Анализ количественного состава Гора иммунофлюоресценции сердечной прародитель населения в эмбрионов мыши

Резюме

Здесь мы описываем протокол для всей горе иммунофлюоресценции и на основе изображений количественные объемный анализ зародышей мыши ранней стадии. Мы представляем этот метод как мощный подход к качественно и количественно оценить сердечных структур во время разработки и предложить, что это может быть широко адаптируемым для других органов и систем.

Аннотация

Использование изображений методов, когда-либо продвижения широко способствовала нашей углубление понимания эмбрионального развития. Развитие предимплантационной и Органогенез являются две области исследований, которые значительно выиграли от этих достижений, за высокое качество данных, которые могут быть получены непосредственно от визуализации до имплантации эмбрионов или ex vivo органов. Хотя до имплантации эмбрионов привели данные с особенно высоким пространственным разрешением, более поздних стадиях были менее поддаются трехмерной реконструкции. Получение высококачественных 3D или объемных данных для известных зародышевых структур в сочетании с судьбой сопоставления или генетические линии трассировки позволит обеспечить более всесторонний анализ морфогенетических событий, происходящих во время эмбриогенеза.

Этот протокол описывает целом гора иммунофлюоресценции подход, который позволяет для маркировки, визуализации и количественной оценки прародитель клеточных популяций в пределах развивающихся сердца Полумесяца, ключевая структура формируется во время разработки сердца. Этот подход разработан таким образом, что обе на уровне клеток и тканей информация может быть получена. С помощью конфокальной микроскопии и обработки изображений, этот протокол позволяет для трехмерной пространственной реконструкция сердца Полумесяца, обеспечивая тем самым возможность анализировать локализации и организации населения конкретных прародитель во время этот критический этап развития сердца. Важно отметить, что использование ссылка антител позволяет для последовательных маскировки сердца Полумесяца и последующих количественному определению областей в течение Полумесяца. Этот протокол позволит не только подробный анализ раннего развития сердца, но с адаптации должны быть применимы к большинства органов и систем в братскую для раннего Сомит стадии эмбриона мыши.

Введение

Изучению органогенеза долго полагалась на наблюдении за морфогенетических события развивающегося эмбриона. Эти исследования часто полагаются на использование флуоресцентных красителей или Репортеры трассировки линии в сочетании с маркировки населения определенных ссылок. ¹ путем сравнения относительных позиций этих ярлыков, информацию можно почерпнуть на происхождении, движение или конечной вклад населения интерес. Трансплантация и судьба сопоставления эксперименты использовать морфологический достопримечательности или инъекции красителей в не подвижных линий для определения отправной точкой клетки интереса, которые затем проверяются на вклад развитых эмбрионов. ^{2 , 3 , 4 , 5} генетические эксперименты линии трассировки используйте ту же концепцию с четко репортер аллелей, которые используются для метки клеточных популяций без экспериментальных манипуляций. Ключ для этих подходов является способность определять, с высоким пространственным разрешением, местах экспериментальных и этикетки ссылку. Эти подходы дали выдающийся прогресс в развитии предимплантационной и explant органогенеза исследований. ^{6 , 7 , 8 , 9}

Развития событий, которые лежат в основе сердца морфогенеза были все хорошо описана в последние годы. ¹⁰ одним из главных открытий в этой области исследований является описание ряда прародитель популяций, которые можно выделить выражением уникальных маркеров. ¹¹ эти группы населения включают первого и второго сердца поля (FHF и СВЧ), которые присутствуют в пределах сердца Полумесяца на передней стороне эмбриона на эмбриональных день (E) 8,25 мыши развития. ¹² этих групп населения часто рассматриваются через сочетание микроскопия поля, который обеспечивает тканевом уровне информацию и серийный секционирование с помощью иммунофлуоресцентного анализа, который предлагает высокое разрешение сотовой но только двумерные пространственной информации. ¹³ таким образом, хотя эти исследования значительно расширить наше понимание развития сердца, доступные методы имеют ограниченный в глубине количественный анализ морфогенеза в ходе этих этапов, создавая необходимость подходов для изучения Организация этих групп населения на уровне всего организма.

Последние достижения в области конфокальной микроскопии и анализа 3D изображений позволяют с высоким разрешением и высокой пропускной способности алгоритмической реконструкций клеток и структур на местах с относительной легкостью, проложив тем самым путь для детального изучения комплекса клеточных структур. ¹⁴ с увеличением вычислительной мощности и развития большой-управляющий алгоритмов, как необходимо обрабатывать экспоненциальное увеличение размера визуализации наборов данных, анализ может теперь быть полностью автоматизирован. ¹⁵ автоматизированный анализ визуализации наборов данных имеет преимущество быть беспристрастной, но это только так надежна, как качество входного набора данных; Это необходимо, то, что лучшие практики используются во время приобретения и предварительной обработки изображений для обеспечения высочайшего качества, объективный анализ. ¹⁶ протоколов может быть полностью автоматизирована и общие для воспроизводимости результатов, и алгоритмы, используемые проприетарное программное обеспечение, легко доступны через библиотеки для использования учеными, которые знакомы с современной собственности или открытым исходным кодом средства разработчика. ¹⁷

Следующий протокол объясняет необходимые шаги для выполнения такого анализа на одной четко определенной модели органогенез, формирование сердца Полумесяца во время разработки сердца. В частности, этот протокол описывает (1) урожай и вскрыть сердца Полумесяца стадии эмбриона, (2) выполняет всю гору иммунофлюоресценции для справки (Nkx2-5) и экспериментальных маркеры (Foxa2Cre:YFP^18,,¹⁹), (3) подготовить и изображения эмбрионов, с помощью конфокальной микроскопии и наконец (4) анализа и количественной оценки полученные изображения, используя передовые трехмерных подходов. В то время как сердечная Полумесяца используется в качестве примера здесь, с соответствующей модификации, этот протокол может использоваться для анализа нескольких линий в братскую на ранней стадии эмбрионов Сомит.

протокол

все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использования Комитетом на Icahn школе медицины на горе Синай.

1. сбора и обработки эмбрионов стадии сердечной Полумесяца

1. мат плодородные женского мышь с мужчиной плодородной стад.
Вилка
2. проверить на наличие вагинальный совокупления с помощью тупого зонд или щипцами. Полдень в день обнаружения вилка считается эмбриональных день (E) 0.5 (см. Рисунок 1A для полной шкалы).
   Примечание: Вилки должны проверяться в первой половине дня, как они потеряли в течение дня.
3. Утром 8-^й день (E8.25), в жертву беременных дам CO ₂ ингаляции, или согласно местным и институциональные положения.
   Примечание: Точные сроки могут быть штамм зависимых и должно определяться морфологии эпирически.
4. Спрей брюшко мыши с чистой области и свести к минимуму пролития на 70% спирте. Разоблачить внутренностей, выполняя разреза брюшной полости через кожу и тело стены.
5. Найдите матки и тщательно удалить весь рога матки от животных. Начало путем разрезания выше одного маточных труб, обрезки жира от матки во время разбирательства до конца шейки матки. Вырезать через шейку матки и продолжать в верхней части других маточных труб, резка выпустить всю матку.
6. Место матки в 10см блюдо с фосфатом буфер солевой раствор (PBS, рН 7,4) чтобы смыть излишки крови. Югу вскрыть матки путем разрезания mesometrium между каждой deciduum, который содержит эмбрионов. Трансфер эмбрионов в 6 см блюдо со свежими PBS.
7. Под микроскопом, рассечение, используйте тонкой щипцы (#5) для удаления матки ткани от децидуальной ткани.
8. С помощью щипцов, тщательно срез кончик эмбриональных половины deciduum раскрыть эмбриона. Щепотка deciduum вытолкнуть эмбриона и осторожно вытащите эмбриона.
9. Вскрыть прочь extraembryonic тканей насколько это возможно без повреждения морфология эмбриона ( рис. 1B).
10. Использовать пипетку передачи для эмбрионов в 1,5 мл тюбик с свежим PBS и место на льду. Повторите 1,7-1,9 для оставшихся эмбрионов перед продолжением.
11. Аспирата PBS и полоскания с PBS. Аспирационная PBS.
    Примечание: Попробуйте удалить столько PBS как можно без повреждения или сушки эмбрионов. Ручное удаление решений рекомендуется на все шаги во избежание потери эмбрионов.
Параформальдегида (PFA)
12. исправить эмбрионов с 4% в PBS для 1 h на RT.
    Примечание: Эмбрионов может быть исправлено на ночь (O/N) на 4 ° C.
13. Полоскать три раза с PBS. Держите эмбрионов при температуре 4 ° C до готовности приступить к иммунофлюоресценции.
    Примечание: Точка паузы. Эмбрионы могут безопасно храниться в PBS на 4 ° C в течение нескольких недель.

2. Иммунофлюоресценции окрашивания

Примечание: инкубационных условий ниже могут быть изменены для размещения различных графиков. Рекомендуется использовать мягкий сотрясение или качалка для всех шагов длительный инкубационный.

1. Удалить PBS и добавьте 1 mL блокировки буфера (сапонин 0,5%, 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS).
2. Инкубировать по крайней мере 4 h на RT. Это также может быть сделано O/N на 4 ° C.
3. Удалить блокирующий буфер и добавьте основное антитело смесь разбавляют в блокирующем буфере. Инкубировать O/N при 4 ° C.
   Примечание: Смотрите материалы секции для описания антител используемых и предложил разведениях. Антитело разведений должна определяться эмпирически. Использование Nkx2-5 как ссылка пятно для сердца Полумесяца рекомендуется и является ключом к течению изображение сегментации и анализа шаги.
4. Удаление первичного антитела путем аспирации.
5. Мыть 3 раза за 1 час с 0.1% Тритон в PBS.
6. Удалить мыть и добавить вторичные антитела смесь разбавляют в блокировки буфера. Инкубируйте 3 h на RT. Это также может быть сделано O/N на 4 ° C.
7. Мыть 3 раза за 1 час с 0.1% Тритон в PBS. Это также может быть сделано O/N на 4 ° C.
8. Изображение с 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) в PBS на 10 мин
   Примечание: Это изображение может выполняться одновременно с вторичное антитело.
9. Мытье 2 раза по 5 минут с 0.1% Тритон в PBS.
10. Медленно приостановить эмбрионов в средствах массовой информации против затухания монтажа (2% w/v н пропиловый галлат (НПГ), 90% глицерина, 1 x PBS; Смотрите раздел материалы для получения более подробной информации). Позволяет сбалансировать по крайней мере 1 час перед монтажом. Осторожно проведите трубки периодически, чтобы помочь эмбрионов падение в раствор анти затухания.
    Примечание: Точка паузы. Эмбрионы могут храниться в течение нескольких дней в растворе анти исчезать до готовности к горе и изображения.

3. Монтаж эмбрионов для микроскопии

1. подготовить Микроскоп слайды для монтажа с помощью двойной антипригарные ленты или силиконовые прокладки. При использовании двойной антипригарные ленты, сделайте две параллельные стеки 5-6 слоев около 15-20 мм друг от друга. Это будет оставить достаточно места, чтобы разместить эмбрионы и зафиксируйте coverslip ( рис. 1 c).
2. Место 15 мкл капля анти затухания на слайде, между двойной антипригарные ленты. Тщательно передачи одного эмбриона на слайд.
   Примечание: более одного эмбриона могут быть размещены на слайде. Однако, последующие ориентации шаги являются более сложными, с несколько эмбрионов, и долго изображений длительности может привести к фото отбеливания.
3. Под микроскопом рассечение, с помощью тонкой щипцы, положение эмбриона, таким образом, чтобы передняя сторона лица от слайда с оси тела в соответствии с длинной оси слайда. Смотрите Рисунок 1 c схема монтажа установки.
4. Тщательно место coverslip над образца, положив одну сторону на один стек двойной антипригарные ленты и аккуратно опустите coverslip до тех пор, пока его контакты другие ленты с помощью щипцов.
   Примечание: Шаги 3.3 и 3.4 имеют решающее значение для обеспечения правильной ориентации эмбриона для изображений. Снижая coverslip вдоль задней к передней направлении, эмбрион должен не ролл и сердечной Полумесяца региона будет оставаться ориентированной от слайд, который идеально подходит для изображений на инвертированным микроскопом.
5. Использовать пипетку для добавления дополнительных анти затухания между слайд и coverslip сохранить образец от вымирает во время хранения/обработки изображений.

4. Конфокальная томография

1. получить изображения с помощью высоких увеличение цель, которая позволяет для всей сердечной Полумесяца региона быть захвачен в одном поле зрения. Для определения x-y-z voxel размеры используется частота Найквиста. Большинство производителей Микроскоп будет иметь " оптимизировать " кнопку для обеспечения выборки Найквиста.
   Примечание: Пятнать для Nkx2-5 выгодно здесь, как он будет разграничить всего сердца Полумесяца региона. Меньшие размеры Z-шаг (передискретизацией) даст лучше трёхмерного моделирования результаты, но может привести к расширенной приобретение раз и/или отбеливания для некоторых образцов.
2. Настройка параметров с помощью стандартной практики наиболее тепловизионных изображений. А именно, используйте низкие возможности лазерной интенсивности для достижения хорошее соотношение сигнал шум для каждого Флюорофор и выбрать усиление и смещение уровни, которые дают широкий динамический диапазон без насыщения сигнал.
   Примечание: Согласовываться с визуализации параметров между образцами, которые будут сравниваться непосредственно. Это особенно важно для вниз по течению 3D анализа и количественной оценки.

5. Анализ и количественная 3D моделирования изображений

Примечание: Для этого протокола изображения были проанализированы с использованием программного пакета Imaris. Аналогичный анализ может быть возможным с помощью альтернативных пакетов. Ниже описание охватывает анализ трубопровод для опорного канала (т.е. Nkx2-5) и один экспериментальный канал (т.е. рекламы ЯФП). Дополнительные каналы могут быть проанализированы через повторение этих шагов. Пример набора данных была предоставлена, может использоваться для репликации приводимый ниже анализ.

1. Загрузить наборы данных raw изображений в Imaris Арена представление и открыть файл для желаемого эмбриона в режиме Surpass. Данные следует загрузить в 3D в MIP (Макс) режиме. Открыть окно настройки отображения и выбрать только канал ссылку.
2. Отрегулировать порог изображения, если это необходимо для лучшей визуализации. Для этого анализа, гаммы если отношение сигнал шум является слишком низким для сегментации.
   Примечание: Если выполнение гамма исправлений, которые являются нелинейные корректировки, скорректированного изображения не может использоваться для измерения интенсивности или сравнений. На этом этапе можно выполнить дальнейшие предварительной обработки изображений (т.е. освещение исправления, Гауссово размывание или других фильтрации), если ваше отношение сигнал шум не является удовлетворительным. Если вы решите сделать предварительную обработку, необходимо выполнить те же шаги предварительной обработки для всех изображений в вашем наборе.
3. Создать новую поверхность для опорного канала с помощью диалога поверхности алгоритм.
   1. Выберите " сегмент только региона интерес " флажок.
   2. Настроить область ограничивающего прямоугольника таким образом, чтобы он содержит области интереса (ROI, т.е. области сердца Полумесяца), как определенная ссылка пятно.
   3. Выберите канал ссылки в раскрывающемся меню Источник. Значение по умолчанию для сглаживания (равен размеру voxel z) обычно достаточно, но может потребовать эмпирического оптимизации. Для этого анализа, используйте сглаживания равен половине z voxel размера.
   4. Выполнять Бинаризация с абсолютной интенсивности. Чтобы убедиться, что поверхность не распространяется за пределы сигнала канала, отрегулируйте нижнего предела с использованием ползунков.
      Примечание: Для некоторых изображений, где клетки могут быть определены легко, можно включить " Сплит трогательно объектов " алгоритм, отделить сигнал от фона.
   5. Фильтр объектов voxel количество или объем и отклонить фон (мелкие или в районах за пределами области Nkx2-5) объектов, которые алгоритм может вызвали. Закончить алгоритм.
4. С помощью вновь созданного поверхности, создайте замаскированный канал для экспериментального канала.
   1. С поверхность выбран, выберите " маска Sel... ͟ " функции из окна редактирования.
   2. Выберите экспериментальный канал интереса (то есть рекламы ЯФП). Убедитесь, что " дублировать канал перед нанесением маски " флажок.
5. Окно, в настройку экрана выберите только масках канал. Создать новую поверхность, масках каналов, следуя шаги 5.3-5.3.5.
   Примечание: На данном этапе это может быть полезно для настройки внешнего вида каждого маски для облегчения визуализации 3D-модели: выберите каждой поверхности и выберите цвет закладку Настройка основного цвета и прозрачности при необходимости. Поверхности цвета слияние не когда перекрываются.
6. Для получения объемных данных, с каждой поверхностью выбранные выберите вкладку Статистика. В " подробный " югу вкладку, выберите " средние значения " из раскрывающегося меню. Общий объем поверхности можно найти в столбце сумма сгенерированной таблице.
   Примечание: Если сгенерированный поверхность содержит ошибочные фрагменты (то есть фрагменты, которые от фонового сигнала не исключаются при сегментации или районах разрывные от главной поверхности), это может быть необходимо рассчитать общий объем вручную, или фильтр поверхности объем или количество вокселей и убедитесь, что в расчет включаются только сигнал сегментов. Объем для каждой части поверхности можно найти, выбрав " все значения " из раскрывающегося меню. При выборе каждого значения будет сделать появится желтый, которая помогает в определении значения исключить соответствующий регион.

Результаты

Качество конечных данных и анализа сильно зависит от (1 целостность и морфология расчлененных эмбрионов, (2) использование высокой специфичности антител, и (3) о правильной настройке параметров визуализации. Поврежденные эмбрионов посрамить процесс генерации поверхно?...

Обсуждение

Протокол выше описывает стратегию для получения количественных данных изображения высокого качества вся гора иммунофлюоресценции мыши после имплантации эмбрионов. Когда выполняется правильно, 3D объемного данные, полученные через эти шаги можно использовать для сравнительного и меж...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt probe	Roboz	RS-9580
Forceps	Roboz	RS-8100
Fine forceps	Roboz	RS-5015
Dissection scissors	Roboz	RS-5912
Saponin	Sigma Aldrich	84510
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A8022
Triton	RPI	A4490
Goat anti-Nkx2-5	Santa Cruz Biotech	sc-8697	Used at 1:100-1:500
Chicken anti-GFP	abcam	ab13970	Used at 1:500
Rabbit anti-Islet1	abcam	ab109517	Used at 1:100
Rabbit anti-Hcn4	Millipore	AB5808	Used at 1:100
488 anti-chicken	Jackson Immunoresearch	703-546-155	Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
555 anti-goat	Thermo Fisher Scientific	A21432	Used at 1:500
647 anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	711-606-152	Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
n-Propyl gallate	Sigma Aldrich	2370	Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution.
Superfrost Plus microscopy slides	VWR Scientific	48311-703
22x22 mm coverslips	VWR Scientific	48366-227
Imaris 8.4.1	Bitplane