Fractionation subcellular להפעלה טיפשה על פפטיד מיטוכונדריאלי נגזר הטיפול

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד לעורר תאים עם פפטידים מיטוכונדריאלי נגזר ולהעריך את המפל ואת לוקליזציה של פוספו-חלבונים איתות.

Abstract

פפטידים, נגזר מיטוכונדריאלי (MDPs) הם סוג חדש של פפטידים מקודדים על ידי קריאה פתוחה קטנה מסגרות אחרות הגנים הידועים של הגנום מיטוכונדריאלי. MDPs יש מגוון רחב של השפעות ביולוגיות כגון הגנה על הנוירונים מפני אפופטוזיס, שיפור סמנים מטבוליים, הגנה על תאים מכימותרפיה. Humanin היה MDP הראשון להתגלות, פפטיד הכי נחקרות בקרב משפחת MDP. קולטני ממברנה ואת הזרם איתות המסלולים של humanin יש בקפידה מלווה. MDPs נוספים כגון MOTS-c ו- SHLP1-6 התגלו לאחרונה, מנגנוני איתות שעדיין לא להיות הובהר. כאן נתאר שיטת תרבות המבוססת תא כדי לקבוע את הפונקציה של פפטידים אלה. בפרט, מאפשרים תא טכניקות fractionation בשילוב עם סופג המערבי הקביעה כמותית של ההפעלה, טרנסלוקציה של מולקולת איתות חשוב. אמנם יש שיטות אחרות של תא fractionation, המתואר כאן היא שיטה פשוטה וקלה. שיטות אלה ניתן להבהיר עוד יותר את מנגנון הפעולה של פפטידים אלה וסוכנים טיפוליים אחרים.

Introduction

המתעוררים מחקרים מראים כי מיטוכונדריאלי נגזר פפטידים (MDPs) תפקיד חשוב cytoprotection ואת חילוף החומרים^1,2,3. הבנת מסלול התמרה חושית אות בנוכחות MDPs נותן לנו תובנה המנגנון שבאמצעותו MDPs לווסת פונקציות שונות. MDP מזוהה הראשון, humanin, הוכח להגדיל חוץ-תאית מוסדר אות קינאז 1/2 (ERK1/2) זרחון באמצעות הקולטן שלו מחייב^4,5. עם זאת, השפעת הזרם הפעלה ERK1/2 הוא עדיין כשתפסעו.

המפל ERK1/2 משמש מתווך חיוני במגוון תהליכים תאיים כולל התפשטות, נדידת תאים, חילוף החומרים הסלולר, הישרדות של אפופטוזיס-^6,-^7,-⁸. שננהל את כל אלה תהליכים תאיים שונים, פעילות subcellular לוקליזציה של ERK1/2 מוסדרים בחוזקה על ידי phosphatases ולגרדום חלבונים^9,10. בנוסף השינוי post-translational, ונעים דינמי של ERK1/2 גם מסדיר את איתות פונקציה, פעילות וספציפיות^11,12. ERK1/2 הוא בעיקר מקומי ציטוזול¹³. קבוצה של חלבונים עיגון, לגרדום לסייע לשמור על ERK1/2 אלמנטים cytoskeletal, על פני שטח של organelles, או כשמאירים הציטופלסמה¹³. על גירוי, ERK1/2 הוא phosphorylated, הופך בלתי משויך לזהויות חלבונים עגינת שלה, המאפשר רוברטסונית של ERK1/2 כדי מדורים subcellular אחרים, לרבות גרעין, מיטוכונדריה, גולג'י, lysosomes^{14, 15 , 16}.

למרות humanin ידוע כדי להפעיל את איתות ERK1/2, הפעלת ERK1/2 נצפית רק ב lysates התא סך הכל. כפי שתואר לעיל, מאז לוקליזציה subcellular ERK1/2 ממלא תפקיד מכריע השפעתו במורד הזרם, הניתוח של הן ההתאמה subcellular ואת רמות סך של phosphorylated ERK1/2 יש צורך לספק הבנה מקיפה של הפעלת ERK1/2 humanin-induced והפעלה של מטרות במורד הזרם.

כדי להבין את organelles המטרה של הפעלת ERK1/2, בוצעה fractionation subcellular ואחריו סופג המערבי ERK1 phosphorylated/2. בשיטה זו ניתן ליישם בקלות כפי הוא מנצל ריאגנטים וציוד מעבדה סטנדרטיים. התאים subcellular מבודדים הן טוהר גבוהה, ומאפשר את התוצאות יפורשו אבר המין הגברי. Immunostaining של ERK1/2 עשויה לייצר תוצאות דומות. עם זאת, תאים subcellular מסוימים קשים יחסית להמחיש ויידרש קיבוע מיוחד ושיטות permeabilization. ERK1/2 רמות משתנות של תאים subcellular, וריאציה זו עלולה לגרום אותות שלילי כוזב חיובי ו- false כאשר מסתכלים על כל התא lysates. לכן, immunoblot באמצעות תאים מבודדים subcellular נותן לנו הבנה טובה יותר של לוקליזציה ERK1/2.

צדדיות של השיטה מאפשרת שינויים בפרוטוקול כדי לחקור את ההשפעות של ממריצים אחרים כולל טרנסלוקציה של מולקולות איתות אחרות כגון STAT3 או MDPs אחרים. לאחרונה התגלה קטן humanin דמויי פפטידים (SHLPs) מקודדים מאזור rRNA 16 שבו humanin מקודד, יש להם מאפיינים דומים אך ברורים בהשוואה ל ח נ¹⁷. לדוגמה, SHLP2 ו- SHLP3 להפעיל ERK1/2 לאחר 8 שעות למרות humanin מפעילה ERK1/2 תוך 5 דק Examining subcellular לוקליזציה של ERK1/2 בתגובה פפטידים שונים ייתן לנו הבנה טובה יותר של הביולוגיה של פפטידים אלה. מתעוררים הראיות הראה לוקליזציה subcellular של מולקולות איתות ממלא תפקיד מכריע שלהם אפקטים במורד הזרם. למשל, STAT3 באופן מסורתי ידוע להיות מותאם בעיקר ציטוזול בתאים resting ולאחר מכן זה translocates לתוך הגרעין להפעלת גנים בתגובה ציטוקינים¹⁸. STAT3 גם translocates את המיטוכונדריה, מסדיר את המחזור TCA ו- ATP ייצור¹⁹. מנשר autophagy, לוקליזציה subcellular שונים של STAT3 ממיקרו autophagy דרכים שונות²⁰. לדוגמה, STAT3 גרעיני transcriptionally מסדיר גנים הקשורים autophagy, משמש אפנן autophagy. Cytoplasmic STAT3 מעכב צורונים autophagy על ידי אינטראקציה עם autophagy מולקולות איתות. STAT3 מיטוכונדריאלי מעכב ומונע mitophagy על-ידי דיכוי autophagy סטרס חמצוני המושרה. לכן, בשיטה זו בידוד תא subcellular חיוני להבנת תפקידם של אחרים איתות מולקולות כמו גם ERK1/2.

Protocol

1. טיפול פפטיד לתאים

1. צלחת שני מיליון SH-SY5Y או HEK293 תאים (2 x 10 ⁶) לתוך 10 ס מ לחלק ואגדל אותם במשך יומיים
2. (אופציונלי) למחרת היום, לשטוף את התאים עם סרום ללא Dulbecco ' s השתנה . נשר מדיה בינוני (DMEM) פעם אחת, דגירה עם סרום DMEM חינם למשך הלילה, אם הטיפול צריך להיעשות בתקשורת חינם סרום.
3. ביום 3, להמיס פפטידים S14G-humanin 0.2 µm מסונן, מים מזוקקים, להשרות אותן כפתרון מניות 1 מ מ.
   הערה: פפטידים צריך להיות מומס הממיס המתאים, אשר יכול להיקבע על ידי מאפייני רצף פפטיד (למשל, תשלום הכולל), ייתכן יינתן על ידי היצרן אם פפטידים זמינים מסחרית. לדוגמה, S14G-humanin, SHLP2, SHLP6, ו MOTS-c מתמוססים במים. Aliquot פפטידים אמצעי אחסון המתאים (למשל, 50 μL) כדי למנוע להקפיא הפשרת מחזורים. ברגע הקרת, אל תשתמש בהם שוב.
4. Aliquot הנסיוב-המכיל ומחוממת מראש או ללא סרום המדיה 50-mL חרוט צינור ולהוסיף פתרון מניות של 1 מ"מ בטמפרטורת החדר להגיע אל ריכוז העבודה (למשל, 1 מיקרומטר, 10 מיקרומטר).
5. להחליף את התקשורת עם פתרון פפטיד 6 מ ל מ שלב 1.4. דגירה התאים עבור משך הזמן המתאים.
   הערה: בחר את זמן הדגירה בהתאם למצבך המפעילה טיפשה.

2. Fractionation subcellular ציטוזול, גרעין

1. לרחוץ את התאים פעמיים עם 10 מ"ל של PBS קר כקרח, לגרד את התאים מהצלחת ב 5 מ של PBS קר כקרח, ולהעביר את המתלים תא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
2. Centrifuge התאים ב 500 g x עבור 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
3. וארוקן את PBS ו מחדש להשעות בגדר ב 200 µL קר כקרח, מאגר fractionation (10 מ מ HEPES pH = 7.6, 3 מ"מ MgCl ₂, 10 מ מ אשלגן כלורי, 5% (v/v) גליצרול, 1% ללא יונית חומרים פעילי שטח (C ₁₃ H ₂₂ O (C ₂ H ₄ O) _n), מעכבי פרוטאז/פוספטאז).
   הערה: כדי לשמור את החלבונים את מעמדם זרחון, החומר המדכא פוספטאז כמו גם פרוטאז מעכב טרי להוסיף דוגמאות יש לשמור על הקרח בכלל פעמים. חוזרים פריזר ואת הפשרה מחזורים של דגימות להימנע. דוגמאות aliquot לתוך כמות קטנה (למשל 50 μg) לפני הקפאת אותם ב-80 מעלות צלזיוס
4. דגירה בגדר תנאי מחדש על קרח למשך 15 דקות, ואז צנטריפוגה ב 250 g x עבור 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
5. לאסוף את תגובת שיקוע כמו השבר cytoplasmic ולשמור את גלולה עבור השבר הגרעין.
6. Centrifuge את תגובת שיקוע כדי להסיר את הלכלוך הסלולר מזהמים אחרים ב 18,000 g x 10 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור microcentrifuge. זהו השבר ציטוזול-
7. Resuspend בגדר במאגר שטיפת קר כקרח 200 μL (10 מ מ HEPES pH = 7.6, 1.5 מ"מ MgCl ₂, 420 מ"מ NaCl, 25% (v/v) גליצרול, EDTA 0.2 מ מ, מעכבי פרוטאז/פוספטאז), צנטריפוגה ב 250 x g עבור 5 דקות ב 4 ° C
8. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר במאגר החילוץ קר כקרח, גרעיני μL 100 (20 מ מ HEPES pH = 7.6, 1.5 מ"מ MgCl ₂, 420 מ"מ NaCl, 25% (v/v) גליצרול, EDTA 0.2 מ מ, מעכבי פרוטאז/פוספטאז) ו sonicate פי 10 (5 s ב, 10 s 30% כח.). על קרח
9. צנטריפוגה ב 18,000 g x 10 דקות ב 4 º C.
10. להעביר את תגובת שיקוע צינור microcentrifuge. זהו השבר הגרעין.
11. Quantify כמות החלבון שימוש assay BCA

3. שבר מיטוכונדריאלי גולמי

1. לרחוץ את התאים בכל צלחת 10 ס מ עם 10 מ"ל של PBS קר כקרח, הוסף 5 מ ל PBS קר כקרח, לנתק את התאים באמצעות המגרד של תא.
   הערה: השתמש שלוש מנות 10 ס מ של תאים כדי להשיג תשואה טובה של המיטוכונדריה המערבי סופג.
2. להעביר התליה תא צינור חרוטי 15 מ"ל, ולשלב מתוך שלוש מנות 10 ס מ לתוך שפופרת אחת של חרוט 15 מ"ל.
3. Centrifuge התאים ב 600 g x 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
4. מחוק לגמרי מגניב והשהה מחדש בגדר ב 1 מ"ל של המיטוכונדריה כקרח בידוד מאגר (10 מ מ טריס-סחבות, 1 מ"מ EGTA/טריס, 200 מ"מ סוכרוז, להתאים את ה-pH = 7.4).
5. Homogenize התאים במשיחות 25 של מהמגן 2 מ עם שהעקב מצופה טפלון על קרח
   הערה: שלב זה הוא קריטי כדי לשמור על שלמות מיטוכונדריאלי ולמקסם את התשואה של השבר מיטוכונדריאלי. צריך להיות מוטבת מספר קווים עבור כל סוג התא. Precool את מהמגן לפני תחילת ההליך.
6. להעביר את homogenate צינור microcentrifuge ו- centrifuge זה ב 600 x g 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר גרעינים ותאים רצופה.
7. לאסוף את תגובת שיקוע, להעביר אותו צינור microcentrifuge ו centrifuge זה ב g 7,000 x 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
   הערה: בגדר משוחרר, לאסוף את תגובת שיקוע בזהירות ולנסות שלא להפריע בגדר.
8. להסיר את תגובת שיקוע מחדש להשעות את גלולה עם 200 μL מאגר בידוד המיטוכונדריה קר כקרח, להעביר את הפתרון צינור microcentrifuge. Centrifuge את הצינור ב 7,000 g x 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
חזור על שלב 3.8 לשטוף בגדר
9. . אין צורך להעביר את תגובת שיקוע צינור microcentrifuge בשלב זה.
10. להסיר את תגובת שיקוע בגדר שטף והשהה מחדש את גלולה המכילה המיטוכונדריה עם 50 μL מאגר ריפה.
11. Incubate התליה על קרח במשך 10 דקות
12. Centrifuge התליה על 16,000 x g למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
13. להעביר את תגובת שיקוע צינור microcentrifuge. זהו השבר מיטוכונדריאלי.
14. לכמת את כמות חלבון באמצעות וזמינותו של BCA-

4. המערבי סופג חלבונים ספציפיים פוספו

1. לבצע על אלקטרופורזה בג'ל מרחביות-לזיהוי (8-16% premade ג'ל) ולהעביר את החלבון ממברנה PVDF ⁴.
2. דגירה הקרום עם 5% BSA ב- TBST (0.1% Polysorbate 20) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לחסום אתרי קישור שאינם ספציפיים רקע.
   הערה: לצורך זיהוי החלבון phosphorylated, לחסום את הקרום עם BSA. חלב. החלב מכיל קזאין, phosphoprotein שופע, כשהתוצאה היא אות לא ספציפית גבוה.
3. דגירה הקרום עם נוגדן ראשוני (anti-פוספו-ERK1/2) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
4. למחרת, לשטוף את הקרום עם TBST (0.1% polysorbate 20) שלוש פעמים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
5. דגירה הקרום עם נוגדנים משניים (אנטי-ארנב HRP) לשעה בטמפרטורת החדר.
6. לרחוץ את הקרום עם TBST (0.1% polysorbate 20) שלוש פעמים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
7. דגירה הקרום עם פתרון ECL ואת התמונה הקרום במנתח התמונה.
8. רצועת הקרום עם בנוכחות אחר מאגר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף הקרום עם TBST שלוש פעמים במשך 5 דק.
9. חזור על השלבים 4.2 ל 4.7 באמצעות הנוגדן ERK1/2 סה כ אנטי-
10. לבדיקת הטוהר של כל שבר, לפעול למען חברה דמוקרטית-דף ולבצע immunoblots באמצעות נוגדנים זיהוי סמנים עבור כל תא (למשל, מיטל B1 עבור גרעין, GAPDH עבור ציטוזול ולאחר TOM20 עבור המיטוכונדריה).

תוצאות

באמצעות ההליך המובאת כאן, התייחסנו תאים HEK293 ו- SH-SY5Y עם 1 μM, 100 μM S14G-humanin, עוצמה humanin אנלוגית²¹, בהתאמה, ב להשלים מדיה עבור פרקי זמן המצוין (איור 1א' ו איור 1 B). אז בדקנו הכולל, phosphorylated בצורת ERK1/2-חמישי²⁰²/Tyr²⁰⁴

Discussion

. הנה, הפגנו כי humanin בתיווך פפטיד ERK1/2 הפעלת מתרחשת בשני סוגי תאים שונים, לוקליזציה subcellular של מופעל ERK1/2 יכולה להיות שונה בהתאם לתנאים (למשל, מנה של פפטיד, נקודת זמן תא סוג). הוכח כי humanin אותות דרך שני קולטנים שונים^22,23, אשר עשוי להסביר את ההבדלים איתות בין הקוו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
p44/42 MAPK (ERK1/2)	Cell signaling	9102	Dilution 1:1,000
phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)	Cell signaling	4370	Dilution 1:1,000
Lamin B1	Cell signaling	12586	Nuclear Marker, Dilution 1:1,000
GAPDH	Cell signaling	5174	Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000
Tom20	Santa cruz	SC-17764	Mitochondria marker, Dilution 1:2,000
anti-Rabbit-HRP conjugated	Cell signaling	7074	Dilution 1:30,000
RIPA Lysis and Extraction Buffer	ThermoFisher SCIENTIFIC	89900
100 mm Culture Dish	ThermoFisher SCIENTIFIC	12556002
HNG peptide	Genescript
25mm sylinge filter	ThermoFisher SCIENTIFIC	09-719A
HEPES	Sigma	H3375
MgCl2	Sigma	M8266
KCl	Sigma	P9333
Glycerol	Sigma	G9012
Triton X-100	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP151-100
EDTA	Sigma	3609
MOPS	Sigma	M1254
EGTA	Sigma	E3889
Sucrose	Sigma	S7903
Tris-base	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP152-1
HCL	Sigma	H1758
PBS	Lonza	17-512F
Cell Scraper	FALCON	353085
Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	ThermoFisher SCIENTIFIC	78440
Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles	Thomas Scientific	3432S90
Tween-20	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP337-500
BSA	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP1600-100
8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	BIO RAD	4561104
Mini Trans-Blot Module	BIO RAD	1658030
Trans-Blot Turbo Transfer System	BIO RAD	1704150
Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit	BIO RAD	1704272
Clarity Western ECL Blotting Substrates	BIO RAD	1705060
Restore Western blot stripping buffer	ThermoFisher SCIENTIFIC	21059
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ThermoFisher SCIENTIFIC	11965-092
Sonicator, Medel: FB120	ThermoFisher SCIENTIFIC	695320-07-12