АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает стимулируют клетки с митохондриальных производные пептидов и оценить сигнальный Каскад и локализации Фосфоропротеиды.

Аннотация

Пептиды митохондриальной производных (MDPs) являются новый класс пептидов, которые кодируются в небольших открытых чтения фреймов внутри других известных генов митохондриального генома. MDPs имеют широкий спектр биологических эффектов, таких как защита от апоптоза нейронов, улучшение метаболических маркеры и защите клеток от химиотерапии. Humanin был первым MDP быть открынным и является наиболее изученным пептид среди MDP семьи. Тщательно характеризовались мембранных рецепторов и ниже по течению сигнальных путей humanin. Совсем недавно были обнаружены дополнительные MDPs например MOTS-c и SHLP1-6 и сигнальных механизмов еще должны быть освещены. Здесь мы описываем клетки культуры на основе метода определения функции этих пептидов. В частности методы фракционировки клетки в сочетании с Западный blotting позволяют для количественного определения активации и транслокации важных сигнальной молекулы. Хотя существуют другие методы фракционировки клетки, описанные здесь является простой и простой метод. Эти методы могут использоваться для дальнейшего выяснения механизма действия этих пептидов и других терапевтических агентов.

Введение

Новые исследования показывают, митохондриальных производные пептидов (MDPs) играют важную роль в cytoprotection и метаболизма1,2,3. Понимание пути трансдукции сигнала в присутствии MDPs дает нам представление о механизм, по которому MDPs модулировать различные функции. Первый выявленных MDP, humanin, было показано, что увеличение внеклеточного сигнала регулируется киназы 1/2 (ERK1/2) фосфорилирование через свой рецептор привязки4,5. Однако до сих пор underexplored течению эффект активации ERK1/2.

ERK1/2 каскада служит важным посредником в различных клеточных процессах, включая распространение, миграции клеток, клеточный метаболизм, выживания и апоптоз6,,78. Для всех этих различных клеточных процессов, деятельности и внутриклеточных локализации ERK1/2 жестко регулируются фосфатаз и эшафот белки9,10. В дополнение к столб-поступательные изменения динамический челночные ERK1/2 также регулирует его сигнальной функции, деятельность и специфика11,12. ERK1/2 локализуется преимущественно в цитозоль13. Набор крепления и леска белков помогают сохранить ERK1/2 цитоскелетных элементов, на поверхности органеллы, или рассеянным в цитоплазме13. После стимуляции ERK1/2 является фосфорилированных и становится в отрыве от его закрепления белков, позволяя транслокации ERK1/2 для других внутриклеточных отсеков, включая ядро, митохондрии, Гольджи и лизосом14, 15 , 16.

Хотя humanin известен для того чтобы активировать сигнальный путь ERK1/2, в всего lysates клетки только наблюдается активации ERK1/2. Как описано ранее, поскольку локализация внутриклеточных ERK1/2 играет решающую роль в ее течению эффект, анализ субцеллюлярные локализации и общий уровень фосфорилированных ERK1/2 необходимо обеспечить полное понимание humanin индуцированной активации ERK1/2 и активации течению целей.

Чтобы понять цель органеллы активированного ERK1/2, была выполнена субцеллюлярные фракционирования, следуют Западный blotting для фосфорилированных ERK1/2. Этот метод может быть легко реализован как он использует стандартные лабораторного оборудования и реагентов. Высокой чистоты, позволяя результаты прямолинейно трактовать субцеллюлярные изолированных отсеков. Иммуноокрашивания ERK1/2 может дать аналогичные результаты. Однако некоторые субцеллюлярные отсеков относительно трудно визуализировать и требуют специальных методов фиксации и permeabilization. ERK1/2 уровни различаются в отсеках, субклеточном, и этот вариант может вызвать ложные положительные, так и отрицательные сигналы при взгляде на весь lysates клетки. Таким образом immunoblot с помощью изолированных отсеков субцеллюлярные дает нам лучшее понимание локализации ERK1/2.

Универсальность метода позволяет модификации протокола для расследования последствий других стимуляторов, включая другие MDPs или транслокации других сигнальных молекул, таких как STAT3. Недавно обнаружил небольшой humanin подобных пептидов (SHLPs) кодируются с 16S рРНК региона, где humanin кодируется, и они имеют аналогичные, но различные свойства, по сравнению с HN17. К примеру SHLP2 и SHLP3 активировать ERK1/2 после того, как 8 h хотя humanin активирует ERK1/2 в течение 5 минут изучения субцеллюлярные локализации ERK1/2 в ответ на различные пептиды даст нам лучше понять биологии этих пептидов. Новые данные показали, что локализация внутриклеточных сигнальных молекул играет решающую роль в их нижнем эффекты. К примеру STAT3 традиционно известен в основном локализовано в цитозоле клеток отдых, а затем он translocates в ядро для того чтобы активировать экспрессии генов в ответ цитокинов18. STAT3 также translocates митохондрий и регулирует TCA цикла и производства АТФ19. Что касается регулирования autophagy различных внутриклеточных локализации STAT3 модулирует autophagy в различных способов20. Например ядерные STAT3 транскрипционно регулирует autophagy связанных генов и действует как модулятор autophagy. Цитоплазматическая STAT3 конститутивно подавляет autophagy, взаимодействуя с autophagy сигнальных молекул. Митохондриальной STAT3 препятствует и предотвращает mitophagy, подавляя Оксидативный стресс индуцированной autophagy. Таким образом этот метод изоляции субцеллюлярные отсек имеет решающее значение для понимания роли других сигнальных молекул, а также ERK1/2.

протокол

1. Лечение пептидных клеток

  1. пластины два миллиона SH-SY5Y или HEK293 клетки (2 x 10-6) в 10 см блюдо и вырастить их за 2 дня
  2. (опционально) следующий день, вымыть клетки с сыворотка бесплатно Дульбекко ' s изменен Орел СМИ среднего (DMEM) один раз и инкубировать с сывороткой, бесплатные DMEM на ночь, если лечение должно быть сделано в сыворотке крови свободных средств массовой информации и.
  3. На 3 день, растворяют S14G-humanin пептидов в 0,2 мкм отфильтрованы, дистиллированную воду и восстановить их как Стоковый раствор 1 мм.
    Примечание: Пептиды должен быть распущен в соответствующим растворителем, который может определяться характеристики последовательности пептида (например, общий заряд) и могут быть предоставлены изготовителем, если пептиды коммерчески доступны. Например S14G-humanin, SHLP2 и SHLP6 и MOTS-c растворяют в воде. Аликвота пептидов в соответствующий объем (например, 50 мкл) чтобы избежать замораживания и оттаивания циклов. После размораживания, не использовать их снова.
  4. Алиготе подогретым сыворотки содержащих или сыворотки свободных средств массовой информации в 50 мл конические пробки и добавить комнатной температуре 1 мм Стоковый раствор, чтобы превратить его в рабочей концентрации (например, 1 мкм, 10 мкм).
  5. Заменить СМИ с 6 мл раствора пептид из шага 1.4. и инкубировать клетки для достаточное количество времени и.
    Примечание: Выберите время инкубации в зависимости от вашего состояния, которое активирует Эрк.

2. Субцеллюлярные фракционирование цитозоле и ядра

  1. вымыть клетки дважды с 10 мл ледяной PBS, скрести клетки от пластины в 5 мл ледяной PBS и передачи суспензию клеток в 15 мл Конические трубки.
  2. Центрифуга клетки на 500 g x 5 мин на 4 ° C.
  3. Аспирационная PBS и вновь приостановить гранулы в 200 мкл ледяной, фракционирование буфера (10 мм HEPES рН = 7.6, 3 мм MgCl 2, 10 KCl, 5% (v/v) глицерина, 1% неионные ПАВ (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) n), ингибиторы протеазы/фосфатазы).
    Примечание: Чтобы белки в их статус фосфорилирование, АБС битор фосфатазы как также протеазы ингибитор должны добавляться свеже и образцы должны храниться на льду на все времена. Повторяя замораживания и оттаивания циклов проб следует избегать. Аликвота образцы в небольшом количестве (например 50 мкг) до замораживания их на -80 ° C.
  4. Инкубировать вновь приостановлено гранул на льду за 15 мин и затем центрифуги на 250 g x 5 мин на 4 ° C.
  5. Собирать супернатанта как цитоплазматических дроби и держать гранулы для ядерной дроби.
  6. Центрифуга супернатант удаления сотовой мусора и других загрязнений на 18,000 g x 10 мин при температуре 4 ° C и затем передать супернатант в новые пробки microcentrifuge. Это та доля цитозоль.
  7. Ресуспензируйте гранулы в 200 мкл буфера ледяной мыть (10 мм HEPES рН = 7.6, 1,5 мм 2 MgCl 420 NaCl, 25% (v/v) глицерина, ЭДТА 0,2 мм, ингибиторы протеазы/фосфатазы) и центрифуги на 250 x g 5 минут при температуре 4 ° C
  8. Удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 100 мкл буфера ледяная, ядерный экстракции (20 мм HEPES рН = 7.6, 1,5 мм 2 MgCl 420 NaCl, 25% (v/v) глицерина, ЭДТА 0,2 мм, ингибиторы протеазы/фосфатазы) и sonicate в 10 раз (5 s на 10 s Выкл, 30% АМП.) на льду
  9. Центрифуга на 18,000 g x 10 мин при 4 ° C.
  10. Передавать новые пробки microcentrifuge супернатант. Это та доля ядерной.
  11. QUANTIFY белок сумму с помощью BCA пробирного

3. сырой митохондриальной фракции

  1. мыть ячейки в каждом 10 см блюдо с 10 мл ледяной PBS, добавить 5 мл ледяной PBS и отсоединить клетки, клетки скребком.
    Примечание: Использовать три блюда 10 см клеток, чтобы получить хороший урожай митохондрий для западный Blotting.
  2. Передавать Конические трубки 15 мл суспензии клеток и объединить все из трех блюд 10 см в один из 15 мл Конические трубки.
  3. Центрифуга клетки на 600 g x 10 мин на 4 ° C.
  4. Аспирационная PBS и вновь приостановить гранулы в 1 мл ледяной митохондрий изоляции буфера (10 мм трис-швабры, 1 мм EGTA/трис, 200 мм сахарозы, приспособиться к рН = 7,4).
  5. Гомогенизировать клетки с 25 ударов гомогенизатор 2 мл с покрытием из политетрафторэтилена пестиком на льду
    Примечание: Этот шаг очень важен митохондриальной целостность и увеличить доходность митохондриальной дроби. Количество ударов должна быть оптимизирована для каждого типа клеток. Precool гомогенизатор перед началом процедуры.
  6. Передавать пробки microcentrifuge огневки и центрифуги на 600 x g 10 мин при 4 ° C для удаления ядра и нерушимой клетки.
  7. Собирать супернатанта, перенести его на новые пробки microcentrifuge и центрифуги на 7000 x g 10 мин на 4 ° C.
    Примечание: Гранулы рыхлая, собирать супернатант с осторожностью и не пытаться нарушить гранулы.
  8. Удалить супернатант, вновь приостановить лепешка с 200 мкл буфера изоляции ледяной митохондрий и решение передать новые пробки microcentrifuge. Центрифуга трубки на 7000 x g 10 мин на 4 ° C.
  9. Повторите шаг 3,8 чтобы помыть лепешка. Это не обязательно передать новой трубки microcentrifuge в этом шаге супернатант.
  10. Удалить супернатант из промытого гранулы и вновь приостановить гранулы, содержащие митохондрии с 50 мкл Буфер RIPA.
  11. Инкубировать подвеска на льду за 10 мин.
  12. Центрифуга подвеска на 16000 x g 15 мин на 4 ° C.
  13. Передавать новые пробки microcentrifuge супернатант. Это митохондриальной дроби.
  14. Подсчитать сумму белка, с помощью BCA пробирного.

4. Западный Blotting для фосфо-специфических белков

  1. выполнить электрофореза геля SDS-полиакриламид (8-16% Готовые гель) и переноса белка PVDF мембрану 4.
  2. Проинкубируйте мембрану с 5% BSA в TBST (0,1% Полисорбат 20) за 30 мин при комнатной температуре для блокирования сайтов связывания фон неспецифической.
    Примечание: Для обнаружения фосфорилированных белка, блокировать мембраны с BSA не молоко. Молоко содержит казеина, обильные фосфоропротеид, что приводит к высокой неспецифических сигнала.
  3. Проинкубируйте мембрану с основного антитела (анти фосфо ERK1/2) при 4 ° C на ночь.
  4. Следующий день, Промойте мембрану с TBST (0,1% Полисорбат 20) три раза в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Проинкубируйте мембрану с вторичное антитело (анти кролик ПХ) за 1 ч при комнатной температуре.
  6. Мыть мембраны с TBST (0,1% Полисорбат 20) три раза в течение 5 мин при комнатной температуре.
  7. Проинкубируйте мембрану с решением ECL и изображение мембраны в анализаторе изображений.
  8. Полоса мембраны с зачистки буфер для 15 мин при комнатной температуре и мыть мембраны с TBST три раза за 5 мин.
  9. Повторите шаги от 4,2 до 4,7 с использованием антител против всего ERK1/2.
  10. Для проверки чистоты каждой фракции, запускать SDS-страницы и выполнять иммуноблотов с использованием антител, признавая маркеры для каждого отсека (например, Ламин B1 для ядра, GAPDH для цитозоле и TOM20 для митохондрий).

Результаты

С помощью процедуры, представленные здесь, мы относились к HEK293 и SH-SY5Y клетки с 1 мкм и 100 мкм S14G-humanin, мощным humanin аналоговый21, соответственно, в комплекте средств массовой информации для указанных периодов (рис. 1A и 1 рисуно...

Обсуждение

Здесь мы показали, что humanin пептид опосредованной активации ERK1/2 происходит в двух различных типов клеток, и внутриклеточных локализации активированного ERK1/2 может быть различным в зависимости от условий (например, дозой пептида, момент времени, и клетки тип). Было доказано, что humanin ?...

Раскрытие информации

Коэн Пинхас является акционером и консультант для Кельвин CohBar, Inc., Йен служил в качестве консультанта для CohBar, Inc.

Благодарности

Эта работа была поддержана докторантура стипендий Эллисон/Афар в старения программы исследований для SJK, и премии Фонда Гленн и низ предоставляет ПК (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Все авторы появляются в фильме.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
p44/42 MAPK (ERK1/2)Cell signaling9102Dilution 1:1,000
phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)Cell signaling4370Dilution 1:1,000
Lamin B1Cell signaling12586Nuclear Marker, Dilution 1:1,000
GAPDHCell signaling5174Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000
Tom20Santa cruzSC-17764Mitochondria marker, Dilution 1:2,000
anti-Rabbit-HRP conjugatedCell signaling7074Dilution 1:30,000
RIPA Lysis and Extraction BufferThermoFisher SCIENTIFIC89900
100 mm Culture DishThermoFisher SCIENTIFIC12556002
HNG peptideGenescript
25mm sylinge filterThermoFisher SCIENTIFIC09-719A
HEPESSigmaH3375
MgCl2SigmaM8266
KClSigmaP9333
GlycerolSigmaG9012
Triton X-100ThermoFisher SCIENTIFICBP151-100
EDTASigma3609
MOPSSigmaM1254
EGTASigmaE3889
SucroseSigmaS7903
Tris-baseThermoFisher SCIENTIFICBP152-1
HCLSigmaH1758
PBSLonza17-512F
Cell ScraperFALCON353085
Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)ThermoFisher SCIENTIFIC78440
Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth PestlesThomas Scientific3432S90
Tween-20ThermoFisher SCIENTIFICBP337-500
BSAThermoFisher SCIENTIFICBP1600-100
8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBIO RAD4561104
Mini Trans-Blot ModuleBIO RAD1658030
Trans-Blot Turbo Transfer SystemBIO RAD1704150
Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer KitBIO RAD1704272
Clarity Western ECL Blotting SubstratesBIO RAD1705060
Restore Western blot stripping bufferThermoFisher SCIENTIFIC21059
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermoFisher SCIENTIFIC11965-092
Sonicator, Medel: FB120ThermoFisher SCIENTIFIC695320-07-12

Ссылки

  1. Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance. J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).
  2. Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action. PloS one. 4 (7), 6334 (2009).
  3. Lee, C., Yen, K., Cohen, P. Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides. Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).
  4. Kim, S. J., Guerrero, N., et al. The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus. Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).
  5. Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
  6. Zhang, W., Liu, H. T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).
  7. Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. MAP kinases and cell migration. J. Cell Sci. 117, 4619-4628 (2004).
  8. Cagnol, S., Chambard, J. -. C. ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence. FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).
  9. Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
  10. Morrison, D. K., Davis, R. J. Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).
  11. Wainstein, E., Seger, R. The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles. Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).
  12. Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus. Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).
  13. Kolch, W. Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).
  14. Horbinski, C., Chu, C. T. Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death. Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).
  15. Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization. Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).
  16. Zhu, J. -. H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases. Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).
  17. Cobb, L. J., Lee, C., et al. Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers. Aging. 8 (4), 796-809 (2016).
  18. Ihle, J. N. The Stat family in cytokine signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).
  19. Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism. Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).
  20. You, L., Wang, Z., et al. The role of STAT3 in autophagy. Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).
  21. Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults. The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).
  22. Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
  23. Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

127Mitochondrial MDPs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены