Avaliação da permeabilidade da barreira hemato - encefálica por infusão intravenosa de albumina FITC-etiquetadas em um modelo do rato da doença neurodegenerativa

Resumo

Neste estudo, apresentamos um procedimento fácil e eficiente para avaliar o rompimento da barreira hemato - encefálica em condições neurodegenerativas. Para alcançar nosso objetivo, nós infundida de alto peso molecular isotiocianato de fluoresceína rotulado (FITC)-albumina na jugular do mouse veia e avaliada a sua fuga para o parênquima cerebral por microscopia de fluorescência.

Resumo

Rompimento da integridade da barreira hemato - encefálica (BBB) é um recurso comum para várias doenças neurológicas e neurodegenerativas. Embora a interação entre a homeostase BBB perturbado e a patogênese de doenças do cérebro precisa de investigação, desenvolvimento e validação de um procedimento confiável para detectar com precisão as alterações de BBB podem ser crucial e representam uma ferramenta útil para potencialmente prevendo doença progressão e desenvolvimento direcionado estratégias terapêuticas.

Aqui, apresentamos um procedimento fácil e eficiente para avaliar o escapamento do BBB em uma condição neurodegenerativa assim ocorrendo em um modelo de pré-clínicos do rato da doença de Huntington, em que defeitos na permeabilidade do BBB são claramente detectáveis precocemente em a doença. Especificamente, o alto peso molecular isotiocianato de fluoresceína rotulado (FITC)-albumina, que é capaz de atravessar o BBB somente quando este for prejudicada, é agudamente infundido em uma veia jugular de rato e sua distribuição nos distritos de vascular ou parenquimatosas é determinada por microscopia de fluorescência.

Acumulação de verde fluorescente-albumina no parênquima cérebro funciona como um índice de permeabilidade BBB aberrante e, quando quantificados usando o software de processamento de imagem J, é relatada como a intensidade de fluorescência verde.

Introdução

Homeostase dentro do sistema nervoso central (SNC) é um pré-requisito para a comunicação adequada e função das células neuronais. O parênquima do CNS é hermeticamente fechado da periferia pela endotélio barreira hemato - encefálica (BBB), que representa a interface entre o cérebro e a circulação sanguínea periférica e desempenha um papel crucial no Cruz-falar entre estes dois distritos^{1 ,2}. O BBB é um complexo e dinâmica estrutura tridimensional composta principalmente de micro vasos endoteliais células especializadas (ECs) ligados entre si através dos complexos juncionais intercelulares - junções apertadas (TJs) - e rodeado por pericitos, neurônio terminações e astrocyte pé processos^1,2.

Sob condições fisiológicas, a extremamente baixa permeabilidade do BBB intacta garante a regulamentação estrita do transporte de nutrientes e outras moléculas para dentro e fora do cérebro e fornece o CNS com uma proteção única de mudanças que ocorrem na composição do sangue que pode influenciar a atividade neural e contra potencial periférica insulta^1,2,3.

Rompimento da integridade do BBB e sua permeabilidade reforçada tem sido conhecido para constituir um recurso-chave para muitos neurológicas e neurodegenerativas distúrbios⁴ , incluindo a doença de Huntington (HD)^5,6, no entanto , se tal uma disfunção é um fenômeno causal, ou um evento propagativo no decurso da doença ainda não está claro. Também o momento do colapso do BBB ainda não se alcançou, no entanto, surgir provas do nosso grupo e outros indica que interrompidos BBB integridade não representa um tarde evento na progressão da doença, mas prefiro uma etapa precoce^{6,7 , 8}, que pode ter consequências a longo prazo.

Com isto em mente, é importante revelar precocemente desagregação do BBB na neurodegeneração a fim de desenvolver estratégias úteis para predizer a progressão da doença e dano cerebral para desenvolver com sucesso o alternativas e mais alvejadas intervenções capazes de mitigando as consequências clínicas de tal um rompimento. Imagem confiável de imparidade de BBB é, portanto, de grande importância no manejo clínico de doenças do cérebro e pesquisa experimental.

Neste trabalho, descrevemos um procedimento bem sucedido e simples para a avaliação da permeabilidade do BBB em um modelo do rato do HD usando o alto peso molecular fluoresceína isotiocianato rotulados-albumina (FITC-albumina). Extravasamento de FITC-albumina, que normalmente não pode cruzar a barreira, o parênquima cerebral foi medido como um índice de vazamento do BBB. Esta técnica é facilmente adaptável para ratos e outras condições patológicas caracterizadas por deficiência de cerebrovasculature^9,10.

Protocolo

todos os procedimentos em animais foram aprovados pela IRCCS coração Animal conta Review Board e por " Istituto Superiore di Sanità " (permitir número: 1163/2015-PR) e estavam em conformidade com as orientações da UE Directiva 2010 / 63/EU para experiências em animais.

1. preparação da solução de FITC-albumina deve ser injetado na veia Jugular

Nota: todas as experiências foram realizadas em ratos manifesto de HD R6/2 (11 - semanas de idade) e em idade e gênero-combinadas selvagem-tipo (WT) controle littermates.

1. Dissolver FITC-albumina em pó (ver Tabela de materiais) em salina tampão fosfato (PBS) 10 mg/ml.
   Nota: Para obter melhores resultados, isto deve estar preparado fresco para cada reação rotulagem.

2. Preparação do equipamento para ser usado durante a cirurgia de

1. esquematizar os instrumentos cirúrgicos previamente autoclavados (ver Tabela de materiais).
2. Limpar a bancada cirúrgica com álcool (solução de etanol 70%). Preparar a área cirúrgica (45 x 45 cm) com um pano cirúrgico toalha descartável estéril e configurar o funcionamento estereomicroscópio.

3. Procedimento cirúrgico para FITC-albumina infusão na veia Jugular

1. gravar o peso do corpo do mouse para anestesia.
2. Anesthetize rato com uma injeção intraperitoneal (IP) de uma dose apropriada de cetamina (100 mg/kg) - solução de xilazina (10mg/kg).
3. Monitor animal sedação por pitada de dedo suave retirar reflexo, conforme demonstrado no Walantus et al ^{11 , 12}.
4. o mouse anestesiado em posição supina viradas para cima e fixar as quatro patas e a cauda na bancada de trabalho cirúrgica com fita adesiva.
5. Depois o mouse é garantido, cuidadosamente raspar a margem cirúrgica adequada no pescoço com um barbeador elétrico (ver Tabela de materiais) e desinfetar com etanol de solução e 70% de iodo-povidona.
6. Secar a superfície raspada exposta com cotonetes.
7. Gentilmente puxe a pele depilada e fazer uma incisão longitudinal longo 1,5 cm, por bisturi, no clavicular linha começando na metade sobre o tórax e estendendo-se a apenas abaixo do pescoço.
8. Esticar cuidadosamente separados do tecido conjuntivo com pinça sob observação microscópica (ampliação de X 5) para expor a veia jugular externa.
9. Garantir um espaço suficiente à direita e à esquerda da veia jugular para facilitar a inserção da agulha para a infusão da solução de albumina-FITC 30½ G.
10. Injetar o animal por via intravenosa (direita veia jugular) lentamente (mais de 3 min) com 100 µ l de 10ml/kg FITC-albumina usando a agulha de 30½ G.
11. Depois de 15 minutos, eutanásia o mouse por decapitação, rapidamente remover o cérebro do crânio como descrito anteriormente ¹³ e mergulhe-a por 15 min pelo menos 10x o volume do cérebro em si de pre-refrigerado isopentano.
12. Mover o isopentano congelado o cérebro em um tubo previamente refrigerado e armazená-lo em um freezer-80 ° C até corte histológico.

4. Histológicas de seccionamento de cérebro infundido com FITC-albumina

1. Embed congelado o cérebro na temperatura de corte ideal (OCT) composto (ver Tabela de materiais) antes do criostato seccionamento.
2. Em série, corte o cérebro em 20 µm de espessura seções, com um criostato (ver Tabela de materiais) e montá-los em lâminas de vidro de microscópio.
3. Executar o FITC-albumina/laminina co coloração usando um determinado anticorpo antilaminina (ver tabela de materiais) como descrito anteriormente ⁶.
   1. Brevemente, incubar seções com o anticorpo primário antilaminina (pAb 1: 1000) durante a noite e proceder com a adequada anticorpo secundário conjugado com Cy3.
   2. Lamela desliza com meio de montagem, contendo 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (pico de absorção = 360 nm; pico de emissão = 460 nm (ver Tabela de materiais).
   3. Deixar o slide para secar durante a noite a 4 ° C, no escuro.
   4. Observar a fluorescência de coloração sob um microscópio de fluorescência (ver Tabela de materiais) na ampliação de X 20 equipado com ambos FITC (pico de absorção = 495 nm; pico de emissão = 525 nm) e filtros de Cy3 (pico de absorção = 550 nm; emissão Pico = 570 nm).
      1. Para visualizar as amostras imediatamente após a coloração, secure lamela nos cantos usando esmaltes e examiná-las sob o microscópio como acima (4.3.3).

5. Configuração para o microscópio de fluorescência e aquisição de imagens a cores

1. configurar o microscópio de fluorescência, como segue.
   1. Ligue a lâmpada da fluorescência cerca de 10 minutos antes do uso. Ligue o microscópio, o computador conectado e a câmera digital. Executar o software de análise de imagem (consulte a Tabela de materiais).
   2. Usar o objetivo apropriado para coleção óptima do sinal e resolução espacial e selecione filtros apropriados.
2. Aquisição de imagens a cores
   1. , selecione o comando [ao vivo] sobre o software de análise de imagem (consulte a Tabela de materiais) e configurar os parâmetros de iluminação ideal para cada filtro.
   2. Selecione o comando [congelamento] para levar a imagem de cor de canal único e adicionar a barra de escala (' editar > queimar escala ')
   3. Salvar cada imagem no '. TIFF ' formato.
   4. Mesclar canais em uma única imagem, selecionando ' arquivo > mesclar canal ' e salvá-lo na
   5. tiff ' formato.
   6. Fotos de adquirir um mínimo de vinte e quatro-quatro bits de cores (2200 µm x 3400 µm) por fatia cerebral (6 seções por slide).

6. Avaliação de extravasamento FITC-albumina

1. analisar a intensidade de fluorescência para cada canal único usando o livremente disponível ImageJ ^{14 , 15}.
2. Normalizar a intensidade do sinal fluorescente total do FITC-albumina pela intensidade CY3-laminina total fluorescente por cada imagem e relatar a albumina extravasada fora dos vasos, como a intensidade de fluorescência verde.

Resultados

Infusão adequada de FITC-albumina em veia jugular resultados no extravasamento do traçador fluorescência verde da corrente sanguínea para o cérebro parenchymawhen que o BBB é comprometida⁶. Sob condições fisiológicas, distribuição de albumina fluorescente infundida é restrita ao interior dos vasos sanguíneos cerebrais e nenhum sinal no parênquima circundante de área e/ou cérebro perivascular é detectável (figura 1A, m...

Discussão

A técnica que descrevemos aqui é principalmente útil para detectar vazamento BBB sob condições de doença cerebral. Disfunção do BBB está ganhando atenção como uma característica comum dos distúrbios neurológicos diversos⁴. Anteriormente, usamos esta abordagem para descrever o início desarranjo da integridade do BBB em um modelo do rato de uma doença neurodegenerativa rara como HD⁶.

Esse método leva vantagem da relativa simplicida...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate	SIGMA	A9771-100MG
pAb anti-Laminin	Novus Biologicals	NB300-144
CY3 anti-rabbit made in goat	MILLIPORE	AP132
SUPERFROST PLUS	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Cover Slips 24 X 50 mm	Thermo Scientific (DIAPATH)	61050
Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound	Bio Optica	05-9801
VECTASHIELD Mounting Media	VECTOR	H-1500	Mounting media with DAPI
iNSu/Light Insulin Disposible Syringe	RAYS Health &Safety	INS1ML26G13
30G 1/2"	BD Microlance	304000	Needle for Insulin disposible Syringe
Scalpel Handle	F.S.T.	91003-12
#22 Disposable Scalpel blads	F.S.T.	10022-00
Fine Iris scissors 10.5 cm	F.S.T.	14094-11
Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm	F.S.T.	11251-35
Graefe Forceps 10 cm	F.S.T.	11051-10
Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm	F.S.T.	11251-20
Medical patch	Medicalis	34788
Sterile disposable towel drape	Dispotech	TVO50VE
Stereoscopic Microscope	NIKON	SMZ 745 T
Optic Illuminator LED light (C-FLED2)	NIKON	1003167	Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope
Eclipse Ni-U Microscope	Nikon	932162	Epifluorescence Microscope
Microscope digital Camera	Nikon	DS-Ri2	Microscope camera
Intenslight	Nikon	C-HGFI	Microscope lamp
NIS-Elements 64 bit	Nikon	AR 4.40.00	Analysis Software
Electric Razor	Gemei	GM-3007