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摘要

在这项研究中, 我们提出了一个简单和有效的程序来评估在神经退行性条件下血脑屏障的破坏。为了达到我们的目标, 我们在小鼠颈静脉内注入了高分子荧光素异硫氰酸酯标记 (FITC)-白蛋白, 并通过荧光显微镜将其渗漏到脑实质中。

摘要

破坏血脑屏障 (BBB) 的完整性是一个常见的特点, 不同的神经和神经退行性疾病。虽然扰动 bbb 稳态和脑疾病的发病机制之间的相互作用需要进一步的研究, 开发和验证可靠的程序, 以准确地检测 bbb 改变可能是至关重要的, 并代表了一个有用的工具潜在的预测疾病进展和制定有针对性的治疗策略。

在这里, 我们提出了一个简单和有效的程序, 评估脑屏障渗漏的神经退行性的情况, 如发生在一个前临床小鼠亨廷顿疾病模型, 其中的缺陷, 血 bbb 的渗透性是明确可探测早熟这种疾病。具体来说, 高分子量的荧光素异硫氰酸酯标记 (FITC)-白蛋白, 只有当后者被削弱时才能够穿过 BBB, 在血管或实质区内被剧烈注入小鼠颈静脉并分布然后由荧光显微镜测定。

绿色荧光-白蛋白在脑实质中的积累是异常 BBB 通透性的一个指标, 当定量使用图像 J 处理软件时, 报告为绿色荧光强度。

引言

中枢神经系统内稳态是神经元细胞正常沟通和功能的先决条件。中枢神经系统的实质是由内皮血脑屏障 (BBB) 与周围紧密封闭的, 它代表着外周血和脑的接口, 在这两个区之间的相声中起着举足轻重的作用1 ,2。血脑屏障是一种复杂的动态三维结构, 主要由专门的微血管内皮细胞 (ECs) 通过细胞间连接-紧密接合 (TJs) 和周, 神经元结尾和星形胶质细胞脚处理1,2。

在生理条件下, 完整的血脑屏障的极低通透性确保了对营养物质和其他分子进出大脑的严格调节, 并为中枢神经系统提供了独特的保护, 使其不会发生可能影响神经活动和反对可能的周边侮辱的血液的构成1,2,3。

长期以来, 对 BBB 完整性及其增强的渗透性的破坏已经成为许多神经和神经退行性疾病的关键特征4包括亨廷顿氏病 (HD)5,6, 但是, 这种功能失调是一种致病现象还是在病程中繁殖事件尚不清楚。血脑屏障破裂的时间也仍然难以捉摸, 然而, 我们组和其他人的新证据表明, 扰乱 bbb 完整性并不代表疾病进展的晚期事件, 而是早期的步骤6,7,8, 可能会产生长期后果。

考虑到这一点, 重要的是要早熟揭示 BBB 故障在神经, 以制定战略有用的预测疾病进展和脑损伤, 并制定替代和更有针对性的干预, 能够成功减轻这种破坏的临床后果。因此, 对脑屏障损害的可靠影像学研究, 在大脑疾病的实验和临床管理中具有重要意义。

本文介绍了利用高分子量荧光素异硫氰酸酯标记白蛋白 (FITC-白蛋白) 在 HD 小鼠模型中评价 BBB 通透性的一种成功而简单的方法。FITC-白蛋白的外渗, 通常不能越过屏障, 进入脑实质被测量为 BBB 渗漏的一个指标。该技术易于适应大鼠和其他病理条件的特点, cerebrovasculature 损害9,10。

研究方案

所有动物程序均由 IRCCS Neuromed 动物保育审查委员会和 #34 批准; 依 Superiore Sanit 和 #224; #34; (许可证编号: 1163/2015-PR), 并按照欧盟指令2010的指导方针/63/欧洲动物实验.

1. 注射到颈静脉内的 FITC-白蛋白溶液的制备

注意: 所有实验都是在清单 (11 周龄) HD R6/2 小鼠和年龄和性别匹配的野生型 (重量) 控制中进行的。窝.

  1. 在磷酸缓冲盐水 (PBS) 中溶解 FITC-白蛋白粉末 (参见 材料表 ), 在10毫克/毫升。 注: 为获得最佳效果, 应为每个标签反应准备新的.

2。外科手术中使用的设备的准备工作

  1. 放置以前的蒸压的外科仪器 (请参见 材料表 )。
  2. 用酒精 (70% 乙醇溶液) 清洗手术台。准备手术区 (45 厘米 x 45 厘米) 与外科无菌一次性毛巾悬垂和设置操作显微镜.

3。FITC-白蛋白输注到颈静脉的手术方法

  1. 记录麻醉时的鼠标体重.
  2. 麻醉鼠腹腔注射 (i. p) 的适当剂量氯胺酮 (100 毫克/千克)-嗪 (10 毫克/千克) 溶液.
  3. 在 Walantus et al. 中, 通过轻柔的脚趾掐缩反应来监测动物镇静反应, 如下所示 11 , 12 .
  4. 将麻醉鼠标置于正面仰卧位置, 并用胶带固定在手术台上的四条腿和尾部.
  5. 在鼠标安全后, 小心地用电动剃须刀将颈部适当的手术边缘剃掉 (参见 材料表 ), 并用聚维酮碘溶液和70% 乙醇对其进行消毒.
  6. 用棉签将裸露的剃光表面烘干.
  7. 轻轻地拉起剃光的皮肤, 用手术刀做一个1.5 厘米长的纵向切口, 在锁骨线上, 从胸部的中段开始, 延伸到颈部以下.
  8. 在显微镜观察 (5X 放大倍率) 下, 仔细地将结缔组织与镊子分开, 以暴露颈外静脉.
  9. 确保在右侧和颈静脉左侧有足够的空间, 以方便插入30和 #189; G 针用于 FITC-白蛋白溶液的注入.
  10. 通过使用30和 #189, 静脉注射 (右颈静脉) (3 分钟以上) 与100和 #181; L 10 毫升/千克 FITC-白蛋白; G 针.
  11. 15 分钟后, 安乐将鼠标斩首, 迅速从头骨上移除先前描述的大脑 13 , 并将其浸入15分钟, 至少10x 的大脑本身的 pre-chilled 戊.
  12. 将戊冷冻的大脑移动到 pre-chilled 管中, 并将其存储到-80 和 #176; C 冷冻直到组织学切片.

4。FITC-白蛋白注入脑组织切片的研究

  1. 在最佳切削温度 (OCT) 复合物中嵌入冷冻大脑 (见 材料表 ) 在低温切片之前.
  2. 按顺序将大脑切成20和 #181; m 厚部分, 低温 (请参阅 材料表 ), 并将其安装到显微镜玻璃幻灯片上.
  3. 使用特定的 anti-laminin 抗体 (见材料表) 执行 FITC-白蛋白/层粘连蛋白 co-staining, 如前所述 6 。
    1. 简要地, 在夜间与主抗体 anti-laminin (pAb 1:1000) 孵育切片, 并进行适当的二级抗体共轭 Cy3.
    2. 片幻灯片, 安装介质包含4和 #39;, 6-diamidino-2-吲 (DAPI) (吸收峰值 = 360 nm; 发射峰值 = 460 nm (请参阅 材料表 )
    3. 使幻灯片在4和 #176 中通宵晾干; C 在黑暗中.
    4. 在荧光显微镜下观察荧光染色 (参见 材料表 ), 在20X 倍放大器上装有两个 FITC (吸收峰值 = 495 nm; 发射峰值 = 525 nm) 和 Cy3 滤镜 (吸收峰值 = 550 nm; 发射峰值 = 570 nm)。
      1. 在染色后立即查看样品, 用指甲油固定在角上的片, 并在显微镜下检查, 如上图 (4.3.3).

5。设置荧光显微镜和彩色图像采集

  1. 设置荧光显微镜如下.
    1. 在使用前10分钟打开萤光灯。打开显微镜、连接的计算机和数码相机。运行图像分析软件 (请参见 材料表 ).
    2. 使用适当的目标来优化信号收集和空间分辨率, 并选择适当的筛选器.
  2. 获取彩色图像
    1. 在图像分析软件中选择 [实时] 命令 (参见 材料表 ), 并为每个滤镜设置最佳光照参数.
    2. 选择 [冻结] 命令以获得单通道彩色图像并添加缩放栏 (#39; 编辑和 #62; 刻录缩放和 #39;)
    3. 保存 #39 中的每个图像; tiff 和 #39; 格式.
    4. 通过选择和 #39; 文件和 #62; 合并通道和 #39, 将通道合并到单个图像中; 并将其保存在
    5. tiff 和 #39; 格式
    6. 每个脑切片 (每张幻灯片6节) 获取至少四二十四位彩色图片 (2200 和 #181; m x 3400 和 #181; m).

6。FITC-白蛋白外渗的评价

  1. 通过使用自由可用的 ImageJ 来分析每个通道的荧光强度 14 , 15 .
  2. 通过每个图像的总 CY3-Laminin 荧光强度使 FITC 白蛋白的总荧光信号强度正常化, 并将血管外的淤血白蛋白报告为绿色荧光强度.

结果

适当的 FITC-白蛋白注入颈静脉的结果在绿色荧光示踪剂从血液进入大脑 parenchymawhen BBB 是危及6。在生理条件下, 注入的荧光白蛋白的分布仅限于脑血管内, 周围血管区和/或脑实质的信号都是可探测的 (图 1A, 显微顶)。相反, 当血脑屏障在神经病理环境下被破坏时, FITC-白蛋白在血管空间和大脑实质 (图 1A, 底部显?...

讨论

我们在这里描述的技术主要是用来检测脑疾病状态下的 BBB 渗漏。BBB 功能障碍是越来越多的关注, 作为一个常见的特点, 不同的神经系统疾病4。我们以前使用这种方法来描述在一个罕见的神经退行性疾病的小鼠模型, 如 HD6早期紊乱的 BBB 完整性。

该方法利用了程序的相对简单性和有效性, 提供了准确、可靠的结果。它代表了一个高度敏感的?...

披露声明

作者没有利益冲突披露

致谢

这项工作得到了 "基金会 Neuromed" 的支持, 由意大利卫生部 "74年2月 Corrente" 资助科诺诺夫

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugateSIGMAA9771-100MG
pAb anti-LamininNovus BiologicalsNB300-144
CY3 anti-rabbit made in goatMILLIPOREAP132
SUPERFROST PLUSThermo ScientificJ1800AMNZ
Cover Slips 24 X 50 mmThermo Scientific (DIAPATH)61050
Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compoundBio Optica05-9801
VECTASHIELD Mounting MediaVECTORH-1500Mounting media with DAPI
iNSu/Light Insulin Disposible SyringeRAYS Health &SafetyINS1ML26G13
30G 1/2"BD Microlance304000Needle for Insulin disposible Syringe
Scalpel HandleF.S.T.91003-12
#22 Disposable Scalpel bladsF.S.T.10022-00
Fine Iris scissors 10.5 cmF.S.T.14094-11
Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mmF.S.T.11251-35
Graefe Forceps 10 cmF.S.T.11051-10
Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mmF.S.T.11251-20
Medical patchMedicalis34788
Sterile disposable towel drapeDispotechTVO50VE
Stereoscopic MicroscopeNIKONSMZ 745 T
Optic Illuminator LED light (C-FLED2)NIKON1003167Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope
Eclipse Ni-U MicroscopeNikon932162Epifluorescence Microscope
Microscope digital CameraNikonDS-Ri2Microscope camera
IntenslightNikonC-HGFIMicroscope lamp
NIS-Elements 64 bitNikonAR 4.40.00Analysis Software
Electric RazorGemeiGM-3007

参考文献

  1. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
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