АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом исследовании мы представляем простой и эффективной процедуры оценки нарушения blood - brain барьер нейродегенеративных условиях. Для достижения нашей цели, мы проникнуты высокомолекулярного флуоресцеин Изотиоцианаты маркировку (FITC)-альбумина в мыши яремной вены и оценку его утечки в паренхиме мозга микроскопии флуоресцирования.

Аннотация

Нарушение целостности гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является общей особенностью для различных неврологических и нейродегенеративных заболеваний. Хотя взаимодействие возмущенных BBB гомеостаза и патогенез расстройств головного мозга требует дальнейшего расследования, разработки и проверки надежные процедуры точно обнаруживать изменения BBB может иметь решающее значение и представляют собой полезный инструмент для потенциально прогноза болезни прогрессирования и развития целевых терапевтических стратегий.

Здесь мы представляем простой и эффективной процедуры для оценки утечки BBB в состоянии нейродегенеративных подобное происходит в доклинических мыши модели болезни Гентингтона, в котором дефекты проницаемости BBB четко обнаруживаются благосклонностью в болезнь. В частности, высокой молекулярной массой флуоресцеин Изотиоцианаты маркировку (FITC)-альбумин, который способен пересечь BBB только тогда, когда последний нарушается, остро проникнуты в яремной мышь и ее распространение в районах сосудистой или Паренхиматозный Затем определяется микроскопии флуоресцирования.

Накопление Зеленый флуоресцентный-альбумина в паренхиме мозга функционирует как индекса проницаемости аберрантных BBB и, когда предел с помощью программного обеспечения для обработки изображений J, сообщается как зеленый интенсивности флуоресценции.

Введение

Гомеостаз в пределах центральной нервной системы (ЦНС) является необходимым условием для надлежащей коммуникации и функции клеток-нейронов. Паренхима ЦНС плотно запечатан от периферии эндотелиальной гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), который представляет собой интерфейс между периферической крови и мозг и играет ключевую роль в кросс разговор между этими двумя районами1 ,2. BBB – это комплекс и динамических трехмерной структуры в основном состоит из специализированных микро судно эндотелиальных клеток (ECs) связаны друг с другом через межклеточное соединительной комплексы - плотные соединения (сомони) - и окруженный pericytes, нейрон окончаний и экзоцитоз ног процессов1,2.

В физиологических условиях, крайне низкая проницаемость нетронутыми BBB обеспечивает строгое регулирование транспорта питательных веществ и других молекул в и из мозга и ЦНС с уникальной защитой от изменений, происходящих в состав крови, что может повлиять на нейронной активности и против потенциал периферийных оскорбляет1,2,3.

Нарушения целостности BBB и его повышение проницаемости давно известно, являются ключевым элементом для многих неврологических и нейродегенеративных расстройств4 включая болезни Гентингтона (HD)5,6, однако , является ли такая дисфункция причинные явления или распространение событий в ходе заболевания до сих пор неясно. Сроки BBB разбивка также остается недостижимой, однако, новые доказательства нашей группы и другие указывает, что нарушена целостность BBB не представляют поздно событий в развитие болезни, но довольно рано шаг6,7 , 8, который может иметь долгосрочные последствия.

Имея это в виду важно выявить благосклонностью BBB пробоя в нейродегенеративные для того, чтобы разработать стратегии, полезной для прогнозирования прогрессирования заболевания и повреждения головного мозга и успешно развивать альтернативные и более целенаправленных мероприятий, способных смягчение клинических последствий такого нарушения. Надежные изображений BBB обесценения является, таким образом, важное значение в экспериментальных исследований и клинического управления заболеваний головного мозга.

В этом документе мы описываем успешным и простой процедуры для оценки BBB проницаемости в мышиной модели HD с помощью высокой молекулярной массой флуоресцеин Изотиоцианаты маркировку альбумина (FITC-альбумина). Кровоподтек FITC-альбумина, который обычно не может пересекать барьер, в паренхиме мозга измерялась как индекс BBB утечки. Этот метод легко адаптируется, крысы и другие патологические состояния, характеризуется cerebrovasculature обесценения9,10.

протокол

все процедуры на животных были утверждены Правлением IRCCS Neuromed животное уход обзор и по " Istituto Superiore ди Sanita " (номер разрешения: 1163/2015-PR) и были в соответствии с руководящими принципами ЕС Директива 2010 / 63/ЕС для экспериментов животных.

1. Подготовка FITC-альбумина раствор для инъекций в яремной

Примечание: все эксперименты были управления осуществляется в манифеста (11 - неделя старый) HD R6/2 мышей и в возрасте и соответствием пола одичал тип (WT) Однопометники.

  1. Растворяют FITC-альбумин порошка (см. Таблицу материалы) в-фосфатный буфер (PBS) на 10 мг/мл.
    Примечание: Для получения оптимальных результатов, это должно быть подготовлено свежие для каждой маркировки реакции.

2. Подготовка оборудования, чтобы быть использованы во время хирургии

  1. выложить ранее газобетона хирургических инструментов (см. Таблицу материалы).
  2. Чистой хирургической скамейке с алкоголем (70% этанола раствор). Подготовить хирургические области (45 x 45 см) с портьера хирургические стерильные Одноразовые полотенца и Настройка операционных стереомикроскопом.

3. Хирургическая процедура для вливания FITC-альбумина в яремной вены

  1. запись мыши веса тела для анестезии.
  2. Anesthetize мышь с внутрибрюшинной инъекции (i.p) соответствующей дозы кетамина (100 мг/кг) - решение Ксилазина (10 мг/кг).
  3. Монитор животных седации, нежный мыс щепотку снять рефлекс, как показано в Walantus et al. 11 , 12.
  4. место наркотизированных мышь в лежачем положении лицом вверх и исправить четыре ноги и хвост на хирургические workbench скотчем.
  5. После того, как мышь является защищенной, тщательно побриться надлежащих хирургических маржа на шею с электрической бритвой (см. Таблицу материалы) и лечить ее с повидон йод раствор и 70% этанол.
  6. Сухой поверхности подвергаются бритая с ватные тампоны.
  7. Осторожно потяните вверх бритой кожи и сделать 1,5 см длиной продольный разрез, на скальпель, в midclavicular линии начиная посередине на грудной клетки и чуть ниже шеи.
  8. Осторожно растянуть врозь соединительной ткани с щипцами микроскопические наблюдения (5 X увеличение) подвергать внешних яремной.
  9. Обеспечить наличие достаточного пространства справа и слева от яремной для облегчения вставки иглы 30½ G для инфузии FITC-альбумина раствор.
  10. Придать животное внутривенно (справа яремной) медленно (более 3 мин) с 100 мкл 10 мл/кг FITC-альбумина с помощью иглы 30½ Г.
  11. После 15 минут, усыпить мыши путем обезглавливания, быстро удалить мозга от черепа как описано 13 и погрузиться на 15 мин в по крайней мере 10 x размер самого мозга предварительно охлажденные изопентана.
  12. Перемещение изопентана заморожен мозг в предварительно охлажденные трубку и хранить его в холодильнике-80 ° C до гистологические секционирование.

4. Гистологические вырезание из мозга Infused с FITC-альбумина

  1. вставлять замороженные смеси мозга оптимального раскроя температуры (OCT) (см. Таблицу материалы) до их криостата резании.
  2. Серийно вырезать мозг 20 мкм толщиной разделов, с криостата (см. Таблицу материалы) и смонтировать их на стеклянных скольжениях микроскопа.
  3. Выполнять FITC-альбумин/Ламинин совместно окрашивание с помощью конкретного анти Ламинин антитела (см. таблицу материалы) как описано 6.
    1. Кратко, инкубировать секции с основного антитела анти Ламинин (pAb 1: 1000) за одну ночь и приступить к соответствующей вторичное антитело проспряганное с Cy3.
    2. Coverslip слайды с монтажа носитель, содержащий 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (пик поглощения = 360 Нм; пик выбросов = 460 Нм (см. Таблицу материалы).
    3. Оставить для высыхания на ночь при 4 ° C в темноте слайд.
    4. Наблюдать флуоресценции, окрашивание под флуоресцентным микроскопом (см. Таблицу материалов) при 20-кратном оснащены оба FITC (пик поглощения = 495 нм; пик выбросов = 525 Нм) и Cy3 фильтры (пик поглощения = 550 Нм; выбросов пик = 570 Нм).
      1. Для просмотра образцов сразу же после окрашивания, обеспечить coverslip на углах, используя лак и рассматривать их под микроскопом как выше (4.3.3).

5. Параметр вверх флуоресцентным микроскопом и приобретение цветные изображения

  1. настроить следующим флуоресцентным микроскопом.
    1. Включите люминесцентная лампа около 10 минут перед использованием. Включите Микроскоп, подключенного компьютера и цифровой фотоаппарат. Запустите программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблицу материалы).
    2. Использовать соответствующие цели для оптимального сигнала сбора и пространственного разрешения и выберите соответствующие фильтры.
  2. Приобретение цветные изображения
    1. выберите команду [live] на программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблицу материалы) и установите параметры оптимального освещения для каждого фильтра.
    2. Выберите команду [Стоп] принять изображения цвета один канал и добавить линейку шкалы (' редактировать > сжечь шкала ')
    3. Сохранить каждое изображение в ' .tiff ' формате.
    4. Объединение каналов в один образ, выбрав ' файл > канала слияния ' и сохраните его в
    5. tiff ' формате.
    6. Получить как минимум четырех 24-битный цвет картинки (2200 мкм x 3400 мкм) на срез мозга (6 секций на слайд).

6. Оценка FITC-альбумин кровоподтек

  1. Анализ интенсивности флуоресценции для каждое одного канала с помощью свободно доступных ImageJ 14 , 15.
  2. Нормализовать интенсивности всего флуоресцентные сигнала FITC-альбумина, общей интенсивности флуоресценции CY3-Ламинин за каждое изображение и доклад extravasated альбумина вне суда, как зеленый интенсивности флуоресценции.

Результаты

Надлежащего вливание FITC-альбумина в яремной результаты в кровоподтек зеленой флуоресценцией трассировщик из крови в мозг parenchymawhen, та BBB скомпрометированы6. В физиологических условиях, проникнуты флуоресцентные альбумина рассылается внутри кровеносных ?...

Обсуждение

Техника, которую мы опишем здесь главным образом полезен для обнаружения утечки BBB условиях болезнь мозга. BBB дисфункции завоевывает внимание как общей чертой различных неврологических расстройств4. Ранее мы использовали этот подход для описания ранних расстройство BBB цел...

Раскрытие информации

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрывать

Благодарности

Эта работа была поддержана «Fondazione Neuromed» и финансируется министерством здравоохранения «Ricerca Corrente» для в.м. Италии

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugateSIGMAA9771-100MG
pAb anti-LamininNovus BiologicalsNB300-144
CY3 anti-rabbit made in goatMILLIPOREAP132
SUPERFROST PLUSThermo ScientificJ1800AMNZ
Cover Slips 24 X 50 mmThermo Scientific (DIAPATH)61050
Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compoundBio Optica05-9801
VECTASHIELD Mounting MediaVECTORH-1500Mounting media with DAPI
iNSu/Light Insulin Disposible SyringeRAYS Health &SafetyINS1ML26G13
30G 1/2"BD Microlance304000Needle for Insulin disposible Syringe
Scalpel HandleF.S.T.91003-12
#22 Disposable Scalpel bladsF.S.T.10022-00
Fine Iris scissors 10.5 cmF.S.T.14094-11
Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mmF.S.T.11251-35
Graefe Forceps 10 cmF.S.T.11051-10
Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mmF.S.T.11251-20
Medical patchMedicalis34788
Sterile disposable towel drapeDispotechTVO50VE
Stereoscopic MicroscopeNIKONSMZ 745 T
Optic Illuminator LED light (C-FLED2)NIKON1003167Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope
Eclipse Ni-U MicroscopeNikon932162Epifluorescence Microscope
Microscope digital CameraNikonDS-Ri2Microscope camera
IntenslightNikonC-HGFIMicroscope lamp
NIS-Elements 64 bitNikonAR 4.40.00Analysis Software
Electric RazorGemeiGM-3007

Ссылки

  1. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
  2. Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
  3. Moretti, R., et al. Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain. Front Neurosci. 9, 40 (2015).
  4. Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
  5. Drouin-Ouellet, J., et al. Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington's disease: Potential implications for its pathophysiology. Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).
  6. Di Pardo, A., et al. Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease. Sci Rep. 7, 41316 (2017).
  7. Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).
  8. van de Haar, H. J., et al. Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (2), 615 (2017).
  9. Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
  10. Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).
  11. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
  12. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. (9), e404 (2007).
  13. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  14. McCloy, R. A., et al. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).
  15. Burgess, A., et al. Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).
  16. Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions. PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).
  17. Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease. Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

129BBBFITC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены