemia
One Touch UltraEasy strips	Johnson and Johnson	#1297006	Confirm hyperglycemia
Streptozotocin	Sigma-Aldrich	S0130	Dissolve in sodium citrate buffer (pH 4.3)
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	Working concentration 3 %
Ethanol	Sinopharm Inc.	200121	Working concentration 75 %
Sucrose	Amresco	335	Working concentration 10 %
Medical gauze	China Health Materials Co.	S-7112	Surgical
Blunt-nose forceps	Shang Hai Surgical Instruments Inc.	N-551	Surgical
Surgical tapes	3M Company	3664CU	Surgical
Gauze sponge	Fu Kang Sen Medical Device CO.	BB5447	Surgical
Scalpel	Yu Lin Surgical Instruments Inc.	175C	Surgical
Skin scissor	Carent	255-17	Surgical
Suture	Ning Bo Surgical Instruments Inc.	3325-77	Surgical
Syringe and 25-G needle	MISAWA Inc.	3731-2011	Scale: 1 ml