Análisis de la inmunofluorescencia de Whole-mount cuantitativa de las poblaciones progenitoras cardiacas en embriones de ratón

Resumen

Aquí, describimos un protocolo para montaje entero de la inmunofluorescencia y análisis volumétrico cuantitativo basado en imágenes de embriones de ratón de etapa temprana. Presentamos esta técnica como un potente enfoque cualitativa y cuantitativamente evaluar estructuras cardiacas durante el desarrollo, y proponer que sea ampliamente adaptable a otros sistemas del órgano.

Resumen

El uso de técnicas de imagen constante avance ha contribuido ampliamente a nuestra creciente comprensión del desarrollo embrionario. Organogénesis y desarrollo previo a la implantación son dos áreas de investigación que se han beneficiado enormemente de estos avances, debido a la alta calidad de los datos que pueden obtenerse directamente de la proyección de imagen antes de la implantación embriones o ex vivo de órganos. Mientras que antes de la implantación embriones han arrojado datos con muy alta resolución espacial, etapas posteriores han sido menos susceptibles de reconstrucción tridimensional. Obtención de datos 3D o volumétricos de alta calidad para estructuras embrionarias conocidas en combinación con la asignación de destino o localización del linaje genético permitirá un análisis más exhaustivo de los eventos morfogenéticos tienen lugar durante la embriogénesis.

Este protocolo describe un enfoque conjunto de montaje de la inmunofluorescencia que permite el etiquetado, la visualización y la cuantificación de poblaciones de células progenitoras en el desarrollo cardiaco la media luna roja, una estructura clave formada durante el desarrollo del corazón. El enfoque está diseñado de tal manera que se puede obtener tanto información a nivel de célula y tejido. Usando microscopia confocal y procesamiento de imágenes, este protocolo permite la reconstrucción espacial tridimensional de la media luna cardiaca, proporcionando así la capacidad de analizar la localización y organización de las poblaciones progenitoras específicas durante esta fase crítica del desarrollo del corazón. Lo importante es el uso de anticuerpos de referencia permite enmascarar sucesivo de la media luna cardiaca y posteriores mediciones cuantitativas de áreas dentro de la media luna. Este protocolo no sólo permitirá un examen detallado del desarrollo temprano de corazón, pero con adaptaciones debería ser aplicable a la mayoría los sistemas del órgano en la gástrula en embrión temprano de ratón de la etapa del somite.

Introducción

El estudio de la organogénesis ha dependido mucho de la observación de eventos morfogenéticos en el embrión en desarrollo. Estos estudios con frecuencia se basan en el uso de colorantes fluorescentes o linaje seguimiento reporteros en combinación con el etiquetado de las poblaciones de referencia definido. ¹ mediante la comparación de posiciones relativas de estas etiquetas, puede extraerse información sobre el origen, el movimiento o la última contribución de una población de interés. Trasplante y experimentos de mapeo del destino utilizan hitos morfológicos o inyección de colorantes en linajes no-motile para definir el punto de partida de las células de interés, que luego son examinadas por contribución al embrión desarrollado. ^{2 , 3 , 4 , 5} experimentos de rastreo de linaje genéticos utilizan el mismo concepto con alelos de reportero bien definidos que se utilizan para las poblaciones de la célula de la etiqueta sin manipulación experimental. Clave de estos enfoques es la capacidad para determinar, con alta resolución espacial, los lugares de la experimental y etiquetas de referencia. Estos enfoques han dado progreso sobresaliente en desarrollo antes de la implantación y explantación estudios de organogénesis. ^{6 , 7 , 8 , 9}

Los eventos del desarrollo que subyacen la morfogénesis del corazón han descrito cada vez más bien en los últimos años. ¹⁰ uno de los principales descubrimientos en este área de investigación es la descripción de un número de las poblaciones progenitoras que pueden distinguirse por la expresión de marcadores únicos. ¹¹ estas poblaciones incluyen el primer y segundo campos de corazón (FHF y SHF), que están presentes dentro de la media luna cardiaca en el lado anterior del embrión en el día embrionario (E) 8.25 del desarrollo del ratón. ¹² estas poblaciones son examinadas con frecuencia mediante una combinación de microscopía de amplio campo, que proporciona información a nivel de tejido y seccionamiento serial con ensayos de inmunofluorescencia, que ofrece alta resolución celular pero sólo información espacial bidimensional. ¹³ así, aunque estos estudios han avanzado enormemente nuestra comprensión del desarrollo del corazón, los métodos disponibles han limitado en profundidad cuantitativa de la morfogénesis durante estas etapas, creando la necesidad de enfoques examinar la Organización de estas poblaciones a nivel del organismo entero.

Los recientes avances en microscopia confocal y análisis de imágenes 3D permiten reconstrucciones algorítmicas alta resolución y alto rendimiento de las células y estructuras en situ con relativa facilidad, abriendo así el camino para estudios detallados del complejo estructuras celulares. ¹⁴ con el aumento del poder computacional y el desarrollo de algoritmos de manejo grandes datos, ambos necesarios para manejar el aumento exponencial del tamaño de conjuntos de datos, la proyección de imagen análisis pueden ahora ser completamente automatizados. ¹⁵ análisis automatizado de imágenes de conjuntos de datos tiene la ventaja de ser imparcial, pero sólo es tan confiable como la calidad del conjunto de datos de entrada; es imperativo, entonces, que las mejores prácticas se utilizan durante la adquisición y pre-procesamiento de imagen para asegurar la más alta calidad, el análisis imparcial. ¹⁶ protocolos pueden ser completamente automatizado y compartido para la reproducibilidad, y los algoritmos utilizados por software privativo son fácilmente disponibles a través de bibliotecas para ser utilizado por los científicos que tienen familiaridad con el propietario moderno o de código abierto herramientas para desarrolladores. ¹⁷

El protocolo siguiente explica los pasos necesarios para realizar dicho análisis en un modelo bien definido de la organogénesis, la formación de la media luna cardiaca durante el desarrollo del corazón. Específicamente, este protocolo describe cómo (1) cosechar y diseccionar embriones en fase de media luna cardiaca, (2) realizar inmunofluorescencia montar todo de referencia (Nkx2-5) y experimental (Foxa2Cre:YFP^18,19) marcadores (3) preparar y los embriones usando microscopia confocal, la imagen y finalmente (4) analizar y cuantificar las imágenes usando el enfoque tridimensional avanzada. Mientras que la media luna cardiaca se utiliza como un ejemplo aquí, con la modificación apropiada, este protocolo puede utilizarse para el análisis de múltiples linajes de gástrula a embriones en fase temprana somite.

Protocolo

todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de la escuela de medicina de Icahn en el Monte Sinaí.

1. cosecha y procesamiento cardiaca embriones en fase de media luna

1. Mate un ratón hembra fértil con un macho semental fértil.
Enchufe de
2. verificación de la presencia de una cópula vaginal usando una prueba contundente o fórceps. Mediodía en el día de detección de enchufe se considera embrionario día (E) 0,5 (ver figura 1A para la línea de tiempo completo).
   Nota: Tapones deberán ser revisados para por la mañana, ya que son perdidas durante todo el día.
3. En la mañana del ^{día 8 (E8.25)}, sacrificar la presa embarazada por inhalación de CO ₂, o según las regulaciones locales e institucionales.
   Nota: Tiempo exacto puede ser dependiente de la tensión y debe determinarse empíricamente por morfología.
4. Rociar el abdomen del ratón con etanol al 70% para limpiar la zona y minimizar el vertimiento. Exponer las vísceras mediante la realización de una incisión abdominal a través de la piel y la pared del cuerpo.
5. Localizar el útero y retire con cuidado el cuerno uterino completo del animal. Comience cortando por encima de un oviducto, recorte la grasa lejos del útero y proceder a la terminación cervical. Corte a través del cuello uterino y continuar al extremo superior del otro oviducto, corte para liberar el útero entero.
6. Lugar del útero en 10 cm plato con fosfato tampón salino (PBS, pH 7,4) lavar el exceso de sangre. Diseccionar el útero cortando el mesometrium entre cada deciduum, que contiene los embriones. Transfiera los embriones a un plato de 6 cm con PBS fresco.
7. Bajo un microscopio de disección, usar pinzas finas (#5) para eliminar el tejido del útero de tejido decidual.
8. Con pinzas, con cuidado corte la punta de la mitad embrionaria del deciduum para revelar el embrión. Pellizcar el deciduum para expulsar el embrión y saque con cuidado el embrión.
9. Disecar tejidos extraembrionarias lejos tanto como sea posibles sin dañar la morfología del embrión ( figura 1B).
10. Utilizar una pipeta para colocar los embriones en un tubo de 1,5 mL con PBS fresco y coloque en hielo. Repita 1.7-1.9 para los embriones restantes antes de continuar.
PBS
11. aspirado y enjuague una vez con PBS. Aspirar PBS.
    Nota: Intentar eliminar tanto PBS como sea posible sin dañar o secar los embriones. Extracción manual de las soluciones se recomienda en todas las medidas para evitar la pérdida de embriones.
12. Embriones de solución con el 4% paraformaldehido (PFA) en PBS durante 1 h a RT.
    Nota: Los embriones pueden ser fijo durante la noche (O/N) a 4 ° C.
13. Enjuague tres veces con PBS. Mantener los embriones a 4 ° C hasta que esté listo para proceder con inmunofluorescencia.
    Nota: Hacer una pausa en punto. Los embriones pueden ser guardados en PBS a 4 ° C durante varias semanas.

2. Tinción de inmunofluorescencia

Nota: las condiciones de incubación más abajo se pueden ajustar para adaptarse a diferentes horarios. Se recomienda el uso de agitación suave o mecedora para todos los pasos de incubación largo.

1. PBS de quitar y añadir 1 mL de solución amortiguadora de bloqueo (saponina del 0.5%, 1% albúmina sérica bovina (BSA) en PBS).
2. Incubar al menos 4 h a TA. Esto se puede también hacer O/N a 4 ° C.
3. Quitar el amortiguador de bloqueo y agregue la mezcla de anticuerpo primario diluido en solución amortiguadora de bloqueo. Incubar O/N a 4 ° C.
   Nota: Ver materiales de sección para la descripción de los anticuerpos utilizados y sugirió diluciones. Las diluciones del anticuerpo deben determinarse empíricamente. El uso de Nkx2-5 como una referencia para la media luna cardiaca se recomienda y es imagen clave para posteriores pasos de análisis y segmentación de.
4. Eliminar anticuerpos primarios por la aspiración de.
5. Lavado 3 veces durante 1 hora cada uno con 0,1% Triton en PBS.
6. Retirar lavado y añadir mezcla de anticuerpo secundario diluido en buffer de bloqueo. Incubar durante 3 h a TA. Esto se puede también hacer O/N a 4 ° C.
7. Lavado 3 veces durante 1 hora cada uno con 0,1% Triton en PBS. Esto se puede también hacer O/N a 4 ° C.
8. Contratinción con 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en PBS durante 10 minutos
   Nota: Este contraste puede realizarse simultáneamente con el anticuerpo secundario.
9. Lavado 2 veces durante 5 minutos cada uno con 0,1% Triton en PBS.
10. Suspender lentamente embriones en medios de montaje anti-fade (2% w/v n-propil galato (nPG), 90% glicerol, 1 x PBS; Consulte la sección materiales para más detalles). Permita que se alcancen por lo menos 1 h antes del montaje. Suavemente mueva el tubo periódicamente para ayudar a los embriones a la gota en la solución de tratamiento anti.
    Nota: Hacer una pausa en punto. Los embriones pueden almacenarse durante varios días en la solución de anti-fade hasta que esté listo de montar y de imagen.

3. Embriones de montaje para microscopia

microscopio

1. preparar diapositivas para montaje con cinta de pegar o separadores de silicona. Si usa cinta de pegar, hacer dos pilas paralelas de 5-6 capas unos 15-20 mm aparte. Esto dejará suficiente espacio para colocar los embriones y asegurar el cubreobjetos ( figura 1).
2. Coloque una gota de 15 μl de anti-fade en la diapositiva, entre la cinta de pegar. Cuidadosamente transferir un embrión a la diapositiva.
   Nota: más de un embrión se puede colocar sobre un portaobjetos. Sin embargo, los pasos subsecuentes de la orientación son más difíciles con múltiples embriones, e imagen larga duración puede conducir a blanquear foto.
3. Bajo un microscopio de disección con unas pinzas finas, coloque el embrión, que se enfrenta a la parte anterior de la corredera con el eje del cuerpo en línea con el eje largo de la diapositiva. Ver figura 1 para un diagrama esquemático de la configuración del montaje.
4. Coloque cuidadosamente un cubreobjetos sobre la muestra descansando a un lado en una pila de la cinta de pegar y usar pinzas para bajar suavemente el cubreobjetos hasta que toque la cinta otros.
   Nota: Los pasos 3.3 y 3.4 son críticos para asegurar la orientación correcta del embrión para la proyección de imagen. Bajando el cubreobjetos a lo largo de la parte posterior hacia anterior, no debe funcionar el embrión y la región cardiaca media luna quedará orientada de la diapositiva, que es ideal para la proyección de imagen en un microscopio invertido.
5. Utilice una pipeta para añadir más anti-fade entre portaobjetos y cubreobjetos para evitar que la muestra muriendo durante el almacenamiento de información e imágenes.

4. Proyección de imagen confocal

1. adquirir imágenes con el más alto objetivo de ampliación que permite la región media luna todo cardiaca ser capturado en un campo de visión. Utilice velocidades de muestreo de Nyquist para determinar dimensiones de x-y-z voxel. Mayoría de fabricantes de microscopio tendrá un " optimizar " botón para muestreo de Nyquist.
   Nota: Tinción de Nkx2-5 es beneficioso, como lo será delinear toda la región cardiaca de media luna. Paso Z más pequeñas (sobremuestreo) producirá resultados de modelado en 3D mejor pero puede conducir a tiempos de adquisición prolongado de blanqueo para algunas muestras.
2. Establecer parámetros mediante las prácticas estándar de la mejor imagenológicos de la proyección de imagen. Es decir, utilizar la menor intensidad posible láser para lograr buena relación señal a ruido para cada fluoróforo y elegir la ganancia y offset niveles que producen un amplio rango dinámico sin saturar la señal de.
   Nota: Ser coherente con los parámetros entre las muestras que se comparará directamente la proyección de imagen. Esto es especialmente importante para posteriores análisis 3D y cuantificación.

5. Análisis y modelación 3D cuantitativa de la imagen

Nota: De este protocolo, imágenes se analizaron con el paquete de software Imaris. Análisis similar posible utilizando paquetes alternativos. La descripción siguiente cubre la tubería de análisis para un canal de referencia (es decir, Nkx2-5) y un canal experimental (es decir, YFP). Canales adicionales pueden ser analizados a través de la repetición de estos pasos. Un conjunto de datos de ejemplo ha sido siempre que puede utilizarse para replicar el análisis abajo.

1. Cargar conjuntos de datos de imagen raw en vista Imaris Arena y abrir archivo para embrión deseado en la vista Surpass. Deben cargar datos en la vista 3D en modo (máximo) de MIP. Abra la ventana de ajuste de la pantalla y seleccionar sólo el canal de referencia.
2. Ajustar el umbral de la imagen si es necesario para la mejor visualización. Para este análisis, ajustar la gamma si la relación señal a ruido es demasiado baja para segmentación.
   Nota: En caso de correcciones de gamma, que son ajustes no lineales, las imágenes ajustadas no pueden utilizarse para mediciones de intensidad o comparaciones. En esta etapa se puede realizar más tratamiento previo de la imagen (es decir, correcciones de iluminación, Desenfoque gaussiano u otro filtrado), si su cociente signal-to-noise no es satisfactorio. Si usted decide hacer un tratamiento previo, debe realizar los mismos pasos de preprocesamiento para todas las imágenes en el conjunto de datos.
3. Crear una nueva superficie para el canal de referencia usando el diálogo algoritmo superficie.
   1. Seleccione el " sólo una región de interés del segmento " checkbox.
   2. Ajustar la región de cuadro delimitador que contiene la región de interés (ROI, es decir, el área media luna cardiaco) según lo delineado por la mancha de la referencia.
   3. Seleccione el canal de referencia en el menú desplegable de canales de origen. La configuración predeterminada para alisar (igual al tamaño de voxel de z) es normalmente suficiente, pero puede requerir optimización empírica. Para este análisis, utilice suavizado igual a la mitad el z voxel tamaño.
   4. Realizar umbral de intensidad absoluta. Para asegurar que la superficie no se extiende más allá de la señal del canal, ajustar el límite inferior usando los cursores.
      Nota: Para determinadas imágenes donde las células se pueden delinear fácilmente, puede incluir la " split tocar objetos " algoritmo, para separar aún más la señal de fondo.
   5. Filtro de objetos por volumen o número de voxel y rechazar objetos de fondo (pequeñas o en zonas fuera del área de Nkx2-5) que el algoritmo podría haber generado. Terminar el algoritmo de.
4. Con la superficie recién creada, crear un canal encubierto para el canal experimental.
   1. Con la superficie seleccionada, elija la " máscara Sel... ͟ " función de la ventana de edición.
   2. Seleccionar el canal experimental de interés (es decir, YFP). Asegúrese de que el " duplicar canal antes de aplicar mascarilla " casilla de verificación está seleccionada.
5. Ventana en el ajuste de la pantalla seleccionar sólo el canal enmascarado. Crear una nueva superficie para el canal enmascarado siguiendo pasos 5.3-5.3.5.
   Nota: En este punto puede ser útil ajustar el aspecto de cada máscara para facilitar la visualización del modelo 3D: seleccionar cada superficie y seleccione la ficha color ajustar el color de Base y la transparencia según sea necesario. Colores superficiales se combinan cuando comprometidos.
6. Para obtener los datos volumétricos, con cada superficie seleccionada seleccione la ficha de estadísticas. En la " detalle " sub pestaña, elige " valores medios " en el menú desplegable. El volumen total de la superficie se puede encontrar en la columna de suma de la tabla generada.
   Nota: Si la superficie generada contiene fragmentos erróneos (es decir, los fragmentos que de señal de fondo no se excluyen durante la segmentación o áreas discontinuas de la superficie principal), puede ser necesario calcular el volumen total manualmente, o las superficies por volumen o número de voxels del filtro y asegurar que sólo los segmentos de señal están incluidos en el cálculo. El volumen de cada porción de la superficie se puede encontrar seleccionando " todos los valores " en el menú desplegable. Seleccionar cada valor hará que la región correspondiente aparecen amarillo, que ayuda en la determinación de los valores a excluir.

Resultados

La calidad de los datos y análisis depende en gran medida en (1) la integridad y la morfología de los embriones disecados, (2) el uso de anticuerpos de alta especificidad y (3) la configuración adecuada de los parámetros de la proyección de imagen. Embriones dañados a confundir el proceso de generación de superficie y dificultan el análisis cuantitativo. Ejemplos de embriones bien disecados y etapas se muestran en la figura 2B. Los embriones pueden se...

Discusión

El protocolo de arriba describe una estrategia para la obtención de datos cuantitativos de las imágenes de inmunofluorescencia de todo Monte alta calidad de embriones de ratón tras el implante. Cuando se realiza correctamente, los datos volumétricos 3D generados a través de estos pasos pueden utilizarse para el análisis comparativo y de concurrencia de varios dominios en el embrión. La señal superficial enmascara el procedimiento descrito es de uso particular al investigar poblaciones de celulares nuevos en compa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt probe	Roboz	RS-9580
Forceps	Roboz	RS-8100
Fine forceps	Roboz	RS-5015
Dissection scissors	Roboz	RS-5912
Saponin	Sigma Aldrich	84510
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A8022
Triton	RPI	A4490
Goat anti-Nkx2-5	Santa Cruz Biotech	sc-8697	Used at 1:100-1:500
Chicken anti-GFP	abcam	ab13970	Used at 1:500
Rabbit anti-Islet1	abcam	ab109517	Used at 1:100
Rabbit anti-Hcn4	Millipore	AB5808	Used at 1:100
488 anti-chicken	Jackson Immunoresearch	703-546-155	Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
555 anti-goat	Thermo Fisher Scientific	A21432	Used at 1:500
647 anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	711-606-152	Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
n-Propyl gallate	Sigma Aldrich	2370	Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution.
Superfrost Plus microscopy slides	VWR Scientific	48311-703
22x22 mm coverslips	VWR Scientific	48366-227
Imaris 8.4.1	Bitplane