Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışmada, biz kan - beyin bariyerini nörodejeneratif koşullar altında çalışmasının değerlendirilmesi için kolay ve etkin bir yordam mevcut. Bizim hedefe ulaşmak için biz yüksek molekül ağırlıklı floresein isothiocyanate (FITC) etiketli infüzyon-albümin içine fare juguler ven ve onun kaçak beyin parankimi Floresans mikroskobu tarafından değerlendirilir.

Özet

Kan - beyin bariyerini (BBB) bütünlük bozulma farklı nörolojik ve nörodejeneratif hastalıklar için ortak bir özelliktir. Ne kadar perişan BBB homeostazı ve beyin bozukluklarının Patogenez arasında etkileşim ihtiyacı daha fazla araştırma, geliştirme ve doğrulama doğru BBB değişiklikleri algılamak için güvenilir bir yordam çok önemli ve yararlı bir araç temsil eder potansiyel olarak hastalık öngördürücüsü için hedef ilerleme ve geliştirme tedavi stratejileri.

Burada, BBB sızıntı böyle, Huntington hastalığı, BBB geçirgenliği kusur tanımışlar açıkça tespit preklinik fare modeli meydana gelen bir nörodejeneratif durumunun değerlendirilmesi için kolay ve etkin bir yordam mevcut hastalık. Etiketli özellikle yüksek molekül ağırlıklı floresein isothiocyanate (FITC)-yalnızca ikinci bozulmuş olduğunda BBB çapraz yapabiliyor, albümin, akut infüzyon içine bir fare juguler ven ve vasküler veya parenkima ilçede dağıtımı o zaman Floresans mikroskobu tarafından belirlenir.

Beyin parankimi yeşil floresan-albümin birikimi anormal BBB geçirgenliği indeks olarak işlev görür ve görüntü J işleme yazılımı kullanarak quantitated zaman yeşil floresan yoğunluğu bildirilir.

Giriş

Merkezi sinir sistemi (MSS) içinde homeostazı uygun iletişim ve nöronal hücre işlevi için bir önkoşuldur. CNS parankimi sıkı çevre--dan endotel kan - beyin periferik kan ve beyin arasında arayüz gösteren ve çapraz-hadis1 Bu iki ilçe arasında çok önemli bir rol oynar bariyerini (BBB) tarafından saklanmış ,2. BBB bir kompleks olduğunu ve dinamik üç boyutlu yapısını esas olarak interselüler bileske kompleksleri - sıkı kavşak (TJs) - birbirine bağlı ve perisitlerden tarafından çevrili özel mikro-damar endotel hücreleri (ECs) oluşan nöron biten ve astrocyte ayak işlemleri1,2.

Fizyolojik koşullar altında sağlam BBB son derece düşük geçirgenliği içine ve dışına beyin besin ve diğer moleküller sıkı düzenleme sağlar ve MSS görülen değişimleri benzersiz bir koruma sağlar kompozisyon sinirsel aktivite etkisi kan ve potansiyel periferik karşı1,2,3hakaret.

BBB bütünlüğü ve onun gelişmiş geçirgenliği bozulma nörolojik çoğu için önemli bir özellik oluşturmak için uzun bilinmektedir ve Huntington hastalığı (HD)5,6, ancak de dahil olmak üzere4 nörodejeneratif hastalıklar , bu tür bir işlev bozukluğu sorumlu bir olgudur veya hastalık sırasında propagative bir olay hala belirsizdir. BBB arıza zamanlaması da zor kalır, ancak, bizim grup ve diğer kanıtlarla ortaya çıkan kesintiye BBB bütünlüğü bir geç olay oldukça erken bir adım6ama hastalık ilerleme,7 temsil etmiyor gösterir , uzun vadede sonuçlara yol açabilir 8.

Bu düşünce tanımışlar yararlı hastalık ilerleme ve beyin hasarı tahmin ve alternatif ve daha hedefli müdahaleler yeteneğine sahip başarılı bir şekilde geliştirmek için stratejiler geliştirmek amacıyla ateş BBB arıza ortaya önemlidir Böyle bir bozulma klinik sonuçlarını Azaltıcı. Güvenilir görüntüleme BBB bozukluğu olduğunu, bu nedenle, deneysel araştırma ve beyin hastalıkları klinik yönetim büyük önem taşımaktadır.

Bu yazıda, biz bir başarılı ve basit bir HD fare modeli BBB geçirgenliği değerlendirilmesi için yüksek molekül ağırlıklı floresein isothiocyanate etiketli-albumin (FITC-albümin) kullanarak açıklayınız. Normalde bariyer, beyin parankimi geçemez FITC-albümin ekstravazasyonu BBB kaçak dizin olarak ölçüldü. Fareler ve diğer patolojik durumlar cerebrovasculature bozukluğu9,10tarafından karakterize kolayca uyarlanabilir bir tekniktir.

Protokol

hayvanlar üzerinde tüm yordamları IRCCS Neuromed hayvan bakım inceleme Kurulu tarafından ve tarafından onaylanmış " Istituto Superiore di Sanità " (izni numarası: 1163/2015-PR) ve AB yönergesi 2010 kılavuzlarınıza uygun olarak / 63/EU hayvan deneyleri için.

1. juguler ven enjekte edilir FITC albümin çözüm hazırlanması

Not: tüm deneylerin taşınan dışarı bildirim (11 - haftalık) HD R6/2 fareler ve yaş ve cinsiyet eşlemeli vahşi-türü (WT) kontrol edildi littermates.

  1. Erime FITC-albümin toz (Tablo malzemeleri görmek) fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 mg/ml.
    Not: en iyi sonucu almak için bu taze her etiketleme reaksiyon için hazırlanmalıdır.

2. Hazırlık sırasında kullanılan ameliyat olmak için ekipman

  1. (bkz: Malzemeler tablo) daha önce autoclaved cerrahi aletler yatıyordu.
  2. Alkol (% 70 etanol çözüm) ile cerrahi tezgah temiz. Cerrahi steril tek kullanımlık havlu örtüsü ile cerrahi alan (45 cm x 45 cm) hazırlamak ve çalışma stereomicroscope kadar ayarla.

3. Juguler ven içine FITC albümin infüzyonu için cerrahi müdahale

  1. kaydetmek fare vücut ağırlığı için anestezi.
  2. Anesthetize fare mayi enjeksiyonu (IP) ketamin (100 mg/kg) - xylazine (10 mg/kg) çözüm uygun bir doz ile.
  3. Monitör hayvan sedasyon hafif ayak çimdik tarafından çekilme refleks gibi Walantus vd. 11 , 12.
  4. bir yukarı yönde sırtüstü pozisyonda imzalat fareyi getirin ve dört ayak ve kuyruk cerrahi tezgah üzerinde yapışkan bant ile düzeltmek.
  5. Fare güvenli sonra tıraş ile boyun uygun cerrahi kenar boşluğu dikkatle tıraş (Tablo malzemeleri görmek) ve povidone-iyot çözüm ve % 70 etanol ile dezenfekte.
  6. Pamuk temizleme bezi ile maruz traş yüzey kuru.
  7. Yavaşça traş deriyi çekin ve hattı üzerinde Toraks midway başlayan ve altında boyun sadece uzanan bir 1,5 cm uzun boyuna kesi, neşter, midclavicular tarafından olun.
  8. Dikkatli bir şekilde dış juguler ven ortaya çıkarmak için mikroskobik gözlem (5 X büyütme) altında Forseps ile ayrı bağ dokusu germek.
  9. Sağ ve sol tarafındaki juguler ven 30½ G iğne FITC albümin çözüm infüzyonu için ekleme kolaylaştırmak için yeterli alan olun.
  10. Hayvan intravenöz enjekte (juguler ven yavaş yavaş (üzerinde 3 dk) 10 mL/kg FITC albümin 100 µL ile 30½ G iğne kullanarak düzgün).
  11. 15 dakika sonra fareyi işten çıkarma tarafından ötenazi, hızla yukarıda açıklanan 13 olarak kafatası beyin kaldırmak ve için önceden soğutulmuş isopentane 15 dk içinde en az 10 beyin hacmi x bırakın.
  12. Beyin önceden soğutulmuş bir tüpe donmuş isopentane taşımak ve histolojik kesit kadar-80 ° C dondurucu içine saklayın.

4. Histolojik kesit, beyin infüzyon FITC albümin ile

  1. beyin en iyi kesim sıcaklık (OCT) bileşik donmuş Embed cryostat kesit (bakınız Tablo reçetesi) öncesinde.
  2. Seri olarak beyin cryostat ile 20 µm kalınlığında bölüme, kesmek (bkz. Tablo malzemeler) ve mikroskop cam slaytlar mount.
  3. FITC-albümin/laminin belirli bir kullanarak ortak boyama gerçekleştirmek anti-laminin antikor (tablo malzemeleri görmek) daha önce açıklandığı gibi 6.
    1. Kısaca, gece boyunca birincil antikor anti-laminin (pAb 1: 1000) bölümlerle kuluçkaya ve uygun ikincil antikor Cy3 için Birleşik devam.
    2. Coverslip slaytlar ile montaj orta 4 içeren ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (emme tepe 360 = nm; emisyon tepe 460 = nm (Tablo malzemeleri görmek).
    3. Kuru gecede karanlıkta 4 ° C'de slayttan ayrılmasını.
    4. Gözlemlemek boyama floresan mikroskop altında floresan (Tablo malzemeleri görmek) her iki FITC ile donatılmış 20 X büyütme, (emme tepe 495 = nm; emisyon tepe 525 = nm) ve Cy3 filtreleri (emme pik = 550 nm; emisyon tepe 570 = nm).
      1. Hemen boyama sonra örnekleri görüntülemek için coverslip tırnak cilası kullanarak köşelerinde güvenli ve onları (4.3.3) yukarıda mikroskop altında incelemek.

5. Floresan mikroskop yukarı ayarı ve edinme renkli görüntüler

  1. aşağıdaki gibi Floresans mikroskobu hazırlayın.
    1. Floresan lamba açmak kullanmadan önce yaklaşık 10 dakika. Mikroskop, bağlı bilgisayar ve dijital kamerayı açın. Görüntü analiz yazılımı çalıştırmak (Tablo malzemeleri görmek).
    2. En uygun sinyal koleksiyon ve Uzaysal çözünürlük için uygun amaç kullanın ve uygun filtreleri seçin.
  2. Edinme renkli görüntüler
    1. görüntü analiz yazılımı [canlı] komutunu seçin (bkz. Tablo malzeme) ve her filtre için en uygun aydınlatma parametrelerini ayarlayın.
    2. Tek kanallı renkli görüntü çekmek ve ölçek çubuğu eklemek için [freeze] komutunu seçin (' düzenleme > yanmak ölçek ')
    3. Her görüntü kaydetmek ' .tiff ' biçimi.
    4. Birleştirme kanalları tek bir resim halinde seçerek ' dosya > kanalını Birleştir ' ve buraya kaydeder
    5. TIFF ' biçimi.
    6. Edinme en az dört 24 bit renk resimleri (2200 µm x 3400 µm) beyin dilim (slayt başına 6 bölümler) başına.

6. FITC albümin ekstravazasyonu değerlendirilmesi

  1. Floresan yoğunluğu tek her kanal için çözümleme serbestçe kullanılabilir ImageJ 14 , 15.
  2. FITC albümin toplam floresan sinyal şiddeti her resim başına toplam CY3-Laminin floresan yoğunluğu tarafından normal duruma getirmeye ve yeşil floresan yoğunluğu olarak damarları dışında albümin extravasated raporu.

Sonuçlar

Uygun FITC albümin infüzyonu kan gelen yeşil Floresans izleme ekstravazasyonu BBB beyin parenchymawhen içine juguler ven sonuçlarında içine6ele geçirildi. Fizyolojik koşullar altında infüzyon floresan albümin dağılımı beyin kan damarlarının iç sınırlıdır ve çevreleyen Perivasküler alanı ve/veya beyin parankimi içinde sinyal yok algılanabilir (şekil 1A, Tarih Filmler üst). BBB nöro-patolojik şartlar altı...

Tartışmalar

Biz burada tarif teknik öncelikle beyin hastalığı koşullar altında BBB sızıntı tespit için yararlıdır. BBB disfonksiyon çeşitli nörolojik bozukluklar4ortak bir özelliği dikkat kazanıyor. Daha önce bu yaklaşım erken Akli dengesizlik BBB bütünlüğü, nadir nörodejeneratif hastalık HD6gibi bir fare modeli tanımlamak için kullanılır.

Bu yöntem doğru ve güvenilir sonuçlar sağlar yordam etkinliğini ve göreli basitli...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Teşekkürler

Bu eser "Fondazione Neuromed" tarafından desteklenen ve sağlık "Ricerca Corrente" VM için İtalyanca Bakanlığı tarafından finanse edilen

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugateSIGMAA9771-100MG
pAb anti-LamininNovus BiologicalsNB300-144
CY3 anti-rabbit made in goatMILLIPOREAP132
SUPERFROST PLUSThermo ScientificJ1800AMNZ
Cover Slips 24 X 50 mmThermo Scientific (DIAPATH)61050
Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compoundBio Optica05-9801
VECTASHIELD Mounting MediaVECTORH-1500Mounting media with DAPI
iNSu/Light Insulin Disposible SyringeRAYS Health &SafetyINS1ML26G13
30G 1/2"BD Microlance304000Needle for Insulin disposible Syringe
Scalpel HandleF.S.T.91003-12
#22 Disposable Scalpel bladsF.S.T.10022-00
Fine Iris scissors 10.5 cmF.S.T.14094-11
Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mmF.S.T.11251-35
Graefe Forceps 10 cmF.S.T.11051-10
Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mmF.S.T.11251-20
Medical patchMedicalis34788
Sterile disposable towel drapeDispotechTVO50VE
Stereoscopic MicroscopeNIKONSMZ 745 T
Optic Illuminator LED light (C-FLED2)NIKON1003167Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope
Eclipse Ni-U MicroscopeNikon932162Epifluorescence Microscope
Microscope digital CameraNikonDS-Ri2Microscope camera
IntenslightNikonC-HGFIMicroscope lamp
NIS-Elements 64 bitNikonAR 4.40.00Analysis Software
Electric RazorGemeiGM-3007

Referanslar

  1. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
  2. Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
  3. Moretti, R., et al. Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain. Front Neurosci. 9, 40 (2015).
  4. Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
  5. Drouin-Ouellet, J., et al. Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington's disease: Potential implications for its pathophysiology. Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).
  6. Di Pardo, A., et al. Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease. Sci Rep. 7, 41316 (2017).
  7. Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).
  8. van de Haar, H. J., et al. Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (2), 615 (2017).
  9. Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
  10. Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).
  11. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
  12. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. (9), e404 (2007).
  13. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  14. McCloy, R. A., et al. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).
  15. Burgess, A., et al. Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).
  16. Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions. PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).
  17. Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease. Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Neurosciencesay 129kan beyin bariyerini BBBBBB ge irgenli iFITC alb minateintraven z enjeksiyonfare modeli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır