小鼠胚胎心肌内祖群的定量全贴免疫荧光分析

摘要

在这里, 我们描述了一个协议的全贴装免疫荧光和图像定量容积分析早期小鼠胚胎。我们提出这项技术是一个强有力的方法, 定性和定量评估心脏结构在发展过程中, 并提出它可能会广泛适用于其他器官系统。

摘要

使用不断进步的成像技术, 有助于我们增加对胚胎发育的理解。植入前发育和器官移植是两个领域的研究, 得益于这些进步, 由于数据的高质量, 可以直接从成像前胚胎或活体器官。虽然前胚胎产生的数据具有特别高的空间分辨率, 但后期阶段对三维重建的顺从性较差。为已知的胚胎结构获得高质量的3D 或体积数据, 与命运图或遗传谱系追踪相结合, 可以对发生在胚胎发育过程中的形态发生事件进行更全面的分析。

本议定书描述了一个完整的免疫荧光方法, 允许标记, 可视化, 并定量的祖细胞在发展中的心脏新月, 一个关键的结构在心脏发育过程中形成。这种方法的设计方式是, 可以获得细胞和组织级的信息。利用共焦显微镜和图像处理, 该协议允许三维心脏新月的空间重建, 从而提供了分析特定祖群的定位和组织的能力心脏发育的关键阶段。重要的是, 使用参考抗体可以连续掩蔽心脏新月和随后的定量测量的区域内的新月。本议定书不仅能够对早期心脏发育进行详细的检查, 而且应适用于肠早期节期小鼠胚胎的大多数器官系统。

引言

器官发生的研究一直依赖于发育中胚胎的形态发生事件的观察。这些研究往往依赖于使用荧光染料或血统追踪记者与标签的定义参考人口。¹通过比较这些标签的相对位置, 可以收集有关某一群体的起源、移动或最终贡献的信息。移植和命运映射实验使用形态学地标或染料射入 non-motile 血统定义兴趣细胞的出发点, 然后被审查为贡献对被开发的胚胎。^2,3,4,5遗传谱系跟踪实验使用与定义明确的报告等位基因相同的概念, 用于标记细胞数量, 而无需进行实验操作。这些方法的关键是能够确定, 具有高空间分辨率, 实验和参考标签的位置。这些方法在前发育和外植体研究方面取得了显著进展。^6,7,8,9

近年来, 心脏形态发生的发展事件越来越受到人们的广泛描述。¹⁰这一研究领域的主要发现之一是描述了一些可以通过独特标记的表达来区分的祖群。¹¹这些种群包括第一和第二个心脏领域 (FHF 和 SHF), 它们存在于胚胎前侧的心脏新月中 (E) 8.25 的小鼠发育。¹²这些种群经常通过广泛的显微镜的结合进行检查, 这提供了组织级的信息, 并通过免疫荧光分析进行了序列切片, 这提供了高的细胞分辨率, 但two-dimensional 空间信息。¹³因此, 虽然这些研究大大提高了我们对心脏发育的认识, 但现有的方法在这些阶段对形态发生的深入定量分析有限, 因此需要采取方法来检查这些人口的组织在一个整体有机体水平。

最近的进展, 共焦显微镜和3D 图像分析允许高分辨率和高通量算法重建的细胞和结构原位相对容易, 从而铺平了道路的详细研究复杂细胞结构。¹⁴随着计算能力的提高和大数据管理算法的发展, 既需要处理成像数据集大小的指数增长, 现在可以完全自动化分析。¹⁵对成像数据集的自动化分析具有无偏见的优点, 但它只与输入数据集的质量一样可靠;因此, 必须在采集和图像预处理过程中使用最佳, 以确保最高质量、无偏见的分析。¹⁶协议可以完全自动化并共享以实现重复性, 而专有软件所使用的算法也可通过库来方便地使用, 这些用户熟悉现代专有或开源开发工具。¹⁷

下面的协议解释了在心脏发育过程中对一个明确的器官形成模型进行分析的必要步骤。具体来说, 该协议描述了如何 (1) 收获和解剖心脏新月期胚胎, (2) 执行全贴装免疫荧光的参考 (Nkx2-5) 和实验 (Foxa2Cre:YFP^18,19) 标记, (3)使用共聚焦显微镜制备和成像胚胎, 最后 (4) 使用先进的三维方法对结果图像进行分析和量化。在这里, 以心脏新月为例, 通过适当的修改, 本协议可用于分析肠早期节期胚胎的多血统。

研究方案

此处描述的所有方法都已由西奈山医学院的伊坎医学院的机构动物保育和使用委员会批准.

1. 收集和处理心脏新月期胚胎

1. 交配一只肥沃的雌性老鼠。
2. 检查是否存在阴道交配插头使用钝探针或镊子。当天中午的插头检测被认为是胚胎日 (E) 0.5 (见 图 1A 完整的时间线).
   注: 插头应在上午检查, 因为他们是在整个一天丢失.
3. 在 8 ^{日 (E8.25) 的早晨, 通过 CO ₂ 吸入, 或根据当地和机构的规定牺牲怀孕的大坝.
   注意: 精确的时间可以是应变依赖, 并应由形态学经验.}
4. 用70% 乙醇喷洒鼠标的腹部, 清洁区域, 减少脱落。通过腹部切开皮肤和身体壁来揭露内脏.
5. 定位子宫并小心地从动物身上取出整个子宫角。首先从一个输卵管切开, 修剪脂肪远离子宫, 同时进行宫颈末端。通过宫颈切开并继续到另一端输卵管的上端, 切开整个子宫.
6. 将子宫放在10厘米的盘中, 用磷酸盐缓冲盐水 (PBS, pH 值 7.4) 冲洗掉多余的血液。通过切割 mesometrium 之间的 deciduum, 其中包含了胚胎, 解剖子宫。用新鲜的 PBS 将胚胎移植到一个6厘米的盘子里.
7. 在解剖显微镜下, 用细钳 (#5) 将子宫组织移离蜕组织.
8. 使用镊子, 仔细切片的 deciduum 的胚胎一半的尖端, 以揭示胚胎。捏 deciduum, 把胚胎取出, 小心地把胚胎取出.
9. 尽可能多地解剖外组织而不损害胚胎的形态学 ( 图 1B ).
10. 使用转移吸管将胚胎放置在1.5 毫升的试管中, 并在冰上放置新鲜的 PBS 和地方。对其余的胚胎重复 1.7-1.9, 然后继续.
11. 吸 pbs, 用 pbs 冲洗一次。吸气 PBS.
    注: 尽量去除尽可能多的 PBS, 而不损害或干燥的胚胎。建议在所有步骤中手动删除解决方案, 以避免丢失胚胎.
12. 在 RT 中为1小时在 PBS 中修复4% 甲醛 (粉煤灰) 的胚胎.
    注: 胚胎可在4和 #176 一夜之间固定 (O/N); C.
13. 用 PBS 冲洗三次。将胚胎保持在4和 #176; C 直到准备好进行免疫荧光.
    注意: 暂停点。胚胎可以安全地储存在 PBS 4 和 #176; C 几个星期.

2。免疫荧光染色

注意: 下面的孵化条件可以调整以适应不同的时间安排。建议使用轻柔摇动或摇动所有长潜伏期的步骤.

1. 删除 pbs, 并在 pbs 中添加1毫升的阻断缓冲器 (0.5% 皂苷、1% 牛血清白蛋白 (BSA)).
2. RT 时至少孵育4小时。这也可以在4和 #176 中完成; C.
3. 删除阻塞缓冲区, 并添加在阻塞缓冲区中稀释的主抗体混合物。在4和 #176 孵育 O/N; C.
   注: 请参阅材料部分以描述所使用的抗体和建议的稀释。抗体稀释应根据经验确定。推荐使用 Nkx2-5 作为心脏新月的参考色斑, 是下游图像分割和分析步骤的关键.
4. 通过吸入去除主抗体.
5. 在 PBS 中每1小时清洗3次, 每次使用0.1% 个海卫一.
6. 去除洗涤和添加二次抗体混合物稀释在堵塞缓冲。在 RT 处孵育3小时。这也可以在4和 #176 中完成; C.
7. 在 PBS 中用0.1% 个海卫一清洗3次, 每次1小时。这也可以在4和 #176 中完成; C.
8. Counterstain 与4和 #39;, 6-diamidino-2-吲 (DAPI) 在 PBS 中为 10 min.
   注: 此 counterstain 可同时进行二次抗体.
9. 在 PBS 中用0.1% 个海卫一清洗2次, 每次5分钟.
10. 缓慢地暂停防安装介质中的胚胎 (2% 伏无食子 nPG), 90% 甘油, 1x PBS;有关详细信息, 请参阅参考资料部分)。安装前允许平衡至少1小时。轻轻地弹管, 帮助胚胎落入防溶液.
    注意: 暂停点。胚胎可以储存数天, 在防的解决方案, 直到准备安装和图像.

3。显微镜下安装胚胎

1. 使用胶布磁带或硅胶垫片准备用于安装的显微镜幻灯片。如果使用胶布的磁带, 使两个平行的堆栈5-6 层约15-20 毫米分开。这将留下足够的空间来放置胚胎并确保片 ( 图 1C ).
2. 放置15和 #181; 在胶布磁带之间的幻灯片上放置防。小心地将一个胚胎转移到滑梯上.
   注意: 一个以上的胚胎可以放在一个幻灯片上。然而, 随后的方向步骤是更困难的多胚胎, 和长的成像时间可能导致光漂白.
3. 在解剖显微镜下使用细钳, 定位胚胎, 使前侧面远离幻灯片与身体轴与幻灯片的长轴线。有关安装安装的示意图, 请参见 图 1C .
4. 小心地将一个片放在样品上, 将一侧放在一叠胶布胶带上, 然后用镊子轻轻地降低片, 直到它与另一条带子接触.
   注意: 步骤3.3 和3.4 是确保胚胎成像正确方向的关键。通过降低片沿后向前方的方向, 胚胎不应该滚动和心脏新月区将保持远离幻灯片, 这是理想的倒置显微镜成像.
5. 使用吸管在幻灯片和片之间添加额外的防, 以防止样品在存储/成像过程中消失.

4。共焦成像

1. 使用最高放大率目标获取图像, 使整个心脏新月区在一个视场中被捕获。使用奈奎斯特采样率来确定 x-y-z 像素尺寸。大多数显微镜制造商将有一个和 #34; 优化和 #34; 按钮以确保奈奎斯特取样.
   注: Nkx2-5 染色在这里是有益的, 因为它将描绘整个心脏新月区。较小的 Z 步尺寸 (采样) 将产生更好的3D 建模结果, 但可能会导致延长采集时间和/或漂白一些样品.
2. 使用标准 best-imaging 实践设置成像参数。即, 使用尽可能低的激光强度, 以获得良好的信噪比为每个荧光, 并选择增益和抵消水平, 产生一个广泛的动态范围不饱和的信号.
   注: 与将直接比较的样品之间的成像参数保持一致。这对于下游3D 分析和量化尤为重要.

5。图像分析和定量3D 建模

注意:对于该协议, 使用 Imaris 软件包对图像进行了分析。类似的分析可能使用其他的软件包。下面的说明介绍了一个引用通道 ( 即 Nkx2-5) 和一个实验通道 ( 即 YFP) 的分析管道。可以通过重复这些步骤来分析其他通道。提供了一个示例数据集, 可用于复制下面的分析.

1. 将原始图像数据集加载到 Imaris 竞技场视图中, 并在超过视图中为所需的胚胎打开文件。数据应在3D 视图中加载 MIP (最大) 模式。打开 "显示调整" 窗口, 并只选择参考通道.
2. 如果需要, 可调整图像的阈值, 以便更好地进行可视化。对于这个分析, 如果信噪比过低, 则调整伽玛.
   注意: 如果执行伽玛校正, 这是非线性调整, 调整后的图像不能用于强度测量或比较。在这个阶段, 你可以进行进一步的图像预处理 (如光照校正, 高斯模糊或其他过滤), 如果你的信噪比是不满意的。如果选择进行预处理, 则必须对数据集中的所有图像执行相同的预处理步骤.
3. 使用曲面算法对话框为参考通道创建新曲面.
   1. 选择和 #34; 只对感兴趣的区域和 #34 进行细分; 复选框.
   2. 调整边界框区域, 使其包含感兴趣的区域 (ROI), 即 "参考色斑" 所描述的 心脏新月区).
   3. 从源通道下拉菜单中选择参考通道。默认的平滑设置 (等于 z 像素大小) 通常是足够的, 但可能需要经验优化。对于此分析, 使用平滑等于 z voxel-size 的一半.
   4. 按绝对强度进行阈值化。要确保曲面不延伸到通道信号之外, 请使用滑块调整下限.
      注意: 对于某些可以很容易划定细胞的图像, 可以包括 #34; 分割触摸的对象和 #34; 算法, 以便进一步将信号与背景分开.
   5. 按体素数字或体积筛选对象, 并拒绝背景 (小或在 Nkx2-5 区域之外的区域中找到) 该算法可能生成的对象。完成算法.
4. 使用新创建的曲面, 为实验通道创建一个屏蔽通道.
   1. 如果选定了曲面, 则从 "编辑" 窗口中选择 #34; 掩码 Sel... #863; #34; 函数.
   2. 选择感兴趣的实验通道 ( 即 YFP)。在应用掩码和 #34 之前确保 #34;D 重复通道; 选中复选框.
5. 在显示调整窗口中只选择屏蔽通道。按照步骤 5.3-5.3. 5, 为掩码通道创建一个新曲面.
   注意: 此时调整每个掩码的外观有助于3D 模型的可视化: 选择每个曲面并选择 "颜色" 选项卡. 根据需要调整基本颜色和透明度。重叠时, 曲面颜色不合并.
6. 若要获取所需的体积数据, 请选择 "统计" 选项卡。在和 #34;D etailed 和 #34; 子, 选择和 #34; 平均值和 #34; 从下拉菜单中。在生成的表的 Sum 列中可以找到该曲面的总体积.
   注意: 如果生成的曲面包含错误的片段 ( 即 片段, 这些片断是在分割期间未排除的背景信号或从主表面间断的区域), 则可能需要手动计算总卷, 或按体的体积或数量过滤曲面, 并确保计算中只包含信号段。通过选择和 #34, 所有的值和 #34; 从下拉菜单中, 可以找到每个曲面部分的音量。选择每个值将使相应区域显示为黄色, 这有助于确定要排除的值.

结果

最终数据和分析的质量很大程度上取决于 (1) 解剖胚胎的完整性和形态学, (2) 使用高特异性抗体, (3) 正确设置成像参数。受损的胚胎会混淆表面生成过程, 阻碍定量分析。正确解剖和分期胚胎的例子如图 2B所示。胚胎可以通过去除卵黄囊进行进一步的解剖, 抗体会经常非。然而, 去除卵黄囊会使胚胎变得不那么健壮, 因此在下游处理过程中应注意。

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讨论

上面的协议描述了从高质量的 post-implantation 小鼠胚胎免疫荧光图像中获取定量数据的策略。当正确执行时, 通过这些步骤生成的3D 体积数据可用于胚胎内多个域的比较和交叉分析。表面信号掩蔽方法的描述是特别使用时, 研究新的细胞数量与公认的参考结构比较。

我们认为, 这种方法比现有方法具有明显的优势。全贴装免疫荧光与广域成像可以提供组织级信息, 但缺乏细胞分?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt probe	Roboz	RS-9580
Forceps	Roboz	RS-8100
Fine forceps	Roboz	RS-5015
Dissection scissors	Roboz	RS-5912
Saponin	Sigma Aldrich	84510
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A8022
Triton	RPI	A4490
Goat anti-Nkx2-5	Santa Cruz Biotech	sc-8697	Used at 1:100-1:500
Chicken anti-GFP	abcam	ab13970	Used at 1:500
Rabbit anti-Islet1	abcam	ab109517	Used at 1:100
Rabbit anti-Hcn4	Millipore	AB5808	Used at 1:100
488 anti-chicken	Jackson Immunoresearch	703-546-155	Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
555 anti-goat	Thermo Fisher Scientific	A21432	Used at 1:500
647 anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	711-606-152	Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
n-Propyl gallate	Sigma Aldrich	2370	Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution.
Superfrost Plus microscopy slides	VWR Scientific	48311-703
22x22 mm coverslips	VWR Scientific	48366-227
Imaris 8.4.1	Bitplane