Analyse quantitative Immunofluorescence entier-montent des Populations de progéniteurs cardiaques chez des embryons de souris

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour toute monture immunofluorescence et imageur l’analyse quantitative volumétrique des embryons de souris stade précoce. Nous présentons cette technique comme une approche puissante pour qualitativement et quantitativement évaluer les structures cardiaques au cours du développement et proposer qu’il peut être largement adaptable à d’autres systèmes d’organe.

Résumé

L’utilisation de techniques d’imagerie jamais progresser a contribué largement à notre meilleure compréhension du développement embryonnaire. Organogenèse et développement pré-implantatoire sont deux domaines de recherche qui ont grandement bénéficié de ces avancées, en raison de la qualité des données qui peuvent être obtenues directement à partir d’imagerie pré-implantatoire des embryons ou ex vivo organes. Bien que pré-implantatoire des embryons ont fourni des données avec une résolution spatiale élevée surtout, stades ont été moins sensible à la reconstruction en trois dimensions. Obtention de données 3D ou volumétriques de haute qualité pour les structures embryonnaires connues en combinaison avec la cartographie sort ou traçage de la lignée génétique permettra une analyse plus détaillée des événements morphogénétiques qui se déroulent durant l’embryogenèse.

Ce protocole décrit une approche entier-Montez immunofluorescence permettant pour l’étiquetage, la visualisation et la quantification des populations de cellules progénitrices dans le cardiaque en développement croissant, une structure clé formée pendant le développement du cœur. L’approche est conçue de telle manière que les deux niveaux cellulaire et tissulaire peut se renseigner. À l’aide de la microscopie confocale et traitement d’images, ce protocole permet de reconstruction spatiale tridimensionnelle du croissant cardiaque, offrant ainsi la capacité d’analyser la localisation et l’Organisation des populations de souches spécifiques pendant cette phase critique du développement du cœur. Ce qui est important, l’utilisation d’anticorps de référence permet de masquage successive du croissant cardiaque et mesures quantitatives ultérieures des zones dans le croissant. Ce protocole permettra non seulement un examen détaillé du développement précoce de coeur, mais avec des adaptations devrait s’appliquer à la plupart systèmes organiques dans la gastrula d’embryon précoce de la souris du stade somite.

Introduction

L’étude de l’organogenèse a longtemps compté sur l’observation des événements morphogénétiques dans l’embryon en développement. Ces études s’appuient souvent sur l’utilisation des colorants fluorescents ou reporters de traçage de lignée en combinaison avec l’étiquetage des populations de référence défini. ¹ en comparant les positions relatives de ces étiquettes, informations peuvent être tirées sur l’origine, mouvement ou ultime contribution d’une population d’intérêt. Transplantation et expériences de cartographie sort utilisent des repères morphologiques ou injection de colorants en lignées non motiles pour définir le point de départ des cellules d’intérêt, qui sont ensuite examinés pour contribution à l’embryon développé. ^{2 , 3 , 4 , 5} expériences génétiques de lignée-traçage utilisent le même concept avec des allèles de journaliste bien définies qui sont utilisées pour les populations de cellules étiquette sans manipulation expérimentale. Clé de ces approches est la capacité de déterminer, avec une haute résolution spatiale, les lieux de l’expérimental et les étiquettes de référence. Ces démarches ont abouti à des progrès remarquables en développement pré-implantatoire et explant des études de l’organogenèse. ^{6 , 7 , 8 , 9}

Les événements développementaux qui sous-tendent la morphogenèse de coeur ont été mieux en mieux décrites dans ces dernières années. ¹⁰ , une des grandes découvertes dans ce domaine de recherche est la description d’un certain nombre de populations de souches qui se distingue par l’expression de marqueurs uniques. ¹¹ ces populations comprennent le premier et le deuxième champs de coeur (FHF et SHF), qui sont présents dans le croissant cardiaque à la face antérieure de l’embryon à jour embryonnaire (E) 8.25 du développement chez la souris. ¹² ces populations sont souvent examinées par une combinaison de la microscopie à champ large, qui fournit des informations au niveau du tissu et série de sectionnement avec tests d’immunofluorescence, qui offre une haute résolution cellulaire mais seulement informations spatiales bidimensionnelles. ¹³ ainsi, alors que ces études ont grandement contribué à améliorer notre compréhension du développement du cœur, les méthodes disponibles ont limité en profondeur l’analyse quantitative de la morphogenèse durant ces étapes, créant la nécessité d’approches afin d’examiner la Organisation de ces populations sur le plan d’ensemble-organisme.

Les récentes avancées en microscopie confocale et analyse d’images 3D permettent à haute résolution et haut débit reconstructions algorithmique des cellules et des structures le in situ avec une relative facilité, ouvrant ainsi la voie pour des études détaillées du complexe structures cellulaires. ¹⁴ avec l’augmentation de puissance de calcul et l’élaboration d’algorithmes de gestionnaires données volumineuses, nécessaires pour gérer l’augmentation exponentielle de la taille des ensembles de données, l’imagerie analyses peuvent maintenant être entièrement automatisées. ¹⁵ l’analyse automatisée des ensembles de données d’imagerie a l’avantage d’être impartial, mais il n’est plus aussi fiable que la qualité de l’ensemble de données d’entrée ; Ensuite, il est impératif que les meilleures pratiques sont utilisés pendant l’acquisition et de traitement préalable de l’image afin d’assurer la meilleure qualité, l’analyse impartiale. ¹⁶ protocoles peuvent être complètement automatisées et partagé pour la reproductibilité et les algorithmes utilisés par les logiciels propriétaires sont facilement disponibles dans les bibliothèques pour être utilisé par les scientifiques qui ont connaissance exclusive moderne ou open-source outils de développement. ¹⁷

Le protocole suivant explique les étapes nécessaires pour effectuer une telle analyse sur un modèle bien défini de l’organogenèse, la formation du croissant cardiaque au cours du développement du cœur. Plus précisément, ce protocole décrit comment (1) récolte et disséquer des embryons au stade de crescent cardiaque, (2) effectuer le support entier immunofluorescence pour référence (Nkx2-5) et expérimentales des marqueurs (Foxa2Cre:YFP^18,,¹⁹), (3) préparer et les embryons à l’aide de la microscopie confocale, l’image et enfin (4) analyser et quantifier les images obtenues en utilisant des approches avancées en trois dimensions. Tandis que le croissant cardiaque est utilisé comme un exemple ici, avec des modifications appropriées, ce protocole peut être utilisé pour l’analyse de nombreuses lignées en gastrula d’embryons au stade précoce somite.

Protocole

toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité de l’urbanisme à l’école de médecine de l’Icahn au Mont Sinaï et d’institutionnels animalier.

1. collecte et traitement cardiaque Crescent embryons au stade

1. Mate une souris femelle fertile avec un mâle fertile stud.
2. Vérification de la présence d’une copulation vaginale prise à l’aide d’une sonde émoussé ou une pince. Midi le jour de la détection de bouchon est considéré comme embryonnaire jour (E) 0,5 (voir Figure 1 a pour une chronologie complète).
   NOTE : Fiches doivent être vérifiées pour le matin, car elles sont perdues tout au long de la journée.
3. Dans la matinée du 8 ^ème jour (E8.25), sacrifier le barrage enceinte par inhalation de CO ₂, ou selon les règlements locaux et institutionnels.
   Remarque : Le moment Exact peut être dépendante de la souche et devraient être déterminée empiriquement par la morphologie.
4. Spray l’abdomen de la souris avec l’éthanol à 70 % à nettoyer la zone et de réduire l’excrétion. Exposer les viscères en effectuant une incision abdominale à travers la peau et la paroi du corps.
5. Localiser l’utérus et retirer délicatement la corne utérine entier de l’animal. Commencer par couper au-dessus un oviducte, faucheuse graisse loin de l’utérus tout en instance à la fin du col utérin. Couper à travers le col de l’utérus et de continuer à l’extrémité supérieure de l’autre oviducte, couper pour libérer tout l’utérus.
6. Place l’utérus dans un 10 cm plat avec phosphate tampon salin (PBS, pH 7,4) pour laver le sang excédentaire. Les disséquer l’utérus en coupant le mesometrium entre chaque deciduum, qui contient les embryons. Transférer les embryons dans un plat de 6 cm avec du PBS frais.
7. Sous un microscope à dissection, utiliser pince fine (#5) pour enlever le tissu utérin loin le tissu déciduale.
8. Using forceps, découper soigneusement la pointe de la moitié embryonnaire de la deciduum de révéler l’embryon. Pincer le deciduum pour expulser l’embryon et tirez soigneusement l’embryon.
9. Disséquer les tissus extra-embryonnaires loin autant que possibles sans endommager la morphologie de l’embryon ( Figure 1 b).
10. Utiliser une pipette de transfert pour placer les embryons dans un tube de 1,5 mL avec du PBS frais et placez sur la glace. Répétez de 1,7 à 1,9 pour les embryons restants avant de poursuivre.
11. Aspiration PBS et rincez une fois avec du PBS. Aspirer les PBS.
    NOTE : Essayez de supprimer autant de PBS que possible sans endommager ni les embryons de séchage. Suppression manuelle des solutions est recommandée à toutes les étapes pour éviter la perte des embryons.
12. Fix embryons avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS pendant 1 h à température ambiante.
    Remarque : Les embryons peuvent être fixées pendant la nuit (O/N) à 4 ° C.
13. Rincer trois fois avec du PBS. Conserver les embryons à 4 ° C jusqu’au moment de procéder à l’immunofluorescence.
    Remarque : Une Pause point. Embryons peuvent être en toute sécurité stockées dans du PBS à 4 ° C pendant plusieurs semaines.

2. Immunofluorescence souillant

Remarque : les conditions d’incubation ci-dessous peuvent être ajustées pour tenir compte des horaires différents. Est recommandé d’utiliser douce agitation ou à bascule pour toutes les étapes d’incubation longue.

1. PBS de supprimer et ajouter 1 mL de tampon de blocage (saponine de 0,5 %, 1 % sérum d’albumine bovine (BSA) dans du PBS).
2. Incuber pendant au moins 4 heures à température ambiante. Cela peut aussi être fait O/N à 4 ° C.
3. Retirer un tampon bloquant et ajouter le mélange de l’anticorps primaire dilué dans un tampon bloquant. Incuber les O/N à 4 ° C.
   Remarque : Voir documentation section pour la description des anticorps utilisés et dilutions suggérées. Les dilutions anticorps doivent être déterminées empiriquement. L’utilisation de Nkx2-5 comme une tache de référence pour le croissant cardiaque est recommandée et est une image clée à l’aval de segmentation et analyse des étapes.
4. Enlever les anticorps primaires par aspiration.
5. Lavage 3 fois pendant 1 h pour chaque 0,1 % Triton dans du PBS.
6. Lavage de supprimer et ajouter le mélange d’anticorps secondaire dilué dans un tampon de blocage. Incuber pendant 3 h à température ambiante. Cela peut aussi être fait O/N à 4 ° C.
7. Lavage 3 fois pendant 1 h pour chaque 0,1 % Triton dans du PBS. Cela peut aussi être fait O/N à 4 ° C.
8. Contre-colorant avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans du PBS pendant 10 min.
   Remarque : Cette contre-colorant peut être effectuée simultanément avec l’anticorps secondaire.
9. Lavage 2 fois de 5 min chacun, avec 0,1 % Triton dans du PBS.
10. Suspendre lentement des embryons dans les milieux de montage anti-fade (2 % w/v n-Propyl gallate (nPG), 90 % de glycérol, 1 x PBS ; Voir la section matériaux pour plus de détails). Laisser se pour équilibrer au moins 1 h avant le montage. Effleurez doucement tube périodiquement pour aider les embryons à tomber dans la solution anti-fondue.
    Remarque : Une Pause point. Embryons peuvent être conservés pendant plusieurs jours dans une solution anti-fondue jusqu'a son montage et image.

3. Montage des embryons pour la microscopie

1. Prepare microscope slides pour montage à l’aide de ruban adhésif double-bâton ou entretoises de silicone. Si à l’aide de ruban adhésif double-bâton, faire deux piles parallèles de 5-6 couches environ 15-20 mm apart. Cela laisse suffisamment d’espace pour placer les embryons et fixer la lamelle couvre-objet ( Figure 1).
2. Déposer une goutte de 15 µL d’anti-fade sur la diapositive, entre la bande de double-clé. Transvaser avec soin un embryon à la diapositive.
   Remarque : plus d’un embryon peut être placé sur une lame. Cependant, les étapes subséquentes de l’orientation sont plus difficiles avec plusieurs embryons et imagerie longues durées peut conduire au photo-blanchiment.
3. Sous un microscope à dissection à l’aide de pinces fines, placez l’embryon de telle sorte que le côté antérieur soit éloignée de la diapositive avec l’axe du corps conforme à l’axe longitudinal de la diapositive. Voir Figure 1 pour une représentation schématique de la configuration de montage.
4. Délicatement poser un lamelle couvre-objet sur l’échantillon par un côté de repos sur une pile de ruban adhésif double-manche et avec une pincette pour abaisser doucement la lamelle jusqu'à ce qu’il entre en contact avec les autres bandes.
   Remarque : Les étapes 3.3 et 3.4 sont essentiels pour s’assurer de la bonne orientation de l’embryon pour l’imagerie. En abaissant la lamelle le long de la partie postérieure à direction antérieure, l’embryon ne devrait pas rouler et de la région cardiaque croissant restera orientée loin de la diapositive, qui est idéale pour l’imagerie sur un microscope inversé.
5. Utiliser une pipette pour ajouter supplémentaire anti-fondu entre la lame et lamelle pour garder l’échantillon de disparaître au cours du stockage/imagerie.

4. Imagerie confocale

1. d’acquérir des images en utilisant le plus grand objectif de grossissement qui permet pour la région du croissant ensemble cardiaque à être capturé dans un champ de vision. Fréquences d’échantillonnage de Nyquist permet de déterminer les dimensions de x-y-z voxel. La plupart des fabricants de microscopes aura un " optimiser " bouton pour s’assurer que l’échantillonnage Nyquist.
   NOTE : La coloration pour Nkx2-5 est bénéfique ici, car il délimitera l’ensemble de la région du Croissant-Rouge cardiaque. Des tailles plus petites de Z-étape (oversampling) donnera des résultats de modélisation de 3D mieux mais peut conduire à la fois étendue d’acquisition et/ou de blanchiment pour certains échantillons.
2. Configurer les paramètres à l’aide de pratiques mieux d’imagerie standards d’imagerie. À savoir, utiliser la plus faible intensité laser possible d’atteindre bon rapport signal-bruit pour chaque fluorophore et de choisir le gain et de décalage de niveaux qui donnent une large plage dynamique sans saturer le signal.
   NOTE : Être conforme à l’imagerie des paramètres entre les échantillons qui seront directement comparés. Ceci est particulièrement important pour l’analyse 3D en aval et de la quantification.

5. Analyse et modélisation 3D Quantitative d’images

Remarque : Pour ce protocole, les images ont été analysés en utilisant le progiciel Imaris. Une analyse similaire peut être possible à l’aide de paquets. La description ci-dessous couvre le pipeline d’analyse pour un canal de référence (c'est-à-dire Nkx2-5) et un canal expérimental (c.-à-d. YFP). Des canaux supplémentaires peuvent être analysés par la répétition de ces étapes. Un exemple dataset a été fournie qui peut être utilisé pour répliquer l’analyse qui suit.

1. Charger des ensembles de données d’image raw dans vue Imaris Arena et ouvrez le fichier pour embryon désiré selon Surpass. Données doivent charger dans une vue 3D en mode (max) de MIP. Ouvrez la fenêtre de réglage de l’affichage et sélectionner uniquement le canal de référence.
2. Régler le seuil de l’image si nécessaire pour une meilleure visualisation. Pour cette analyse, ajustez le gamma si le rapport signal-bruit est trop faible pour la segmentation.
   Remarque : Si vous effectuez des corrections gamma, qui sont des ajustements non linéaire, les images rajustés ne peuvent servir pour les mesures d’intensité ou de comparaison. À ce stade, vous pouvez effectuer plus image pré-processing (correction de l’éclairage, flou gaussien ou autre filtrage), si votre ratio signal-bruit n’est pas satisfaisante. Si vous choisissez d’effectuer un traitement préalable, vous devez effectuer les mêmes étapes de prétraitement pour toutes les images de votre dataset.
3. Créer une surface pour la chaîne de référence en utilisant le dialogue Surface algorithme.
   1. Sélectionnez le " seulement une région d’intérêt du Segment " checkbox.
   2. Régler la région de boîte englobante afin qu’il contienne la région d’intérêt (ROI, c'est-à-dire la zone cardiaque crescent) telle que définie par la tache référence.
   3. Sélectionner le canal de référence dans le menu déroulant Source canal. Le paramètre par défaut pour le lissage (égale à la taille du voxel z) est généralement suffisant mais peut nécessiter optimisation empirique. Pour cette analyse, utilisent le lissage égal à la moitié la voxel-taille z.
   4. Perform seuillage par intensité absolue. Pour vous assurer que la surface ne dépasse pas le signal de canal, régler la position inférieure avec les curseurs.
      Remarque : Pour certaines images où les cellules peuvent être délimités facilement, vous pouvez inclure le " split toucher des objets " algorithme, plus séparer le signal de votre arrière-plan.
   5. Filtrer les objets par voxel nombre ou le volume et de rejeter les objets de l’arrière-plan (petites ou l'on trouve à l’extérieur de la zone Nkx2-5) que l’algorithme peut avoir généré. Terminer l’algorithme.
4. à l’aide de la surface nouvellement créée, de créer un canal masqué pour le canal expérimental.
   1. Avec les surfaces sélectionnées, choisissez le " Sel masque... ͟ " fonction de la fenêtre d’édition.
   2. Sélectionner le canal expérimental d’intérêt (c.-à-d. YFP). S’assurer que le " double canal avant d’appliquer le masque " est cochée.
5. Fenêtre dans le réglage de l’affichage, sélectionnez uniquement le canal masqué. Créer une nouvelle surface pour le canal masqué en suivant les étapes 5.3-5.3.5.
   Remarque : À ce stade, il peut être utile d’ajuster l’apparence de chaque masque pour faciliter la visualisation du modèle 3D : sélectionnez chaque surface, puis sélectionnez l’onglet ajuster la couleur de Base de la couleur et la transparence au besoin. Couleurs de surface impossible de fusionner lorsque se chevauchaient.
6. Pour obtenir les données volumétriques, avec chaque surface sélectionnée, sélectionnez l’onglet statistiques. Dans la " détaillée " l’onglet, choisissez " valeurs moyennes " dans le menu déroulant. Le volume total de la surface se trouvent dans la colonne de la somme de la table générée.
   Remarque : Si la surface générée contient des fragments erronées (c'est-à-dire des fragments qui sont de signal de fond pas exclus pendant la segmentation ou zones discontinues de la surface principale), il peut être nécessaire de calculer le volume total manuellement, ou filtrer les surfaces par volume ou nombre de voxels et veiller à ce que seuls les segments de signal sont inclus dans le calcul. On trouvera le volume pour chaque partie de la surface en sélectionnant " toutes les valeurs " dans le menu déroulant. Si vous sélectionnez chaque valeur fera la région correspondante à apparaître jaune, qui aide à déterminer les valeurs à exclure.

Résultats

La qualité des données finales et d’analyse dépend grandement de (1) l’intégrité et la morphologie des embryons disséqués, (2) l’utilisation des anticorps de haute spécificité et (3) la configuration correcte des paramètres d’imagerie. Embryons endommagés seront confondre le processus de génération de surface et analyse quantitative des nuisances. Exemples d’embryons correctement découpées et mis en scène sont présentés dans la Figure 2 b

Discussion

Le protocole ci-dessus décrit une stratégie pour obtenir des données quantitatives des images de haute qualité de support entier immunofluorescence des embryons de souris après l’implantation. Lorsque exécutée correctement, les données volumétriques 3D générées par le biais de ces étapes peuvent servir d’analyse comparative et intersectionnelle de plusieurs domaines au sein de l’embryon. La surface signal masquant l’approche décrite est particulièrement utile dans les enquêtes sur les populations ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt probe	Roboz	RS-9580
Forceps	Roboz	RS-8100
Fine forceps	Roboz	RS-5015
Dissection scissors	Roboz	RS-5912
Saponin	Sigma Aldrich	84510
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A8022
Triton	RPI	A4490
Goat anti-Nkx2-5	Santa Cruz Biotech	sc-8697	Used at 1:100-1:500
Chicken anti-GFP	abcam	ab13970	Used at 1:500
Rabbit anti-Islet1	abcam	ab109517	Used at 1:100
Rabbit anti-Hcn4	Millipore	AB5808	Used at 1:100
488 anti-chicken	Jackson Immunoresearch	703-546-155	Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
555 anti-goat	Thermo Fisher Scientific	A21432	Used at 1:500
647 anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	711-606-152	Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
n-Propyl gallate	Sigma Aldrich	2370	Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution.
Superfrost Plus microscopy slides	VWR Scientific	48311-703
22x22 mm coverslips	VWR Scientific	48366-227
Imaris 8.4.1	Bitplane