Beurteilung der Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke durch intravenöse Infusion von FITC-markierte Albumin in einem Mausmodell der Neurodegenerative Erkrankung

Zusammenfassung

In dieser Studie stellen wir eine einfache und effiziente Verfahren zur Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke unter neurodegenerativen Erkrankungen. Um unser Ziel zu erreichen, wir infundiert hochmolekularen Fluorescein Herstellung gekennzeichnet (FITC)-Albumin in Maus Jugular Ader und die Leckage in der Anwesenheit von Fluoreszenz-Mikroskopie bewertet.

Zusammenfassung

Störung der Blut - Hirn-Schranke (BBB) Integrität ist ein gemeinsames Merkmal für verschiedene neurologische und Neurodegenerative Erkrankungen. Obwohl das Zusammenspiel gestört, BBB-Homöostase und die Pathogenese der Erkrankungen des Gehirns weiteren Untersuchungen benötigt, können die Entwicklung und Validierung eines zuverlässigen Verfahrens zum BBB Veränderungen genau zu erfassen entscheidend sein und ein nützliches Werkzeug für die potenziell Vorhersage Krankheit gezielt Fortschritt und Entwicklung von Therapiestrategien.

Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und effiziente Verfahren zur Bewertung BBB Leckage in einer neurodegenerativen Zustand wie das Auftreten in einem präklinischen Mausmodell der Huntington-Krankheit, in denen Mängel in der Durchlässigkeit der BBB altklug im eindeutig nachweisbar sind die Krankheit. Insbesondere die hochmolekularen Fluorescein Herstellung gekennzeichnet (FITC)-Albumin, das ist in der Lage, die BBB überqueren Sie nur, wenn letztere beeinträchtigt wird, ist akut in eine Maus Halsschlagader und deren Verteilung in den Bezirken Gefäß- oder parenchymatösen infundiert richtet sich dann nach Fluoreszenz-Mikroskopie.

Ansammlung von Grün fluoreszierend-Albumin in der Anwesenheit von fungiert als einen Index von aberranten BBB Permeabilität und beim quantitated mit Bild J-Processing-Software, wird berichtet, wie grüne Fluoreszenzintensität.

Einleitung

Homöostase innerhalb des zentralen Nervensystems (ZNS) ist eine Voraussetzung für die richtige Kommunikation und Funktion der neuronalen Zellen. Das CNS-Parenchym ist fest von der Peripherie durch die endotheliale Blut - Hirn-Schranke (BBB), abgedichtet, stellt die Schnittstelle zwischen den peripheren Blutkreislauf und dem Gehirn dar und spielt eine Schlüsselrolle in der Übersprechen zwischen diese beiden Bezirke^{1 ,2}. Die BBB ist eine komplexe und dynamischer dreidimensionale Struktur hauptsächlich bestehend aus spezialisierten Mikro-Schiff Endothelzellen (ECs) durch interzelluläre Knoten komplexe - tight Junctions (TJs) - miteinander verknüpft und umgeben von Perizyten, Neuron Endungen und Astrozyten Fuß Prozesse^1,2.

Unter physiologischen Bedingungen die extrem geringe Durchlässigkeit der intakten BBB sorgt für die strenge Regelung des Transports von Nährstoffen und anderen Molekülen in und aus dem Gehirn und ZNS bietet einen einzigartigen Schutz vor Veränderungen in der Zusammensetzung des Blutes, die neuronalen Aktivität beeinflussen könnten und gegen Potenzial peripheren Beleidigungen^1,2,3.

Störung des BBB Integrität und seine verbesserte Durchlässigkeit ist seit langem bekannt, bilden ein wesentliches Merkmal für viele neurologische und Neurodegenerative Erkrankungen⁴ einschließlich der Huntington-Krankheit (HD)^5,6, jedoch , ob solch eine Funktionsstörung eine ursächliche Phänomen ist oder ein vermehrenden Ereignis im Verlauf der Erkrankung noch unklar ist. Das Timing der BBB Aufteilung bleibt auch schwer, zeigt jedoch Anzeichen von unserer Fraktion und anderen gestörten BBB Integrität dar kein Ende Ereignis in der Progression der Erkrankung, sondern eher ein erster Schritt^{6,7 , 8}, die langfristige Auswirkungen haben kann.

Mit diesem Hintergrund ist es wichtig, altklug BBB Zusammenbruch der Neurodegeneration zu offenbaren, um Strategien nützlich, Krankheitsverlauf und Hirnschäden vorherzusagen und alternative und gezieltere Interventionen in der Lage, erfolgreich zu entwickeln Abschwächung der klinischen Folgen solch einer Unterbrechung. Zuverlässige Darstellung der BBB Beeinträchtigung ist daher von großer Bedeutung in der experimentellen Forschung und klinische Behandlung von Erkrankungen des Gehirns.

In diesem Beitrag beschreiben wir ein erfolgreiches und einfaches Verfahren für die Bewertung der BBB Permeabilität in einem HD-Maus-Modell mithilfe der hochmolekularen Fluorescein Herstellung gekennzeichnet-Albumin (FITC-Albumin). Extravasation von FITC-Albumin, die normalerweise die Schranke in das Gehirn Parenchym überqueren kann nicht gemessen wurde als Index der BBB Leckage. Diese Technik ist leicht anpassbar an Ratten und anderen pathologischen Zuständen zeichnet sich durch Cerebrovasculature Beeinträchtigung^9,10.

Protokoll

alle Vorgänge an Tieren wurden genehmigt durch das IRCCS Neuromed Animal Care Review Board und " Istituto Superiore di Sanità " (Anzahl zu ermöglichen: 1163/2015-PR) und wurden nach den Vorgaben der EU-Richtlinie 2010 / 63/EU für Tierversuche.

1. Vorbereitung der FITC-Albumin-Lösung in Halsschlagader injiziert werden

Hinweis: alle Experimente wurden durchgeführt in manifest (11 - Wochen alten) HD R6/2-Mäuse und in Alter und Geschlecht abgestimmt Wildtyp (WT) Kontrolle Wurfgeschwistern.

1. Auflösen FITC-Albumin Pulver (siehe Tabelle der Materialien) in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 10 mg/ml.
   Hinweis: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, dies sollten werden frisch zubereitet für jede Kennzeichnung Reaktion.

2. Vorbereitung der Ausrüstung werden verwendet während der Operation

1. legen Sie die zuvor autoklaviert chirurgische Instrumente (siehe Tabelle der Werkstoffe).
2. Reinigen die chirurgischen Bank mit Alkohol (70 % Ethanol-Lösung). Vorbereitung der OP-Bereich (45 x 45 cm) mit einem chirurgischen sterile Einweg-Handtuch drapieren und richten Sie die operativen Stereomikroskop.

3. Chirurgische Verfahren für FITC-Albumin-Infusion in die Halsschlagader

1. Maus Körpergewicht für Anästhesie aufnehmen.
2. Anesthetize Maus mit einer intraperitonealen Injektion (IP) einer angemessenen Dosis von Ketamin (100 mg/kg) - Lösung (10 mg/kg) Xylazin.
3. Monitor Tier Sedierung durch sanfte Zehe Prise zurückziehen Reflex, wie in Walantus Et al. ^{11 , 12}.
4. der narkotisierten Maus in Rückenlage aufgedeckt und die vier Beine und die Rute auf die chirurgische Werkbank mit Klebeband fixieren.
5. Nach die Maus gesichert ist, sorgfältig die entsprechenden chirurgischen Marge am Hals mit einem elektrischen Rasierapparat Rasieren (siehe Tabelle der Materialien) und mit Povidon-Jod-Lösung und 70 % Ethanol desinfizieren.
6. Die exponierte rasierte Oberfläche mit Wattestäbchen trocknen.
7. Sanft die rasierte Haut hochziehen und machen einen 1,5 cm lange längs-Schnitt, mit Skalpell, in der Midclavicular Linie, beginnend in der Mitte auf dem Brustkorb und Erweiterung auf knapp unterhalb des Halses.
8. Sorgfältig dehnen auseinander Bindegewebe mit der Pinzette unter mikroskopischer Beobachtung (5 X Vergrößerung), die äußere Halsschlagader aussetzen.
9. Gewährleisten eine ausreichend Platz auf der rechten Seite und links von der Halsschlagader, die Einfügung der 30½ G Nadel für die Infusion der FITC-Albumin-Lösung zu erleichtern.
10. Das Tier intravenös zu injizieren (Rechte Halsschlagader) langsam (über 3 min) mit 100 µL 10 mL/kg FITC-Albumin mit 30½ G Nadel.
11. Nach 15 Minuten einschläfern die Maus durch Enthauptung, schnell entfernen das Gehirn aus dem Schädel als zuvor beschriebenen ¹³ und Tauchen Sie ihn für 15 min in mindestens 10 x das Volumen des Gehirns selbst vorgekühlt Isopentane.
12. Bewegen der Isopentane Gehirn in ein vorgekühlt Rohr eingefroren und bis zur histologischen Schnitt in einem-80 ° C Gefrierschrank lagern.

4. Histologischen Schnitt des Gehirns infundiert mit FITC-Albumin

1. Embed gefrorene Gehirn in optimale Arbeitstemperatur (OCT) zusammengesetzte (siehe Tabelle der Materialien) vor der Kryostat schneiden.
2. Seriell das Gehirn in 20 µm dicke Schichten, mit einem Kryostat geschnitten (siehe Tabelle der Materialien), aus und klebe sie auf Glas-Objektträger.
3. Führen die FITC-Albumin/Laminin Co-Färbung durch die Verwendung eines bestimmtes Anti-Laminin-Antikörper (siehe Tabelle der Materialien) wie oben beschrieben ⁶.
   1. Kurz, Abschnitte mit dem primären Antikörper Anti-Laminin (pAb 1: 1000) über Nacht inkubieren und fahren Sie mit entsprechenden Sekundärantikörpers konjugiert, Cy3.
   2. Deckglas gleitet mit Eindeckmittel mit 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) (Absorption Peak = 360 nm; Emission Peak = 460 nm (siehe Tabelle der Materialien).
   3. Die Rutsche über Nacht trocknen bei 4 ° C im Dunkeln verlassen.
   4. Beobachten die Fluoreszenz Färbung unter dem Fluoreszenzmikroskop (siehe Tabelle der Materialien) mit 20 X Vergrößerung mit beiden FITC ausgestattet (Absorption Peak = 495 nm; Emission Peak = 525 nm) und Cy3 Filter (Absorption Peak = 550 nm, Emission Peak = 570 nm).
      1. Um die Proben sofort nach der Färbung zu sehen, das Deckglas an den Ecken mit Nagellack zu sichern und prüfen sie unter dem Mikroskop wie oben (4.3.3).

5. Fluoreszenz-Mikroskop Einstellung und Übernahme von Farbbildern

1. dem Fluoreszenzmikroskop wie folgt einrichten.
   1. Schalten die Fluoreszenz Lampe ca. 10 Minuten vor dem Gebrauch. Schalten Sie das Mikroskop, den angeschlossenen Computer und Digitalkamera. Die Bildanalyse-Software ausführen (siehe Tabelle der Werkstoffe).
   2. Das geeignete Ziel für optimales Signal Sammlung und räumlicher Auflösung, und wählen Sie geeignete Filter.
2. Erwerb von Farbbildern
   1. Wählen Sie den Befehl auf die Bildanalyse-Software [live] (siehe Tabelle der Materialien) und die optimale Ausleuchtung-Parameter für jeden Filter einrichten.
   2. Wählen Sie den Befehl [Freeze] das Einkanal-Farbbild und die Maßstabsleiste hinzufügen (' bearbeiten > brennen Skala ')
   3. Speichern Sie jedes Bild in der ' .tiff ' Format.
   4. Kanäle zu einem einzigen Bild zu verschmelzen, durch die Auswahl ' Datei > Merge Kanal ' und speichern Sie es in der
   5. Tiff ' Format.
   6. Erwerben mindestens vier 24-Bit-Farbe Bilder (2200 µm X 3400 µm) pro Gehirn-Scheibe (6 Sektionen pro Folie).

6. Bewertung der FITC-Albumin Extravasation

1. analysieren die Fluoreszenzintensität für jeden einzelnen Kanal mithilfe der frei verfügbare ImageJ ^{14 , 15}.
2. Normalisieren die totale Fluoreszenzsignal Intensität der FITC-Albumin durch die totale CY3 Laminin Fluoreszenz Intensität pro jedes Bild und berichten die extravasierten Albumin außerhalb der Gefäße als grün Fluoreszenzintensität.

Ergebnisse

Korrekte Infusion von FITC-Albumin in die Halsschlagader-Ergebnisse in der Extravasation der grünen Fluoreszenz Tracer aus dem Blutkreislauf in das Gehirn-Parenchymawhen ist die BBB gefährdet⁶. Unter physiologischen Bedingungen, Verteilung der infundierten fluoreszierende Albumin beschränkt sich auf das Innere der Blutgefäße des Gehirns und kein Signal in die umliegenden perivaskuläre Bereich und/oder Gehirn Parenchym ist nachweisbar (Abb...

Diskussion

Das Verfahren, die, das wir hier beschreiben, eignet sich in erster Linie zur Erkennung von BBB Leckage unter Erkrankungen des Gehirns. BBB-Dysfunktion gewinnt Aufmerksamkeit als ein gemeinsames Merkmal der vielfältigen neurologische Störungen⁴. Wir früher diesen Ansatz um die frühe Störung der BBB Integrität in einem Mausmodell der eine seltene Neurodegenerative Erkrankung wie HD⁶beschreiben.

Diese Methode nutzt die relative Einfachheit un...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate	SIGMA	A9771-100MG
pAb anti-Laminin	Novus Biologicals	NB300-144
CY3 anti-rabbit made in goat	MILLIPORE	AP132
SUPERFROST PLUS	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Cover Slips 24 X 50 mm	Thermo Scientific (DIAPATH)	61050
Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound	Bio Optica	05-9801
VECTASHIELD Mounting Media	VECTOR	H-1500	Mounting media with DAPI
iNSu/Light Insulin Disposible Syringe	RAYS Health &Safety	INS1ML26G13
30G 1/2"	BD Microlance	304000	Needle for Insulin disposible Syringe
Scalpel Handle	F.S.T.	91003-12
#22 Disposable Scalpel blads	F.S.T.	10022-00
Fine Iris scissors 10.5 cm	F.S.T.	14094-11
Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm	F.S.T.	11251-35
Graefe Forceps 10 cm	F.S.T.	11051-10
Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm	F.S.T.	11251-20
Medical patch	Medicalis	34788
Sterile disposable towel drape	Dispotech	TVO50VE
Stereoscopic Microscope	NIKON	SMZ 745 T
Optic Illuminator LED light (C-FLED2)	NIKON	1003167	Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope
Eclipse Ni-U Microscope	Nikon	932162	Epifluorescence Microscope
Microscope digital Camera	Nikon	DS-Ri2	Microscope camera
Intenslight	Nikon	C-HGFI	Microscope lamp
NIS-Elements 64 bit	Nikon	AR 4.40.00	Analysis Software
Electric Razor	Gemei	GM-3007