Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

Özet

Burada, Bütün Dağı ayirt ve nicel hacimsel analizi erken sahne fare embriyo yansıma tabanlı bir protokol açıklayın. Bu teknik nitelik ve nicelik geliştirme sırasında kalp yapıları değerlendirmek ve diğer organ sistemleri yaygın olarak adapte olması teklif için güçlü bir yaklaşım olarak mevcut.

Özet

Şimdiye kadar ilerleyen görüntüleme teknikleri genel olarak artan embriyonik gelişim anlayışımızı katkıda bulunmuştur. Ön-implantasyon geliştirme ve organogenesis bu büyük ölçüde bu gelişmeler, doğrudan ön-implantasyon embriyo görüntüleme veya ex vivo organ elde edilebilir veri yüksek kalitesi nedeniyle gelen benefitted var. iki araştırma alanlarıdır. Ön-implantasyon embriyo özellikle yüksek Uzaysal çözünürlük verilerle vermiştir, daha sonraki aşamaları daha az üç boyutlu yeniden yapılmasına müsait edilmiş. Kader eşleme veya genetik soy izleme ile birlikte bilinen embriyonik yapıları için yüksek kaliteli 3D veya hacimsel veri alma morfogenetik olaylar sırasında embriyogenez meydana daha kapsamlı bir analiz için izin verir.

Bu iletişim kuralı bir anahtar yapısı kalp geliştirme sırasında oluşan etiketleme, görselleştirme ve progenitör hücre popülasyonlarının gelişmekte olan kardiyak Hilal içinde miktar için sağlar bir bütün-mount ayirt yaklaşımı açıklar. Yaklaşım bu tür yerlerde tasarlanmıştır bir şekilde her iki hücre ve doku düzeyinde bilgi elde edilebilir. Confocal mikroskobu ve görüntü işleme kullanarak, bu iletişim kuralı böylece Yerelleştirme ve organizasyon sırasında belirli progenitör nüfusun analiz yeteneği sağlayan kalp Hilal üç boyutlu kayma yeniden inşası için izin verir kalp gelişiminin bu kritik aşama. Önemlisi, kardiyak Hilal ardışık maskeleme ve hilal içinde alanların sonraki nicel ölçümler için başvuru antikor kullanımı sağlar. Bu protokolü yalnızca ayrıntılı bir inceleme erken kalp geliştirme, izin vermez ama uyarlamalar ile erken somite sahne fare embriyo için gastrula en organ sistemleri için geçerli olmalıdır.

Giriş

Organogenesis çalışmanın uzun gelişmekte olan embriyo morfogenetik olayların gözlenmesi üzerine güvendi. Bu çalışmalar sık tanımlanmış başvuru nüfus etiketleme ile floresan boyalar veya soy izleme gazetecilere birlikte kullanımı güveniyor. ¹ bu etiketlerin göreli konumlar karşılaştırarak, bilgi kökeni, hareketini ve nihai ilgi nüfusu katkısını panoda. Transplantasyon ve kader eşleme deneyler morfolojik yerler veya boya hareketli soy içine enjeksiyon sonra Gelişmiş embriyo katkılardan ötürü incelenir faiz, hücrelerinin başlangıç noktasını tanımlamak için kullanın. ^{2 , 3 , 4 , 5} etiket hücre popülasyonlarının deneysel manipülasyon olmadan eskiden iyi tanımlanmış muhabir gen ile aynı kavram genetik soy izleme deneyler kullanın. Yeteneği yüksek Uzaysal çözünürlük, deneysel yerlerini ve başvuru etiketleri ile belirlemek için bu yaklaşımlar anahtarıdır. Bu yaklaşımlar ön-implantasyon geliştirmede olağanüstü ilerleme vermiştir ve organogenesis çalışmalar explant. ^{6 , 7 , 8 , 9}

Kalp morfogenez altında yatan gelişimsel olayları son yıllarda giderek daha iyi tarif edilmiştir. ¹⁰ araştırma bu alanda büyük keşiflerinden birini benzersiz işaretleri ifade tarafından seçkin atası nüfus sayısı açıklaması bulunur. ¹¹ ilk ve ikinci kalp embriyonik gününde (E) 8,25 fare gelişme embriyo ön tarafındaki kardiyak Hilal içinde var olmayan (FHF ve SHF), bu örneğin alınma olasılığını içerir. ¹² bu nüfus sık ama sadece yüksek hücresel çözünürlük sunan doku düzeyinde bilgi ve seri kesit ayirt deneyleri ile sağlayan, geniş alanlı mikroskobu, bir arada yoluyla incelenir iki boyutlu mekansal bilgi. ¹³ bu çalışmalar büyük ölçüde kalp geliştirme, anlayışımızı gelişmiş iken böylece, kullanılabilir yöntemleri morfogenez derinliği kantitatif analiz bu aşamalarında incelemek yaklaşımlar gereksinimini oluşturma sınırlı Bu nüfus bir bütün-organizma düzeyinde organizasyonu.

Son gelişmeler confocal mikroskobu ve 3D görüntü analizi yüksek çözünürlüklü ve yüksek işlem hacmi algoritmik rekonstrüksiyonu, hücreler ve yapıları içinde in situ için göreli kolaylıkla izin böylece ayrıntılı çalışmalar kompleks önünü hücresel yapılar. ¹⁴ bir işlem gücü artış ve büyük veri yönetim algoritma, veri setleri, Imaging boyutta üstel artış işlemek için her iki gerekli geliştirme ile analizleri şimdi tamamen otomatik hale getirilebilir. ¹⁵ otomatik analiz görüntüleme veri kümelerinin tarafsız olmanın verdiği avantajla vardır, ama sadece giriş veri kümesi kalite güvenilir; Bu, o zaman, en iyi yöntemler edinme ve görüntü ön işleme sırasında en yüksek kalite, tarafsız analiz sağlamak için kullanıldığını zorunludur. ¹⁶ iletişim kuralları tamamen otomatik ve tekrarlanabilirlik için paylaşılan olabilir ve özel mülk yazılım tarafından kullanılan algoritmalar kolayca modern özel olarak bilindiğini var bilim adamları tarafından kullanılmak üzere Kütüphaneler üzerinden kullanılabilir veya açık kaynak geliştirici araçları. ¹⁷

Aşağıdaki iletişim kuralı bir iyi tanımlanmış modeli bir organogenesis, kardiyak Hilal oluşumu kalp geliştirme sırasında bu tip çözümlemeler gerçekleştirmek için gerekli adımları açıklar. Özellikle, bu iletişim kuralını (1) hasat açıklar ve kardiyak Hilal sahne embriyo incelemek, gerçekleştirmek (2) bütün Dağı ayirt için referans (Nkx2-5) ve deneysel (Foxa2Cre:YFP^18,19) işaretleri, (3) hazırlamak ve confocal mikroskobu kullanılarak embriyo resim ve son olarak (4) analiz ve gelişmiş üç boyutlu yaklaşımlar kullanarak elde edilen görüntüleri ölçmek. Kardiyak Hilal uygun değişiklik ile burada, bir örnek kullanılırken bu protokolü gastrula erken somite sahne embriyolar için birden çok soy analizi için kullanılabilir.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Mount Sinai Tıp Icahn okul tarafından onaylanmış olan.

1. hasat ve işleme kardiyak Hilal sahne embriyo

1. verimli bir dişi fare ile verimli damızlık erkek dostum.
Bir künt sonda veya forseps kullanarak
2. onay vajinal birleşme varlığı için tak. Öğlen tak algılama günü olarak kabul edilir embriyonik gün (E) 0.5 (bkz: şekil 1A tam zaman çizelgesi için).
   Not: gün boyunca kayıp oldukları gibi fişler için sabahları, denetlenmesi.
3. (E8.25) 8 ^inci günün sabahı, hamile Barajı CO ₂ Solunduğunda veya yerel ve kurumsal düzenlemelere göre kurban.
   Not: Tam zamanlama zorlanma bağımlı olabilir ve ampirik olarak Morfoloji tarafından belirlenmesi gerektiğini.
4. Fare karın alanı temizleyin ve dökülme en aza indirmek için % 70 etanol ile sprey. İç organlar karın bir kesi cilt ve vücut duvar üzerinden gerçekleştirerek maruz.
5. Rahim bulun ve tüm rahim boynuz hayvandan dikkatli bir şekilde çıkarın. Yukarıda bir ovidukt, rahim rahim ağzı sonuna geçmeden süre uzak yağları azaltma keserek başlayın. Serviks kesme ve üst diğer ovidukt tüm rahim serbest bırakmak için kesme, sonuna kadar devam.
Fosfat ile
6. yeri 10 cm rahmine çanak arabelleğe alınmış serum (aşırı kan silsin için PBS, pH 7,4). Rahim mesometrium embriyo içerir her deciduum arasında kesim tarafından alt incelemek. Taze PBS ile 6 cm çanak embriyo transfer.
7. Uzak decidual doku rahim dokusu kaldırmak için iyi forseps (#5) bir diseksiyon mikroskop altında kullanın.
8. Kullanma forseps, dikkatle embriyonik daha embriyo ortaya çıkarmak için deciduum bir ucu dilim. Embriyo itmek ve dikkatle embriyo çıkar deciduum tutam.
9. Embriyo ( şekil 1B) Morfoloji zarar vermeden mümkün olduğu kadar uzak extraembryonic doku teşrih.
10. Embriyo taze PBS ile 1,5 mL tüp yerleştirin ve buza yerleştirmek için bir transfer pipet kullanın. Devam etmeden önce için kalan embriyo 1.7-1.9 yineleyin.
11. Aspiratı PBS ve durulama kez PBS ile. PBS Aspire edin.
    Not: zarar veya embriyo kurutma olmadan mümkün olduğu kadar PBS kaldırmayı deneyin. El kaldırma çözümleri tüm adımları embriyo kayıplarını önlemek için tavsiye edilir.
Dik, 1 h için
12. düzeltme embriyo % 4 ile paraformaldehyde (PFA) PBS içinde
    Not: Embriyo sabit gecelik (O/N) 4 ° C.
13. Üç kez PBS ile durulama. Embriyo 4 ° C'de ayirt ile devam etmek için hazır kadar devam.
    Not: noktası duraklatma. Embriyo güvenli bir şekilde saklanabilir PBS içinde 4 ° C'de birkaç hafta için.

2. Ayirt Staining

Not: kuluçka koşulları aşağıdaki farklı zamanlamaları karşılamak için ayarlanabilir. Nazik sallayarak veya tüm uzun bir kuluçka adımları için sallanan kullanım önerilir.

1. PBS kaldırıp engelleme arabellek (% 0.5 saponin, PBS içinde % 1 sığır serum albümin (BSA)) 1 mL ekleyin.
2. En az 4 h RT. kuluçkaya Bu da O/N 4'te yapılabilir ° C.
3. Engelleme arabellek kaldırmak ve engelleme arabellekte seyreltilmiş birincil antikor karışımı ekleyin. O/N 4 ° C'de kuluçkaya
   Not: Antikor açıklaması için bkz: belgeleri bölümüne kullanılan ve dilutions önerdi. Antikor dilutions ampirik olarak tespit edilmelidir. Kardiyak Hilal başvuru leke olarak Nkx2-5 kullanımı tavsiye edilir ve aşağı akım için anahtar görüntü segmentasyonu ve analiz adımdır.
4. Aspirasyon tarafından kaldırmak birincil antikorlar.
5. Yıkama % 0.1 ile her 1 h için 3 kez PBS Triton.
6. Yıkama kaldırmak ve engelleme arabellekte seyreltilmiş ikincil antikor karışımı ekleyin. Dik, 3 h için kuluçkaya Bu da O/N 4'te yapılabilir ° C.
7. Yıkama % 0.1 ile her 1 h için 3 kez PBS Triton. Bu da O/N 4'te yapılabilir ° C.
4
8. counterstain ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) PBS içinde 10 dakika süreyle
   Not: Bu counterstain aynı anda ile ikincil antikor gerçekleştirilebilir.
9. Yıkama 2 kez % 0.1 ile her 5 min için PBS Triton.
10. Yavaş yavaş embriyo Anti-fade montaj medyada (% 2 w/v n-propil gallat (nPG), % 90 gliserol, 1 x PBS; askıya. Daha fazla ayrıntı için malzeme bölümüne bakın). En az 1 h montaj önce equilibrate olanak sağlar. Yavaşça düzenli olarak anti-fade çözüm damla embriyo yardım için tüp fiske.
    Not: noktası duraklatma. Embriyo saklanabilir Anti-fade çözüm içinde birkaç gün kadar Dağı ve görüntü hazır.

3. Embriyo mikroskopi için montaj

1. hazırla mikroskop slaytlar çift sopa şerit ya da silikon çubukları kullanarak montaj için. Çift sopa şerit kullanarak, 5-6 kat yaklaşık 15-20 mm iki Paralel Yığınlar ayrı olun. Bu embriyoların yerleştirin ve coverslip ( şekil 1 c) güvenli için yeterli alan bırakacaktır.
2. Anti-fade 15 µL damlasını çift sopa şerit arasında slayt üzerine yerleştirin. Dikkatle slayda bir embriyo transfer.
   Not: birden fazla embriyo bir slayt üzerinde yerleştirilebilir. Ancak, sonraki yönlendirme adımları ile birden fazla embriyo daha zordur ve fotoğraf-ağartma neden olabilir uzun süreler Imaging.
3. Slayt Slayt uzun ekseni doğrultusunda vücut eksenli uzak ön yüzü öyle ki iyi forseps kullanarak bir diseksiyon mikroskop altında embriyo getirin. şekil 1 c montaj kurulum bir şematik için bkz.
4. Dikkatle yer bir coverslip örnek üzerinde bir tarafı çift sopa şerit bir yığın üzerinde dinlenme ve forseps kullanarak diğer kaseti kişiler kadar coverslip yavaşça indirin.
   Not: Adım 3.3 ve 3.4 embriyo görüntüleme için doğru yönünü emin olmak için kritik öneme sahiptir. Coverslip posterior anterior yönde boyunca düşürerek, embriyo değil rulo ve kardiyak Hilal bölge ters bir mikroskop üzerinde görüntüleme için idealdir slayt uzak odaklı kalacak.
5. Slayt ve örnek depolama/görüntüleme sırasında ölmek tutmak için coverslip arasında ek Anti-fade eklemek için bir pipet kullanın.

4. Confocal görüntüleme

1. edinme imge bir görüş alanı içinde yakalanması tüm kalp Hilal bölge için verir en yüksek büyütme amacı istimal. Nyquist örneklendirme oranı x-y-z Voksel boyutlarını belirlemek için kullanın. Mikroskop üreticilerinin çoğu olacak bir " en iyi duruma " Nyquist örnekleme sağlamak için düğmesini.
   Not: tüm kalp Hilal bölgenin betimlemek gibi Nkx2-5 için boyama burada, faydalı olduğunu. Küçük Z-adım boyutları (deπiµtirebilme) daha iyi 3D modelleme sonuçları verecektir ama genişletilmiş edinme kez ve/veya bazı örnekler için beyazlatma neden olabilir.
2. Standart en iyi görüntüleme yöntemleri kullanarak parametrelerini görüntüleme ayarla. Yani, her fluorophore için iyi sinyal-gürültü oranı elde etmek ve kazanç seçin ve geniş dinamik alan sinyali doyurarak olmadan verim düzeyleri ofset için en düşük olası lazer yoğunluğu kullanın.
   Not: parametreleri doğrudan Karşılaştırılacak örnek arasında Imaging ile tutarlı olması. Aşağı akım 3D analiz ve miktar için önem kazanır.

5. Görüntü analizi ve nicel 3D modelleme

Not: Bu iletişim kuralı için Imaris yazılım paketi kullanarak görüntüleri analiz edildi. Benzer analiz alternatif paketleri kullanarak mümkün olabilir. Aşağıdaki açıklamayı analiz boru hattı için bir referans kanal (Yani Nkx2-5) ve bir deneysel kanal (Yani YFP) kapsar. Ek kanalları adımları tekrarlama çözümlenebilir. Bu analiz çoğaltmak için kullanılabilir sağlanan bir örnek veri kümesi oldu.

1. Imaris Arena görünüme raw görüntü veri kümeleri yüklemek ve dosya için istenen embriyo Surpass görünümünde açın. Verileri MIP (en çok) modunda 3D görünümünde yüklemek. Ekran ayarlaması penceresi açın ve sadece referans kanal seçin.
2. Daha iyi görselleştirme için gerekirse görüntü eşik ayarlayın. Sinyal-gürültü oranı bölümleme için çok düşükse bu çözümleme için gama ayarlamak.
   Not: doğrusal olmayan ayarlar olan gama düzeltmeleri gerçekleştirme ayarlanan görüntü yoğunluk ölçümleri veya karşılaştırmalar için kullanılamaz. Bu aşamada, sinyal-gürültü oranı tatmin edici değilse daha fazla görüntü ön işleme (yani aydınlatma düzeltmeler, Gauss Bulanıklığı veya diğer filtreleme), gerçekleştirebilirsiniz. Ön işleme yapmayı seçerseniz, aynı ön-işleme adımları tüm resimler için veri kümesi içinde gerçekleştirmelisiniz.
3. Yüzey algoritması diyalog kullanarak referans kanal için yeni bir yüzey oluşturma.
   1. Seçin " ilgi sadece bir bölge Segment " onay kutusu.
   2. Başvuru leke tarafından belirlenen gibi bölgenin ilgi (yatırım Getirisi, Yani kalp Hilal alan) içerip sınırlayıcı kutusunu bölge ayarlayın.
   3. Referans kanal kaynak kanalı açılır menüden seçin. Yumuşatma (z Voksel boyutuna eşit) için varsayılan ayar genellikle yeterli olmakla birlikte ampirik optimizasyonu gerektirebilir. Bu çözümleme için yarım z voxel-boyutuna eşit yumuşatma kullanın.
   4. Gerçekleştir eşik mutlak yoğunluğu tarafından. Yüzey kanal sinyal genişletmek değil emin olmak için kaydırıcıları kullanarak alt sınırı ayarlamak.
      Not: nerede hücreleri belirlenen kolayca belirli görüntüleri için dahil edebileceğiniz " nesneleri dokunmadan bölünmüş " algoritma daha fazla ayrı sinyalinizi arka plan,.
   5. Nesneleri Voksel numarası veya birim tarafından filtre ve algoritma oluşturulan (küçük veya alanlarda Nkx2-5 alan dışında bulunan) arka plan nesnelerine reddediyorum. Algoritma bitirmek.
4. Yeni oluşturulan yüzeyi kullanarak oluşturmak için deneysel kanal maskeli bir kanal.
   1. Seçili surface(s) ile seçin " maskesi Sel..... ͟ " düzenleme penceresi işlevinden.
   2. İlgi (Yani YFP) deneysel kanalı seçin. Emin olun " yinelenen kanal maske uygulamadan önce " onay kutusu seçildiğinde.
5. İçinde ekran ayarlaması penceresi yalnızca maskeli kanal seçin. 5.3-5.3.5 takip ederek maskeli kanal adımlar için yeni bir yüzey oluşturma.
   Not: Bu noktada 3D modelin görselleştirme kolaylaştırmak için her maskeyi görünümünü ayarlamak yararlı olabilir: her yüzey seçin ve renk sekmesini ayarlama temel renk ve saydamlık gerektiği gibi seçin. Yüzey renkleri değil ne zaman üst üste birleştirme.
Seçili her yüzey hacimsel veri elde etmek için
6. istatistik sekmesini seçin. İçinde " detaylı " alt sekmesinde, seçim " ortalama değerleri " aþaðý açýlan menüsünden. Yüzey hacmi toplamı sütun oluşturulan tablo bulunabilir.
   Not: oluşturulan yüzey hatalı parçaları (Yani arka plan sinyalini segmentasyon veya alanları ana yüzeyden kesintili sırasında hariç değildir parçaları) içeriyorsa, bu el ile Toplam hacim hesaplamak gerekli olabilir veya yüzeyler birim veya voxels sayısı tarafından filtre ve sadece sinyal kesimleri hesaplamasına dahil emin olun. Her bir bölümünü yüzey için birim seçerek bulunabilir " tüm değerleri " aþaðý açýlan menüsünden. Her değer seçerek karşılık gelen bölge dışlamak için değerleri belirlemede yardımcı sarı görünür yapacak.

Sonuçlar

Son veri ve analiz kalitesini büyük ölçüde (1) bütünlük ve Morfoloji disseke embriyolar, (2) yüksek özgüllük antikor kullanımı ve (3) uygun kurulum parametrelerini görüntüleme üzerinde bağlıdır. Hasarlı embriyo yüzey oluşturma işlemi yıkmak ve kantitatif analiz engel. Düzgün disseke ve aşamalı embriyo örnekleri şekil 2Biçinde gösterilir. Embriyolar daha fazla sarısı sac için sık sık özellikle olmayan antikorlar bağlaya...

Tartışmalar

Yukarıdaki Protokolü Nicel veri sonrası implantasyon fare embriyolar kaliteli bütün Dağı ayirt görüntüleri elde etmek için bir strateji açıklar. Doğru gerçekleştirilen, bu adımlarda oluşturulan 3D hacimsel veri karşılaştırmalı ve intersectional analiz embriyo içindeki birden çok etki alanı için kullanılabilir. Açıklanan yaklaşım maskeleme yüzey sinyal belirli roman hücre popülasyonlarının köklü başvuru yapıları ile karşılaştırıldığında soruşturma zaman kullanılır.

...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt probe	Roboz	RS-9580
Forceps	Roboz	RS-8100
Fine forceps	Roboz	RS-5015
Dissection scissors	Roboz	RS-5912
Saponin	Sigma Aldrich	84510
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A8022
Triton	RPI	A4490
Goat anti-Nkx2-5	Santa Cruz Biotech	sc-8697	Used at 1:100-1:500
Chicken anti-GFP	abcam	ab13970	Used at 1:500
Rabbit anti-Islet1	abcam	ab109517	Used at 1:100
Rabbit anti-Hcn4	Millipore	AB5808	Used at 1:100
488 anti-chicken	Jackson Immunoresearch	703-546-155	Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
555 anti-goat	Thermo Fisher Scientific	A21432	Used at 1:500
647 anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	711-606-152	Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
n-Propyl gallate	Sigma Aldrich	2370	Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution.
Superfrost Plus microscopy slides	VWR Scientific	48311-703
22x22 mm coverslips	VWR Scientific	48366-227
Imaris 8.4.1	Bitplane