Laser-Doppler: Ein Instrument zur Messung der Pankreas Islet mikrovaskuläre Vasomotion In Vivo

Zusammenfassung

Pancreatic Islet mikrovaskuläre Vasomotion regelt Inselchen Blut Verteilung und behält die physiologische Funktion der Inselzellen β. Dieses Protokoll beschreibt die Nutzung eines Laser-Doppler-Monitors, funktionalen Status des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion in Vivo zu bestimmen und zu beurteilen, die Beiträge der pankreatischen Inselchen Mikrozirkulation, Bauchspeicheldrüsen-Erkrankungen.

Zusammenfassung

Als funktionelle Status der Mikrozirkulation gilt mikrovaskuläre Vasomotion für die Lieferung von Sauerstoff und Nährstoffen und die Entfernung von Kohlendioxid und Abfallprodukte. Die Beeinträchtigung der mikrovaskuläre Vasomotion könnte ein entscheidender Schritt in der Entwicklung der Mikrozirkulation-Erkrankungen sein. Darüber hinaus eignet sich das stark vaskularisierte Pankreas Inselchen, endokrine Funktion zu unterstützen. In diesem Zusammenhang scheint es möglich zu folgern, dass der funktionelle Status pancreatic Islet mikrovaskuläre Vasomotion pancreatic Islet Funktion beeinträchtigen könnten. Analyse der pathologischen Veränderungen des funktionellen Status des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion möglicherweise eine praktikable Strategie Beiträge bestimmen das Pankreas Inselchen Mikrozirkulation macht verwandte Krankheiten wie Diabetes Mellitus, Pankreatitis, etc.. Daher beschreibt dieses Protokoll mit einer Laser-Doppler Blut-Strömungswächter zur Bestimmung des funktionellen Status des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion und Parameter (einschließlich durchschnittliche Blutperfusion, Amplitude, Frequenz und Verwandten herstellen Geschwindigkeit des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion) für die Bewertung des mikrozirkulatorischen funktionellen Status. In einem Streptozotocin-verursachten zuckerkranken Mausmodell beobachteten wir eine beeinträchtigt Funktionsstatus des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion. Zusammenfassend kann dieser Ansatz für die Beurteilung der Bauchspeicheldrüse Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion in Vivo Mechanismen in Bezug auf Bauchspeicheldrüsenkrebs Inselchen Krankheiten aufdecken.

Einleitung

Als Parameter des funktionellen Status der Mikrozirkulation mikrovaskuläre Vasomotion übernimmt die Verantwortung für die Lieferung und der Austausch von Sauerstoff, Nährstoffen und Hormonen und ist entscheidend für die Beseitigung der Stoffwechselprodukte, wie Kohlendioxid und Zelle Abfall ¹. mikrovaskuläre Vasomotion regelt auch Blut Strömungsverteilung und Gewebedurchblutung und beeinträchtigt dadurch lokale mikrozirkulatorischen Blutdruck und Antworten auf eine Entzündung, die Ödeme bei vielen Krankheiten auslösen können. Mikrovaskuläre Vasomotion ist daher extrem wichtig, die physiologische Funktion der Organe^2,3,4, Gewebe und Zellen Komponente beizubehalten. Die Beeinträchtigung der mikrovaskuläre Vasomotion möglicherweise einer der wichtigsten Schritte bei der Entwicklung der Mikrozirkulation-Erkrankungen⁵.

Laser-Doppler wurde ursprünglich für Beobachtung und Quantifizierung auf dem Gebiet der Mikrozirkulation Forschung⁶entwickelt. Diese Technik, zusammen mit anderen technischen Ansätze (z. B. Laser Speckle⁷, transkutane Sauerstoff, etc.), gilt als der Goldstandard für die Beurteilung der Durchblutung in der Mikrozirkulation. Die Begründung, dass die Durchblutung der lokalen Mikrozirkulation (d.h., Kapillaren, Arteriolen, Venolen, etc.) vom Gerät ausgestattet mit Laser Doppler, ermittelt werden kann basiert auf dem Prinzip der Doppler-Verschiebung. Die Wellenlänge und die Frequenz des Lichtes stimulierte Emission ändern, wenn Lichtteilchen bewegten Blutkörperchen im Mikrogefäßen begegnen oder sie unverändert bleiben. Daher in der Mikrozirkulation sind die Anzahl und die Geschwindigkeit der Blutzellen die Schlüsselfaktoren, die in Bezug auf das Ausmaß und die Verteilung des Lichtes Doppler-verschoben, während die Richtung des mikrovaskulären Blutflusses irrelevant ist. Mit verschiedenen Methoden, eine Vielzahl von Geweben für mikrozirkulatorischen Studien, einschließlich der Mesenterien verwendet wurden und dorsalen Hautfalte Kammern von Mäusen, Ratten, Hamster, und sogar Menschen⁸. Jedoch in das aktuelle Protokoll, wir konzentrieren uns auf den funktionalen Status des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion, die ausgewertet wird mit laser-Doppler und einer hausgemachten Bewertungssystem Parameter.

Pancreatic Islet Mikrozirkulation besteht hauptsächlich aus Pankreas Inselchen Mikrogefäßen und Besonderheiten aufweist. Ein engmaschiges Netz von Pankreas Inselchen zeigt eine fünf Mal höhere Dichte als engmaschiges Netz von seinen exokrine Gegenstück-⁹. Bereitstellung einer Leitung für die Lieferung von Eingabe Glukose und Verbreitung von Insulin, liefern endotheliale Inselzellen Sauerstoff metabolisch aktiven Zellen in kleinen Insel β-Zellen. Darüber hinaus zeigt Anzeichen dafür auch, dass Inselchen Mikrogefäßen beteiligt sind, nicht nur bei der Regulierung von Insulin-gen-Expression und β-Zellen überleben, sondern auch in der β-Zelle Funktion beeinträchtigen; Förderung der β-Zell-Proliferation; und produziert eine Reihe von vasoaktive, angiogene Substanzen und Wachstumsfaktoren¹⁰. Deshalb schließen wir in diesem Zusammenhang, dass der funktionelle Status pancreatic Islet mikrovaskuläre Vasomotion kann Inselchen β-Zell-Funktion beeinflussen und engagieren sich in der Pathogenese von Krankheiten wie akute/chronische Pankreatitis, Diabetes und andere Pankreas-Erkrankungen.

Analyse der pathologischen Veränderungen des funktionellen Status des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion möglicherweise eine praktikable Strategie um die Beiträge der pankreatischen Inselchen Mikrozirkulation zu den oben genannten Krankheiten zu bestimmen. Eine detaillierte Schritt für Schritt Anleitung beschreibt den Ansatz für die Bauchspeicheldrüse Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion in Vivo zu bestimmen bieten hier. Typische Messungen werden dann in den Vertreter Ergebnisseangezeigt. Zu guter Letzt werden die vor- und Nachteile der Methode in der Diskussion, zusammen mit weiteren Anwendungen hervorgehoben.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden hingerichtet, unter Beachtung aller relevanten Richtlinien, Verordnungen und Aufsichtsbehörden. Dieses Protokolls demonstriert wurde unter der Leitung und Genehmigung von dem Institut der Mikrozirkulation Tier Ethik Ausschuss (IMAEC) in Peking Union Medical College (PUMC) durchgeführt.

(1) Tiere

1. Halten Sie vor dem Start des Experiments drei BALB/c Mäuse pro Käfig, mit kontrollierter Temperatur (24 ± 1 ° C) und Luftfeuchtigkeit (55 ± 5 %), unter einem 12-h-hell-dunkel-Zyklus. Lassen Sie die Mäuse freien Zugang zur regelmäßigen Nahrung und Wasser.
2. Nach dem Zufallsprinzip unterteilen Sie die Mäuse in einer nicht-diabetischen Kontrollgruppe und einer diabetischen Gruppe. Genau wiegen Sie jeder einzelnen Maus und berechnen Sie das Injektionsvolumen die Körpermasse jede Maus verwenden.
3. Schnell die Mäuse für 4 h vor Streptozocin (STZ) Injektion und bieten regelmäßiges Wasser wie gewohnt auf experimentelle Tag 1.
4. Bereiten Sie 0,1 M Natrium-Citrat-Puffer bei pH 4,3. Genommen Sie 1 mL der Lösung in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und wickeln Sie den Microcentrifuge Schlauch in Alufolie um Lichteinfall zu vermeiden.
5. Auflösen der STZ in Natrium-Citrat-Puffer (pH 4,3), eine Endkonzentration von Arbeiten von 5 mg/mL vor dem Gebrauch.
6. Geben Sie die Mäuse der Diabetiker Gruppe intraperitoneale Injektion der STZ bei einer Dosis von 40 mg/kg mit einer 1-mL-Spritze und ein 25-G-Nadel. Injizieren Sie die Mäuse von den nicht-Diabetikern Kontrolle mit dem gleichen Volumen der Natrium-Citrat-Puffer (pH 4,3).
7. Setzen Sie die Mäuse wieder in die Käfige und versorgt sie mit regelmäßigen Nahrung und 10 % Saccharose Wasser.
8. Wiederholen Sie die Schritte 1,3-1,7 auf experimentelle Tage 2 bis 5 (d. h., die nächsten 4 aufeinander folgenden Tagen).
9. Ersetzen Sie das 10 % Saccharose-Wasser mit Wasser nach der letzten Injektion STZ.
10. Schnell die Mäuse für 6 h, aber Ihnen freien Zugang zu Wasser, und neun Tage später (experimentelle 14.Tag) ihren Blutzuckerspiegel zu messen. Sammeln Sie eine Blutprobe aus der Rute Vene, Hyperglykämie mit einem Blut-Glukose-monitoring-System zu bestätigen.
    Hinweis: Mäuse mit Blut Glukose Niveau > 200 mg / dL gelten als Diabetiker.

2. Vorbereitung des Instruments

1. Reinigen Sie die optischen Oberflächen der Sondenspitze und Sonde Stecker des Laser Doppler-Gerätes mit einem weichen, nicht scheuernden Tuch, Staub oder Partikel zu entfernen. Stecken Sie das Kabel an den Anschluss des Gerätes (Abb. 1A).
2. Montieren Sie die Kalibrierung Stand dadurch, dass das Flussmittel standard im thermischen Gleichgewicht mit experimentellen Umgebung (Raumtemperatur, in der Regel für 30 min). Schütteln Sie das Flussmittel standard sanft für 10 s und lassen Sie es für 2 min ruhen.
3. Positionieren Sie die Flux-standard-Container in der Mitte der Kalibrierung-Basis. Passen Sie die Klemme auf die maximale Höhe und fixieren Sie die Sonde in die Klemme, so dass es nach unten in den Behälter zeigt. Stellen Sie sicher, dass die Flux-Standard unter der Sonde richtig positioniert ist.
4. Bewegen Sie langsam die Sonde nach unten, bis die Spitze in der Fluss-Norm richtig eingetaucht ist. Wählen Sie und drücken Sie "Kalibrierung" auf der Laser-Doppler-Gerät und den Arbeitskanal, dem mit die Sonde verbunden ist. Führen Sie die Kalibrierungsprogramm, bis ein "Kalibrierung erfolgreich" Hinweis auf dem Bildschirm der Laser-Doppler-Gerät angezeigt wird.
5. Sichern Sie die Sonde mit Sonde Haltern. Manuell sichern Sie die Sonde um Bewegung zu vermeiden.
6. Pflegen Sie Versuchsraum bei konstanter Temperatur (24 ± 1 ° C) und Luftfeuchtigkeit (ca. 50-60 %).
7. Schalten Sie alle Fremdlicht (z. B. Leuchtstoffröhren und spot Lampen) vor der Durchführung des Experiments um externe Licht-induzierten Veränderung zu vermeiden.

3. Vorbereitung der Tiere

1. Autoklaven der chirurgischen Instrumente und vor Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
2. Geben Sie die Mäuse 10 min bis zu experimentellen Umgebung akklimatisieren vor Erkennung pancreatic Islet mikrovaskuläre Vasomotion von Laser Doppler.
3. Füllen Sie eine 1-mL-Spritze mit 1 mL 3 % Pentobarbital-Natrium. Spritzen Sie die Pentobarbital-Natrium-Lösung (75 mg/kg i.p.), um die Mäuse zu betäuben.
4. Decken Sie die Augen der Maus mit vorbefeuchteten medizinische Gaze um Trockenheit zu verhindern.
5. Sicherstellen Sie, dass die Maus komplett verliert das Bewusstsein und reagiert nicht mehr auf Schweif oder Rückfuß mit der Pinzette drückt. Überwachen Sie die Narkose während der Narkose und intra-operative Veranstaltung alle 15 min. Aufrechterhaltung die Narkose durch die Ergänzung mit 10 % von der ursprünglichen Injektionsvolumen der Pentobarbital Lösung bei Bedarf.
6. Legen Sie ein Heizkissen mit einer semi-Isolierschicht unter das Tier und legen Sie das Tier in Rückenlage auf der Arbeitsstation des Lasers Doppler Gerät übertragen. Befestigen Sie die Maus, um die Arbeitsbühne mit chirurgischen Klebeband.
7. Tupfer die Bauchhaut der Maus mit Betadine, und dann 75 % Ethanol wird verwendet, um den Bauchbereich sauber wischen.
8. 2 % lidocaine/0.5% Bupivacain (50/50) Mischung subkutan zu injizieren.  Schneiden Sie eine ca. 3 cm-Durchmesser-Loch in der Mitte von einem Gaze-Schwamm. Der Bauchregion mit dem Schwamm Gaze abdecken.
9. Heben Sie die Bauchhaut mit Zange und machen Sie einen ersten vertikalen Schnitt entlang der Mittellinie des Bauches mit einer Schere Skalpell oder Haut.
10. Fassen Sie die darunter liegenden Muskeln mit der Zange und einzuschneiden Sie, um die Bauchhöhle gelangen. Nicht verletzen Sie alle Organe. Falten Sie die Haut und die darunter liegenden Muskeln über der Brust, die Bauchhöhle zu offenbaren. Sanft aussetzen der Bauchspeicheldrüse Körper und die Milz mit einer stumpfen Nase Zange.

4. Datenerfassung für die Analyse

1. Starten Sie die Software von der Laser-Doppler-Apparat durch Klicken auf "Datei" → "Neu", um eine neue Messungsdatei erstellen. Konfigurieren der angeschlossenen Monitore unter der Registerkarte "Allgemein", richten Sie die Überwachung Dauer "Frei laufen". Verwenden Sie die werkseitigen Standardeinstellungen für die Registerkarte "LDF-Monitor" und klicken Sie auf "Weiter".
2. Richten Sie das Grafik-Display die "Anzeige im Dialogfeld einrichten." Wählen Sie die "Flux, Konz, Speed" Kanäle aus, indem Sie die entsprechenden Kontrollkästchen aktivieren. Wählen Sie die folgenden Parameter: "Datenquelle für den Kanal" und "Label, Einheiten und Farbe." Klicken Sie auf "Weiter".
3. Geben Sie Benutzerinformationen über das Thema und Messung (d. h. Name und Thema Nummer, Operator, Überwachung von Zeit, Kommentare, etc.) in "Datei Informationen im Dialogfeld" und "Next" klicken Sie und die Messkonfiguration beenden.
   Hinweis: Ein Messfenster entsteht automatisch durch die Software (Abbildung 1 b).
4. Manuell vorab die Elektrode an der Bauchspeicheldrüse. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen der Sonde und der Bauchspeicheldrüse Gewebe innerhalb 1 mm liegt. Eine unsachgemäße Entfernung gibt einen künstlich erhöhten oder verringerten Blut fließen Messwert.
5. Klicken Sie auf das "Start"-Toolbar-Icon zum Starten der Aufnahme der mikrovaskuläre Blut Perfusion Einheiten (PU) Daten. Sammeln Sie die PU-Daten kontinuierlich für 1 min jeden Lauf. Klicken Sie auf "Stopp", um die Messung zu beenden. Wählen Sie "Datei" → "Speichern unter" auf Namen und speichern Sie die Messungsdatei fertig.
6. Manuell neu positionieren die Sonde nach jedem Lauf, additive Effekte und die lokalisierten Erschöpfung der kontraktilen zu vermeiden und Entspannung. Wiederholen Sie Schritte 4.1-4.4 Mehrpunkt (d. h. drei zufällig ausgewählte Punkte von Bauchspeicheldrüsen-Gewebe) mikrovaskuläre PU-Daten für jede Maus zu ernten. Messen Sie die PU-Daten aus einer nicht-reflektierende Platte als Grundlinie Kontrolle.
7. Schließen Sie das Bauchmuskel-Schicht und die Hautschicht mit einer Naht. Legen Sie die Tiere in saubere Käfige nach den Experimenten.
8. Halten Sie dem Tieren Warm, indem die Wiederherstellung Käfig halb-auf das Heizkissen.
   Hinweis: Achten Sie auf Wärme, Hygiene, Flüssigkeit und Nahrung und Infektion. Verwalten Sie Mäuse mit 2 mg/kg Carprofen für 48 h als postoperative Schmerztherapie.  Führen Sie Euthanasie durch die Injektion von 150 mg/kg Natrium Pentobarbital i.p. bei Mäusen beobachtet werden, werden in einem Zustand der Schmerzen oder Ängste, die gelindert werden kann nicht.

5. Berechnung der Parameter des mikrovaskulären Vasomotion

1. Verwenden Sie den Befehl "Export" der Laser-Doppler-Software Zeit und PU-raw-Daten als eine XLSX-Datei exportieren und öffnen Sie die Datei in einer Tabelle.
2. Berechnen Sie die durchschnittliche Baseline Perfusion Einheit (PU_b) (siehe Punkt 4.6).
3. Berechnen Sie die durchschnittliche Durchblutung (PU_ein) für 1 min einer Messung wie folgt: durchschnittliche Durchblutung (PU_ein) = PU - PU_b (Gleichung 1).
4. Berechnen Sie die Frequenz (Takte/min.) für jeweils 1 min der Messung.
   Hinweis: Die Häufigkeit der mikrovaskuläre Vasomotion ist definiert als die Anzahl der Spitzen, die in einer mikrovaskulären Vasomotion Welle pro Minute aufgetreten sind.
5. Berechnen Sie die Amplitude (ΔPU) für jeweils 1 min der Messung.
   1. Berechnen Sie die Amplitude der mikrovaskuläre Vasomotion als Differenz zwischen der maximalen (PU_max) und minimalen (PU_min): Amplitude (ΔPU) = PU_max - PU_min (Gleichung 2).
6. Berechnen Sie die relative Geschwindigkeit (PU) für jeweils 1 min der Messung.

Ergebnisse

Abbildung 1Azeigt ein Foto von der mikrovaskuläre Vasomotion Messung Laser Doppler Apparat mit einem Halbleiter Laserdiode ausgestattet. User-Interface Software ist in Abbildung 1 bdargestellt. Mit der oben genannten Methode wurden die hämodynamischen Parameter des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion für nicht-diabetischen Kontrolle und diabetischen Mäusen nachgewiesen. Eine Vielzahl von Techniken, einschließlich L...

Diskussion

In den Fällen, bei denen mikrovaskulären Dysfunktion (z. B. Diabetes, akute Pankreatitis, periphere mikrovaskuläre Erkrankungen, etc.), führen einige Krankheiten zu verminderter Blutfluss. Als Veränderungen des Blutflusses sind wichtige Indikatoren, z. B. mikrovaskuläre Vasomotion, die den funktionalen Status der Mikrozirkulation zu spiegeln. Indikators, mikrovaskuläre Vasomotion bezeichnet im Allgemeinen die Schwingung des mikrovaskulären Tones in mikrovaskuläre Betten. In das aktuelle Protoko...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
MoorVMS-LDF2	Moor Instruments	GI80	PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) can be used as an alternative apparatus to harvest data
MoorVMS-PC Software	Moor Instruments	GI80-1	Software of MoorVMS-LDF2
Calibration stand	Moor Instruments	GI-cal	Calibration tool
Calibration base	Moor Instruments	GI-cal	Calibration tool
Calibration flux standard	Moor Instruments	GI-cal	Calibration tool
One Touch UltraEasy glucometer	Johnson and Johnson	#1955685	Confirm hyperglycemia
One Touch UltraEasy strips	Johnson and Johnson	#1297006	Confirm hyperglycemia
Streptozotocin	Sigma-Aldrich	S0130	Dissolve in sodium citrate buffer (pH 4.3)
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	Working concentration 3 %
Ethanol	Sinopharm Inc.	200121	Working concentration 75 %
Sucrose	Amresco	335	Working concentration 10 %
Medical gauze	China Health Materials Co.	S-7112	Surgical
Blunt-nose forceps	Shang Hai Surgical Instruments Inc.	N-551	Surgical
Surgical tapes	3M Company	3664CU	Surgical
Gauze sponge	Fu Kang Sen Medical Device CO.	BB5447	Surgical
Scalpel	Yu Lin Surgical Instruments Inc.	175C	Surgical
Skin scissor	Carent	255-17	Surgical
Suture	Ning Bo Surgical Instruments Inc.	3325-77	Surgical
Syringe and 25-G needle	MISAWA Inc.	3731-2011	Scale: 1 ml