发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

该协议描述了如何刺激细胞线粒体衍生肽, 并评估信号级联和定位的磷蛋白。

摘要

线粒体衍生肽 (mdp) 是一种新的肽类, 是由小开放阅读框架编码的其他已知基因的线粒体基因组。mdp 具有多种生物效应, 如保护神经细胞不受细胞凋亡, 改善代谢标志物, 以及保护细胞免受化疗。Humanin 是第一个被发现的 MDP, 是 MDP 家族中最受研究的肽。humanin 的膜受体和下游信号通路都经过了细致的表征。更多的 mdp, 如妙语和 SHLP1-6, 最近发现和信号机制尚未阐明。在这里, 我们描述了一种基于细胞培养的方法来确定这些肽的功能。特别是, 细胞分馏技术结合与西方印迹允许定量确定的激活和易位的重要信号分子。虽然还有其他的细胞分离方法, 这里描述的是一个简单明了的方法。这些方法可用于进一步阐明这些肽和其他治疗剂的作用机理。

引言

新兴研究表明, 线粒体衍生肽 (mdp) 在细胞和新陈代谢中起重要作用1,2,3。了解 mdp 存在下的信号转导通路, 可以让我们洞察 mdp 调节各种功能的机制。第一个确定的 MDP, humanin, 已证明增加细胞外信号调节激酶 1/2 (ERK1/2) 磷酸化通过其受体结合4,5。然而, ERK1/2 活化的下游效应仍 (。

ERK1/2 级联在各种细胞过程中起着重要的中介作用, 包括增殖、细胞迁移、细胞代谢、存活和凋亡6、7、8。为了协调所有这些不同的细胞过程, ERK1/2 的活性和亚型定位受到磷酸和支架蛋白的严格调控9,10。除了修饰修改, ERK1/2 的动态穿梭还调节其信号功能、活动和特异性11,12。ERK1/2 主要在胞13中进行本地化。一组锚和支架蛋白有助于保留 ERK1/2 在骨架元素, 在细胞器表面, 或在细胞质中扩散13。在刺激下, ERK1/2 磷酸化并与它的锚固蛋白分离, 允许 ERK1/2 转移到其他亚细胞室, 包括细胞核、线粒体、高尔基体和溶酶体14,15,16。

虽然 humanin 是已知的激活 ERK1/2 信号通路, ERK1/2 的激活只观察到总细胞裂解。如前所述, 由于 ERK1/2 亚细胞定位在其下游效应中起着至关重要的作用, 对亚细胞定位和磷酸化 ERK1/2 的总水平的分析是必要的, 以提供全面的理解humanin 诱导的 ERK1/2 活化和下游靶点的活化。

为了了解活化 ERK1/2 的靶细胞器, 进行了亚细胞分离, 其次为磷酸化 ERK1/2。这种方法可以很容易地实现, 因为它利用标准的实验室设备和试剂。分离的亚细胞室纯度高, 能使结果得到直截了当的解释。免疫的 ERK1/2 可能产生类似的结果。然而, 某些亚细胞隔间相对来说很难形象化, 需要特殊的固定和性方法。ERK1/2 的水平在亚细胞间不同, 这种变化可能导致假阳性和假阴性信号时, 看整个单元裂解。因此, 一个免疫使用孤立的亚细胞舱室让我们更好地了解 ERK1/2 的本地化。

该方法的通用性, 使该协议的修改, 以调查其他兴奋剂的影响, 包括其他 mdp 或其他信号分子的易位, 如 STAT3。最近发现的小 humanin 样肽 (SHLPs) 是编码从 16S rRNA 地区的 humanin 编码, 他们有相似的, 但独特的属性相比,17。例如, SHLP2 和 SHLP3 激活 ERK1/2 后8小时, 虽然 humanin 激活 ERK1/2 在5分钟内. 研究 ERK1/2 的亚细胞定位对不同肽的反应将使我们更好地了解这些肽的生物学。新的证据表明, 信号分子的亚细胞定位在其下游效应中起着至关重要的作用。例如, STAT3 传统上是已知的主要是在胞的休眠细胞, 然后它 translocates 到细胞核激活基因表达, 以响应细胞因子18。STAT3 也 translocates 线粒体和调节 TCA 循环和 ATP 生产19。关于自噬调控, 不同的亚细胞定位 STAT3 调节自噬的各种方式20。例如, 核 STAT3 转录调节自噬相关基因, 并充当自噬调制器。胞质 STAT3 组成通过与自噬信号分子相互作用抑制吞噬。线粒体 STAT3 抑制和防止 mitophagy 的氧化应激诱导自噬。因此, 这种亚细胞隔离方法对于理解其他信号分子以及 ERK1/2 的作用是至关重要的。

研究方案

1. 对细胞的多肽处理

  1. 板 200万 SH-SY5Y 或 HEK293 细胞 (2 x 10 6 ) 放入10厘米的盘中并长出2天
  2. (可选) 第二天, 用无血清的 Dulbecco 和 #39 清洗细胞; s 修改鹰培养基 (DMEM) 培养基一旦需要在血清自由介质中进行, 可以在一夜之间用血清自由 DMEM.
  3. 在3天, 溶解 S14G-humanin 肽在0.2 和 #181; m 过滤, 蒸馏水, 并重组为1mM 库存解决方案.
    注: 多肽应溶于适当的溶剂, 这可以由肽的序列特征 ( 例如 , 总电荷) 来确定, 如果多肽是商用的, 可以由制造商提供。例如, S14G-humanin, SHLP2, 和 SHLP6, 和妙语溶解在水中。在适当的体积 ( 例如 , 50 和 #956; L) 中分多肽, 以避免冻结和解冻循环。一旦解冻, 不要再使用它们.
  4. 分在50毫升锥形管中5ml 含血清或无血清培养基, 并添加室温1毫米的溶液, 使其进入工作浓度 ( 如 , 1 和 #181; m, 10 和 #181; m).
  5. 从步骤1.4 中用6毫升肽溶液替换介质. 并在适当的时间内孵育细胞.
    注意: 根据激活 ERK 的条件选择孵育时间.

2。胞和核的亚细胞分馏

  1. 用10毫升的 ice-cold pbs 清洗两次电池, 在5毫升的 ice-cold pbs 中刮掉板上的细胞, 将细胞悬浮液转化为15毫升的锥形管.
  2. 离心 500 x g 的细胞5分钟在4和 #176; C.
  3. 在200和 #181 中吸出 PBS 并 re-suspend 颗粒; ice-cold, 分馏缓冲 (10 毫米 HEPES pH = 7.6, 3 毫米氯化镁 2 , 10 毫米氯化钾, 5% (v/v) 甘油, 1% 非离子表面活性剂 (c 13 h 22 o (c 2 h 4 o) n ), 蛋白酶/磷酸酶抑制剂).
    注意: 为了保持蛋白质的磷酸化状态, 磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂应新鲜添加, 样品应保持在冰上的时刻。应避免重复冻结和解冻样品循环。将样本分为少量 ( 例如 50 和 #956; g), 然后将其冻结在-80 和 #176; C.
  4. 在冰上孵育悬浮颗粒15分钟, 然后在 250 x g 离心5分钟, 在4和 #176; C.
  5. 收集上清液为细胞质分数, 并保持颗粒为核分数.
  6. 离心上清液去除细胞碎片和其他污染物在 1.8万 x g 为10分钟在4和 #176; C 然后转移上清成一个新的离心管。这是胞的分数.
  7. 重200和 #956 中的颗粒; L ice-cold 洗涤缓冲器 (10 毫米 HEPES pH = 7.6, 1.5 毫米氯化镁 2 , 420 毫米氯化钠, 25% (v/v) 甘油, 0.2 毫米 EDTA, 蛋白酶/磷酸酶抑制剂) 和离心机在 250 x g 为 5 min 在4和 #176; C
  8. 在100和 #956 中除去上清和重颗粒; L ice-cold, 核萃取缓冲 (20 毫米 HEPES pH = 7.6, 1.5 毫米氯化镁 2 , 420 毫米氯化钠, 25% (v/v) 甘油, 0.2 毫米 EDTA, 蛋白酶/磷酸酶抑制剂) 和几种10次 (5 s on, 十年代关闭, 30% 安培)在冰上.
  9. 1.8万 x g 离心10分钟在4和 #176; C.
  10. 将上清液转移到新的离心管。这是核子分数.
  11. 使用一个免疫分析方法量化蛋白质量

3. 粗的线粒体分数

  1. 用10毫升的 ice-cold pbs 洗涤每 10 cm 盘中的细胞, 加入5毫升 ice-cold pbs, 并使用细胞刮板分离细胞.
    注: 使用三10厘米的细胞, 以获得良好的产量线粒体为西方印迹.
  2. 将电池悬浮液转换为15毫升锥形管, 并将所有从三10厘米的菜肴组合成一个15毫升的锥形管.
  3. 离心 600 x g 的细胞10分钟在4和 #176; C.
  4. 吸 PBS 和 re-suspend 1 毫升的 ice-cold 线粒体隔离缓冲 (10 毫米三拖把, 1 毫米 EGTA/三, 200 毫米蔗糖, 调整 pH = 7.4).
  5. 质25冲程2毫升均质机与聚四氟乙烯涂层杵在冰上的细胞.
    注意: 这一步是关键的保持线粒体的完整性和最大的收益率的线粒体分数。应针对每个单元格类型优化笔画数。在开始操作前冷匀浆机.
  6. 将匀浆转移到离心管, 并将其离心于 600 x g, 用于10分钟的4和 #176; C 以除去细胞核和完整的细胞.
  7. 收集上清液, 转移到一个新的离心管, 并离心 7000 x g 为10分钟, 在4和 #176; C.
    注: 颗粒松散, 用小心收集上清, 并尽量不扰乱颗粒.
  8. 去除上清液, re-suspend 200 和 #956 的颗粒; ice-cold 线粒体隔离缓冲, 并将溶液转移到新的离心管。离心管在 7000 x g 为10分钟在4和 #176; C.
  9. 重复步骤3.8 以清洗颗粒。在这一步中, 没有必要将上清液转移到新的离心管上.
  10. 从洗涤过的颗粒中去除上清液, 并 re-suspend 50 和 #956 的含有线粒体的颗粒; 帕缓冲.
  11. 在冰上孵育悬浮液10分钟.
  12. 离心悬浮在 1.6万 x g 为15分钟在4和 #176; C.
  13. 将上清液转移到新的离心管。这是线粒体的分数.
  14. 使用定量检测方法量化蛋白质量.

4。磷特异蛋白的西部印迹

  1. 执行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (8-16% 预制凝胶) 并将蛋白质转移到 PVDF 膜上 4 。
  2. 在室温下孵育 5% BSA 的 TBST (0.1% 聚 20), 以阻止背景不特定的结合点.
    注意: 对于磷酸化蛋白检测, 用 BSA 不加牛奶阻止细胞膜。牛奶含有酪蛋白, 一个丰富的磷, 导致高非特异性信号.
  3. 在一夜之间用主抗体 (anti-phospho-ERK1/2) 在4和 #176 孵育膜.
  4. 第二天, 在室温下用 TBST (0.1% 聚 20) 冲洗膜三次, 为5分钟.
  5. 室温下, 用二次抗体 (兔 HRP) 孵育膜1小时.
  6. 在室温下用 TBST (0.1% 聚 20) 清洗膜三次, 以5分钟.
  7. 用 ECL 溶液孵育膜, 并在图像分析仪中对膜进行图像处理.
  8. 在室温下剥去15分钟的剥离缓冲膜, 用 TBST 三次清洗5分钟.
  9. 使用 anti-total ERK1/2 抗体重复步骤4.2 到 4.7.
  10. 检查每个分数的纯度, 运行 SDS 页和执行 immunoblots 使用抗体识别每个舱室的标记 ( 如 , Lamin B1 核, GAPDH 胞, TOM20 线粒体).

结果

使用这里介绍的过程, 我们对待 HEK293 和 SH-SY5Y 细胞与1μ m 和100μ m S14G-humanin, 一个强有力的 humanin 模拟21分别, 在完全媒介为被表明的时间期间 (图 1a和图 1 B). 然后, 我们检查了 ERK1/2 在202/Tyr204从总蛋白提取物的总和磷酸化形式。S14G-humanin 治疗显示, 在其监管的202

讨论

在这里, 我们证明了 humanin 肽介导的 ERK1/2 活化发生在两种不同的细胞类型, 并根据条件 (例如, 肽的剂量, 时间点和细胞, 活化 ERK1/2 的亚单位的本地化可以是不同的。类型)。它已经表明, humanin 信号通过两个不同的受体22,23, 这可能解释两个细胞线之间的信号的差异, 以及对不同剂量的 humanin 的要求。这方面的生理意义还没有得到充分的研究, 但它可...

披露声明

Pinchas Cohen 是 CohBar 的股东和顾问, Inc. 是 CohBar 的顾问, Inc。

致谢

这项工作得到了埃里森/阿法尔博士后研究员在老龄化研究项目 SJK, 和格伦基金会奖和 NIH 授予 PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812)。所有的作者都出现在影片中。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
p44/42 MAPK (ERK1/2)Cell signaling9102Dilution 1:1,000
phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)Cell signaling4370Dilution 1:1,000
Lamin B1Cell signaling12586Nuclear Marker, Dilution 1:1,000
GAPDHCell signaling5174Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000
Tom20Santa cruzSC-17764Mitochondria marker, Dilution 1:2,000
anti-Rabbit-HRP conjugatedCell signaling7074Dilution 1:30,000
RIPA Lysis and Extraction BufferThermoFisher SCIENTIFIC89900
100 mm Culture DishThermoFisher SCIENTIFIC12556002
HNG peptideGenescript
25mm sylinge filterThermoFisher SCIENTIFIC09-719A
HEPESSigmaH3375
MgCl2SigmaM8266
KClSigmaP9333
GlycerolSigmaG9012
Triton X-100ThermoFisher SCIENTIFICBP151-100
EDTASigma3609
MOPSSigmaM1254
EGTASigmaE3889
SucroseSigmaS7903
Tris-baseThermoFisher SCIENTIFICBP152-1
HCLSigmaH1758
PBSLonza17-512F
Cell ScraperFALCON353085
Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)ThermoFisher SCIENTIFIC78440
Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth PestlesThomas Scientific3432S90
Tween-20ThermoFisher SCIENTIFICBP337-500
BSAThermoFisher SCIENTIFICBP1600-100
8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBIO RAD4561104
Mini Trans-Blot ModuleBIO RAD1658030
Trans-Blot Turbo Transfer SystemBIO RAD1704150
Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer KitBIO RAD1704272
Clarity Western ECL Blotting SubstratesBIO RAD1705060
Restore Western blot stripping bufferThermoFisher SCIENTIFIC21059
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermoFisher SCIENTIFIC11965-092
Sonicator, Medel: FB120ThermoFisher SCIENTIFIC695320-07-12

参考文献

  1. Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance. J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).
  2. Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action. PloS one. 4 (7), 6334 (2009).
  3. Lee, C., Yen, K., Cohen, P. Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides. Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).
  4. Kim, S. J., Guerrero, N., et al. The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus. Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).
  5. Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
  6. Zhang, W., Liu, H. T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).
  7. Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. MAP kinases and cell migration. J. Cell Sci. 117, 4619-4628 (2004).
  8. Cagnol, S., Chambard, J. -. C. ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence. FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).
  9. Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
  10. Morrison, D. K., Davis, R. J. Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).
  11. Wainstein, E., Seger, R. The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles. Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).
  12. Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus. Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).
  13. Kolch, W. Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).
  14. Horbinski, C., Chu, C. T. Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death. Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).
  15. Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization. Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).
  16. Zhu, J. -. H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases. Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).
  17. Cobb, L. J., Lee, C., et al. Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers. Aging. 8 (4), 796-809 (2016).
  18. Ihle, J. N. The Stat family in cytokine signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).
  19. Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism. Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).
  20. You, L., Wang, Z., et al. The role of STAT3 in autophagy. Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).
  21. Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults. The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).
  22. Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
  23. Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

127mdpERK

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。