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要約

膵微小血管バソモーション アイレット血液の分布を調節して膵島 β 細胞の生理学的機能を維持します。このプロトコルは、膵微小血管バソモーション生体内での機能の状態を確認して膵臓病に膵微小循環の貢献を評価するレーザーのドップラー モニターを使用して説明します。

要約

微小循環の機能状態、微小血管皮膚血管運動の酸素と栄養の配信と二酸化炭素と老廃物の除去のため重要です。微小血管皮膚血管運動障害疾患の微小循環関連の開発の重要なステップがあります。さらに、高度に血管膵内分泌機能をサポートする適応です。この点で、膵微小血管皮膚血管運動機能の状態が膵機能に影響を与える可能性があります推測することが可能です。貢献を決定するための実行可能な戦略があります膵微小血管皮膚血管運動の機能的状態の病理組織学的変化の分析とその膵微小循環は、糖尿病などの関連疾患膵炎等したがって、このプロトコルが膵微小血管バソモーションの機能の状態を確認して (平均血液灌流、振幅、周波数、および相対を含むパラメーターを確立するレーザー ドップラー血流モニターを使用してについて説明します膵微小血管皮膚血管運動の速度) 微小循環機能の状態の評価のため。ストレプトゾトシン誘発糖尿病マウスのモデルでは、膵島の血管皮膚血管運動の障害機能状態が見られました。結論としては、膵微小血管バソモーション生体内評価するためこの方法は、膵疾患に関連するメカニズムを明らかにするかもしれない。

概要

微小循環の機能状態のパラメーターとして微小血管バソモーション配信と酸素、栄養素、およびホルモンの交換のための責任を取るし、セル廃棄物や二酸化炭素などの代謝産物の除去に不可欠であります。1。 血管皮膚血管運動も血流分布と組織の灌流、局所微小循環血圧力と炎症は、多くの疾患で浮腫を引き起こすことができるレスポンスに影響することを調節します。したがって、微小血管皮膚血管運動は臓器2,3,4組織、およびコンポーネントのセルの生理機能を維持するために非常に重要です。微小血管皮膚血管運動の障害は、微小循環関連疾患5の開発の重要なステップの 1 つかもしれない。

レーザードップラー法は、観察と微小循環研究6のフィールドの数量のために開発されました。(例えば、レーザー スペックル7、経皮的酸素等)、その他の技術的なアプローチと共に、この技術は、微小循環の血流を評価するため黄金の標準と見なされています。レーザー ・ ドップラー、装置によって (すなわち毛細血管、細動脈、細静脈、等) ローカル微小循環の血流が指定の理論的根拠は、ドップラーの原理に基づいています。光の粒子が微小循環、移動の血液細胞を発生または変更されないと波長、誘導放出光の周波数変更します。したがって、微小循環の数、血液細胞の速度、微小血管の血流の方向は関連する大きさとドップラー シフトした光の周波数分布に関連するキー要因。さまざまな方法を使用して、さまざまな組織、mesenteries を含む微小循環の研究に使用されていると背側皮下脂肪マウス、ラット、ハムスター、ベーキングチャンバーも人間8。しかし、現在のプロトコルに着目、機能を使用して評価される膵微小血管バソモーションの状態レーザー ドップラーと自家製評価パラメーター システム。

膵微小循環は膵微小循環の主に構成されて、特徴を展示します。膵毛細血管網は、その外分泌相手9の毛細血管よりも 5 倍高い密度を示しています。入力値及び普及インスリンのコンジットを提供する、膵島の血管内皮細胞酸素代謝活性の細胞に提供アイレットに β 細胞。さらに、膵島の血管がインシュリンの遺伝子発現および β 細胞の生存を調節するのみならず、β 細胞機能に影響を与えるにも関与していることを示しても出現の証拠β 細胞増殖を促進血管作動性血管新生物質と成長要因10の数を生産します。したがって、この点で、我々 は膵微小血管皮膚血管運動機能の状態が膵島 β 細胞機能に影響を与える、急性・慢性膵炎、糖尿病、およびその他などの疾患の病態に関与を推論します。膵臓病。

膵微小血管皮膚血管運動の機能的状態の病理組織学的変化の分析と上記疾患膵微小循環の貢献を決定するための実行可能な戦略があります。膵微小血管皮膚血管運動体内を確認する方法を説明する詳細な手順をここで提供します。典型的な測定値は代表の結果に表示されます。最後に、メリットと手法の限界は、議論、さらにアプリケーションと一緒にでハイライトされます。

プロトコル

すべての動物実験は、関連するガイドライン、規制、規制機関に準拠して実行されました。例示されている議定書を指導と承認の研究所の微小動物倫理委員会 (IMAEC) で、北京ユニオン医療大学 (医学科学院) の下で行った。

1. 動物

  1. 実験開始前に 12 時間の明暗周期下ケージ温度制御 (24 ± 1 ° C) と湿度 (55 ± 5%) につき 3 つの BALB/c マウスを維持します。マウスの通常の餌と水への無料アクセスを許可します。
  2. 糖尿病群と非糖尿病群にマウスをランダムに分割します。正確にそれぞれの個々 のマウスの重さし、それぞれのマウスの体重を使用して注入量を計算します。
  3. ストレプトゾトシン (STZ) 投与前に、4 時間マウスを高速かつ実験 1 日目に通常どおり定期的に水を提供します。
  4. Ph 4.3 0.1 M クエン酸ナトリウム バッファーを準備します。溶液 1 mL を 1.5 mL 遠心チューブに入れるし、光の露出を避けるためにアルミ箔で遠心チューブをラップします。
  5. クエン酸ナトリウム緩衝液 (4.3) を使用する前に 5 mg/mL の最終作業濃度に STZ を溶解します。
  6. 1 mL シリンジ、25 G 針を使用して 40 mg/kg の用量で stz 糖尿病グループの腹腔内注射マウスを与えます。クエン酸ナトリウム緩衝液 (4.3) の同じボリュームと非糖尿病コントロールのマウスを注入します。
  7. マウスをケージに戻すし、通常の餌と 10% ショ糖水でそれらを供給します。
  8. 実験日 2 に 5 (すなわち、次に 4 日間連続) 1.3 1.7 の手順を繰り返します。
  9. 最後の STZ 投与後定期的に水で 10% ショ糖水を置き換えます。
  10. 高速 6 時間、マウスはしかしそれらに水への開架を与えるし、9 日後 (実験日 14) 血糖値を測定します。血ブドウ糖の監視システムを使用して高血糖を確認する尾静脈から血液サンプルを収集します。
    注: 血ブドウ糖のレベル > 200 ミリグラム/dL とマウスは糖尿病と見なされます。

2. 計測器の準備

  1. プローブ先端の光の面とほこりや微粒子を除去するソフト、非研磨布でレーザー超音波ドプラ装置のプローブ コネクタをクリーニングします。楽器 (図 1 a) のポートにケーブルを差し込みます。
  2. フラックスを実験環境 (部屋の温度、通常 30 分間) が熱平衡にある標準により校正スタンドを組み立てます。フラックスを振る 2 分休む穏やかに 10 s と標準。
  3. 校正ベースの真ん中にフラックスの標準のコンテナーを配置します。最大の高さにクランプを調整し、下方コンテナーを指すようにクランプでプローブを固定します。フラックス標準がプローブの下に正しく配置されていることを確認します。
  4. ゆっくりと先端を正しくフラックス標準に浸漬されるまで下プローブを移動します。レーザー超音波ドプラ装置の「校正」を押しますとしにプローブが接続されているチャンネルを選択します。レーザー超音波ドプラ装置の画面で「成功した校正」通知が表示されるまでは、調整プログラムを実行します。
  5. プローブ ホルダーを使用してプローブを固定します。手動での移動を避けるためにプローブを固定します。
  6. 一定した温度 (24 ± 1 ° C) で実験室と湿度 (50 ~ 60%) を維持します。
  7. 外部の光誘起変化を避けるために実験を実行する前に、(蛍光灯やスポット ランプ) などの任意の外部光をオフに。

3. 動物の準備

  1. オートクレーブ手術機器およびそれらを使用する前に室温に冷却するを許可します。
  2. マウスを与えるレーザー ドップラーによる膵微小血管皮膚血管運動を検出する前に実験環境に順応する 10 分。
  3. 3% ペントバルビ タール ナトリウム 1 mL を 1 mL の注射器を入力します。マウスを麻酔するペントバルビ タール ナトリウム溶液 75 mg/kg (i. p.) を注入します。
  4. 乾燥を防ぐため事前に湿らせたガーゼを使って、マウスの目を覆います。
  5. 後足は、鉗子でつまむことまたはマウスが完全に意識を失うし、尻尾に応答しなくを確認します。15 分ごとに必要に応じてペントバルビ タール ソリューションの初期注入量の 10% を継ぎ足すことによって麻酔の維持麻酔と術中イベントを通して麻酔を監視します。
  6. 動物以下半絶縁層に加熱パッドを配置、仰臥位に動物を配置し、レーザー超音波ドプラ装置の作業ステーションに転送。サージカル テープで作業台にマウスを固定します。
  7. 綿棒、betadine、75% エタノールとマウスの腹部の皮膚は、腹部領域をきれいに綿棒に使用されます。
  8. 2 %lidocaine/0.5% ブピバカイン (50/50) 混合物を皮下注入します。 ~ 3 cm カット-ガーゼ スポンジの中央に直径の穴。ガーゼ スポンジで腹部をカバーします。
  9. 鉗子で腹部の皮膚を持ち上げて、メスや皮膚のはさみを使用して腹部の正中線に沿って初期縦切開を行います。
  10. 鉗子で基になる筋肉をつかみ、切開腹腔内を入力します。すべての臓器を傷つけていません。腹腔内を明らかにするための胸の上、皮膚や基礎となる筋肉を隠します。優しく膵体と鈍ピンセットのペアを使用して脾臓を公開します。

4. データ集録解析

  1. クリックして「ファイル」→「新規作成」新しい測定ファイルを作成するレーザー超音波ドプラ装置のソフトウェアを実行します。「全般」タブの下で、接続されているモニターを構成するのには、「実行無料」監視期間を設定します。「LDF モニター」タブをクリックします「次へ」の出荷時のデフォルトを使用します。
  2. グラフ表示設定を「表示設定ダイアログ ボックス」でそれぞれのボックスをチェックして「フラックス、コンク、スピード」チャンネルを選択できます。 します次のパラメーターを選択:「チャネルのデータ ソース」と"ラベル、単位および色。「次へ」をクリックします。
  3. 「ファイル情報ダイアログ ボックス」で件名の測定 (すなわち、名前と件名数演算子、監視時間、コメント、など) についてはユーザーを入力し測定構成を完了します"次へ"をクリックしますします。
    注: 測定ウィンドウです (図 1 b) ソフトウェアによって自動的に作成されます。
  4. 膵臓に電極を手動で進めます。プローブと膵臓の組織間の距離 1 mm 以内であることを確認します。不適切な距離を与える人工的に増加または減少させる血流朗読。
  5. 微小血管血灌流ユニット (PU) データの記録を開始する「スタート」ツールバーのアイコンをクリックします。すべての実行に 1 分間継続的に PU データを収集します。測定を中止するには、「停止」をクリックします。選択して「ファイル」→「名前を付けて保存」名にし完成した測定ファイルを保存します。
  6. 添加剤の効果と収縮のローカライズされた枯渇を避けるために各を実行した後、プローブを手動で再配置とリラクゼーションに最適な容量。各マウスの多点 (すなわち3 膵組織からランダムに選択したポイント) 微小血管の PU のデータを収集する手順 4.1 4.4.ベースライン管理として非反射板の PU データを測定します。
  7. 腹部の筋肉層とを縫合糸で皮膚の層を閉じます。実験後、きれいなケージに動物を配置します。
  8. 加熱パッドを半分に回復ケージを置くことによって動物の暖かいを保ちます。
    注: は、暖かさ、衛生、流体と食物摂取、感染症に注意を払います。術後疼痛管理として 48 時間カルプロフェンを 2 mg/kg をマウスを管理します。 安楽死を実行するには、マウスが緩和できない苦痛や重篤な状態であること観察されるとき、150 mg/kg のペントバルビ タール ナトリウム i. p. を注入します。

5. 血管皮膚血管運動のパラメーターを計算します。

  1. *.Xlsx ファイルとして時間と PU の raw データをエクスポートし、ファイルをスプレッドシートで開くレーザーのドップラー ソフトウェアの「エクスポート」コマンドを使用します。
  2. 平均ベースライン灌流ユニット (PUb) を計算する (ステップ 4.6 を参照)。
  3. 平均血液灌流 (PU、) 測定の 1 分を次のように計算する: (PU、)、血液灌流を平均 = PU - PUb (式 1)。
  4. 各 1 分測定の頻度 (サイクル/分) を計算します。
    注: 微小血管皮膚血管運動の頻度は、毎分微小血管バソモーション波の発生ピークの数として定義されます。
  5. 測定の各 1 分の振幅 (ΔPU) を計算します。
    1. (PUmax) 最大と最小 (PU分) の違いとして微小血管皮膚血管運動の振幅を計算する: 振幅 (ΔPU) = PUmax - PU分(式 2)。
  6. 各 1 分測定の相対速度 (PU) を計算します。

結果

図 1 aに微小血管皮膚血管運動測定レーザー半導体レーザー ダイオードを用いたドップラー装置の写真を示します。ユーザー インターフェイス ソフトウェアは、図 1 bに提示されます。上記の方法を使用して、非糖尿病のコントロールと糖尿病マウスの両方の膵微小血管皮膚血管運動の血行動態パラメーターが検出されま?...

ディスカッション

微小血管障害 (例えば、糖尿病、急性膵炎、末梢血管疾患、等) を含む場合は、いくつかの疾患は血流の低下に します。血流の変化以外は、微小循環の機能状態をミラー化する微小血管皮膚血管運動などの重要な指標があります。特定の指標、微小血管皮膚血管運動は血管ベッドで微小音の振動として一般的に定義されます。現在のプロトコルの監視システム微小血管血流を直?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、北京ユニオン医療大学青少年基金、中央大学 (許可番号 3332015200) の基礎的研究資金からの補助金によって支えられました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
MoorVMS-LDF2Moor InstrumentsGI80PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) can be used as an alternative apparatus to harvest data
MoorVMS-PC SoftwareMoor InstrumentsGI80-1Software of MoorVMS-LDF2
Calibration standMoor InstrumentsGI-calCalibration tool
Calibration baseMoor InstrumentsGI-calCalibration tool
Calibration flux standardMoor InstrumentsGI-calCalibration tool
One Touch UltraEasy glucometerJohnson and Johnson#1955685Confirm hyperglycemia
One Touch UltraEasy stripsJohnson and Johnson#1297006Confirm hyperglycemia
StreptozotocinSigma-AldrichS0130Dissolve in sodium citrate buffer (pH 4.3)
Pentobarbital sodiumSigma-AldrichP3761Working concentration 3 %
EthanolSinopharm Inc.200121Working concentration 75 %
SucroseAmresco335Working concentration 10 %
Medical gauzeChina Health Materials Co.S-7112Surgical
Blunt-nose forcepsShang Hai Surgical Instruments Inc.N-551Surgical
Surgical tapes3M Company3664CUSurgical
Gauze spongeFu Kang Sen Medical Device CO.BB5447Surgical
ScalpelYu Lin Surgical Instruments Inc.175CSurgical
Skin scissorCarent255-17Surgical
SutureNing Bo Surgical Instruments Inc.3325-77Surgical
Syringe and 25-G needleMISAWA Inc.3731-2011Scale: 1 ml

参考文献

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