Fraccionamiento subcelular para la activación de ERK a péptidos derivados de mitocondrial tratamiento

Resumen

Este protocolo describe cómo estimular las células con péptidos derivados de mitocondrial y evaluar la cascada de señalización y localización de fosfo-proteínas.

Resumen

Péptidos de origen mitocondrial (MDPs) son una nueva clase de péptidos que son codificadas por Marcos de lectura abiertos pequeños dentro de otros genes conocidos del genoma mitocondrial. MDPs con una amplia variedad de efectos biológicos tales como proteger a las neuronas de la apoptosis, la mejora de marcadores metabólicos y protegiendo las células de la quimioterapia. Humanin fue el primer MDP por descubrir y es el péptido más estudiado entre la familia MDP. Los receptores de membrana y vías de señalización corriente abajo de humanin se han caracterizado cuidadosamente. MDPs adicionales como MOTS-c y SHLP1-6 han sido descubiertos más recientemente y los mecanismos de señalización tienen todavía ser aclarada. Aquí describimos un método basado en la cultura de célula para determinar la función de estos péptidos. En particular, técnicas de fraccionamiento celular en combinación con western blot permiten la determinación cuantitativa de la activación y translocación de la molécula de señalización importante. Mientras que hay otros métodos de fraccionamiento celular, descrito aquí es un método fácil y sencillo. Estos métodos pueden utilizarse para aclarar más lejos el mecanismo de acción de estos péptidos y otros agentes terapéuticos.

Introducción

Emergentes los estudios demuestran que los péptidos derivados de mitocondrial (MDPs) desempeñan papeles importantes en citoprotección y metabolismo^1,2,3. Comprensión de la vía de transducción de señal en presencia de MDPs nos da información sobre el mecanismo por el cual MDPs modulan varias funciones. El primer identificado MDP, humanin, se ha demostrado para aumentar la quinasa regulada por señal extracelular 1/2 (ERK1/2) fosforilación a través de su receptor binding^4,5. Sin embargo, el efecto aguas abajo de la activación de ERK1/2 es todavía underexplored.

La cascada de ERK1/2 sirve como un mediador esencial en una variedad de procesos celulares como proliferación, migración de la célula, metabolismo celular, supervivencia y apoptosis^6,7,8. Para organizar todos estos distintos procesos celulares, la actividad y la localización subcelular de ERK1/2 están estrictamente regulados por fosfatasas y proteínas andamio^9,10. Además de la modificación poste-de translación, el transporte dinámico de ERK1/2 regula también su señalización función, actividad y especificidad^11,12. ERK1/2 se localiza principalmente en el citosol¹³. Un conjunto de proteínas de anclaje y andamio ayudar a retener ERK1/2 en elementos del citoesqueleto, sobre la superficie de los organelos, o difuso en el citoplasma¹³. Sobre el estímulo, ERK1/2 es fosforilada y se convierte en disociarse de sus proteínas de anclajes, permitiendo la translocación de ERK1/2 en otros compartimientos subcelulares, incluyendo el núcleo, mitocondrias, Golgi y lisosomas^{14, 15 , 16}.

Aunque humanin es conocido por activar la vía de señalización de ERK1/2, la activación de ERK1/2 sólo se observa en los lysates de la célula total. Como se describió anteriormente, ya que la localización subcelular de ERK1/2 desempeña un papel crucial en su efecto aguas abajo, el análisis de la localización subcelular y los niveles totales de ERK1/2 fosforilado es necesario para proporcionar una comprensión global de humanin inducida por activación de ERK1/2 y la activación de objetivos posteriores.

Para entender los organelos objetivo activados ERK1/2, se realizó el fraccionamiento subcelular seguida de western blot para fosforilada ERK1/2. Este método se puede implementar fácilmente ya que utiliza reactivos y equipo normal de laboratorio. Los compartimientos subcelulares aislados son de alta pureza, permitiendo que los resultados de interpretarse directamente. Inmunotinción de ERK1/2 puede producir resultados similares. Sin embargo, ciertos compartimientos subcelulares son relativamente difíciles de visualizar y requieren métodos especiales de fijación y permeabilización. ERK1/2 niveles varían en compartimientos subcelulares, y esta variación podría causar señales falsas positivas y falsas negativas en lisados de células enteras. Por lo tanto, un immunoblot usando compartimientos subcelulares aislados nos da una mejor comprensión de la localización de ERK1/2.

La versatilidad del método permite modificaciones del Protocolo a investigar los efectos de otros estimulantes, incluyendo otros MDPs o translocación de otras moléculas de señalización como STAT3. Recientemente descubiertos pequeños péptidos humanin-como (SHLPs) se codifican de región de rRNA 16S donde humanin está codificada, y tienen propiedades similares pero distintos en comparación con HN¹⁷. Por ejemplo, SHLP2 y SHLP3 activarán ERK1/2 después de 8 h aunque humanin activa ERK1/2 en 5 minutos examen localización subcelular de ERK1/2 en respuesta a péptidos diferentes nos dará una mejor comprensión de la biología de estos péptidos. Nuevas pruebas demostraron que la localización subcelular de las moléculas de señalización juega un papel crucial en sus efectos aguas abajo. Por ejemplo, STAT3 es conocido tradicionalmente a localizarse principalmente en el citosol de las células de reclinación, y luego transloca en el núcleo para activar la expresión génica en respuesta a citoquinas¹⁸. STAT3 también se transloca a la mitocondria y regula el ciclo de TCA y ATP producción¹⁹. Con respecto a la regulación de la autofagia, diferente localización subcelular de STAT3 modula la autofagia en varias maneras²⁰. Por ejemplo, STAT3 nuclear transcripcionalmente regula genes relacionados con la autofagia y actúa como un modulador de la autofagia. STAT3 citoplásmico constitutivamente inhibe la autofagia interactuando con moléculas señalizadoras de autofagia. STAT3 mitocondrial inhibe y previene la mitofagia suprimiendo el estrés oxidativo inducido por autofagia. Por lo tanto, este método de aislamiento del compartimento subcelular es crucial para entender el papel de otras moléculas de señalización así como ERK1/2.

Protocolo

1. tratamiento de péptidos a las células

1. placa 2 millones SH-SY5Y o células HEK293 (2 x 10 ⁶) en 10 cm plato y cultivan durante 2 días
2. (opcional) el siguiente día, lavar las células con el suero Dulbecco ' s modificado Águila media media (DMEM) una vez y se incuba con suero DMEM libre toda la noche si el tratamiento debe hacerse en medios libres de suero.
3. El día 3, disolver humanin S14G péptidos en 0.2 μm filtrada, agua destilada y reconstituir como solución madre de 1mM.
   Nota: Los péptidos deben ser disuelto en el disolvente apropiado, que puede ser determinado por las características de la secuencia del péptido (p. ej., carga general) y puede ser proporcionado por el fabricante si los péptidos están comercialmente disponibles. Por ejemplo, humanin S14G, SHLP2 y SHLP6 y MOTS-c se disuelven en agua. Alícuota los péptidos en un volumen adecuado (por ejemplo, 50 μL) para evitar congelar y descongelar los ciclos. Una vez descongelado, no usarlos otra vez.
4. Alícuota el precalentado del suero que contienen o medio libre de suero en un cónico de 50 mL tubo y temperatura solución stock de 1 mM para convertirla en una concentración del trabajo (p. ej., 1 μm, 10 μm).
5. Reemplazar los medios de comunicación con 6 mL de solución de péptido de paso 1.4. e incube las células por la cantidad de tiempo apropiada.
   Nota: Elija el tiempo de incubación dependiendo de la condición que activa ERK.

2. Fraccionamiento subcelular de citosol y núcleo

1. lavan las células dos veces con 10 mL de PBS helado, raspar las células de la placa en 5 mL de PBS helado y transferir la suspensión de células en un tubo cónico de 15 mL.
2. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a 4 ° C.
3. Aspirar el PBS y resuspender el pellet en 200 μL de tampón de fraccionamiento helada, (pH HEPES 10 mM = 7.6, 3 mM MgCl ₂, 10 mM KCl, 5% (v/v) de glicerol, 1% de tensioactivo no iónico (C ₁₃ H ₂₂ O (C ₂ H ₄ O) _n), inhibidores de la proteasa/fosfatasa).
   Nota: Para mantener las proteínas en su estado de fosforilación, el inhibidor de la fosfatasa como bien como proteasa inhibidor debe añadirse recientemente y las muestras deben conservarse en hielo en todo momento. Repetición de congelación y deshielo deben evitarse los ciclos de las muestras. Muestras alícuotas en pequeña cantidad (por ejemplo 50 μg) antes de congelar a -80 ° C.
4. Incubar el sedimento resuspendido en hielo durante 15 min y luego centrifugar a 250 x g durante 5 min a 4 ° C.
5. Recoger el sobrenadante como la fracción citoplasmática y mantener el sedimento de la fracción nuclear.
6. Centrifugar el sobrenadante para eliminar los residuos celulares y otros contaminantes a 18.000 x g por 10 min a 4 ° C y luego transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga. Se trata de la fracción citosol.
7. Resuspender el precipitado en tampón de lavado helada de 200 μL (pH HEPES 10 mM = 7.6, 1,5 mM de MgCl ₂, 420 mM NaCl, 25% (v/v) de glicerol, 0,2 mM EDTA, inhibidores de la proteasa/fosfatasa) y centrifugar a 250 x g durante 5 min a 4 ° C
8. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en tampón de extracción helada nuclear de 100 μL (pH HEPES 20 mM = 7.6, 1,5 mM de MgCl ₂, 420 mM NaCl, 25% (v/v) de glicerol, 0,2 mM EDTA, inhibidores de la proteasa/fosfatasa) y someter a ultrasonidos 10 veces (5 s a 10 s descuento 30% amp.) en ICE
9. Centrifugar a 18.000 x g por 10 min a 4 ° C.
10. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga. Se trata de la fracción nuclear.
11. Cuantificar la cantidad de proteína usando un análisis BCA

3. fracción mitocondrial cruda

1. Lave las células en cada plato 10 cm con 10 mL de PBS helado, añadir 5 mL PBS helado y separar las células usando un raspador celular.
   Nota: Usar tres platos de 10 cm de las células para obtener un buen rendimiento de mitocondrias para Western Blotting.
2. Transferir la suspensión de células a un tubo cónico de 15 mL y combinar de tres platos de 10 cm en un tubo cónico de 15 ml.
3. Centrifugar las células a 600 x g por 10 min a 4 ° C.
4. Aspirar el PBS y vuelva a suspender el sedimento en 1 mL de tampón de aislamiento de mitocondrias helada (10 mM Tris-MOPS, 1 mM Tris/EGTA, 200 mM de sacarosa, ajustar a pH = 7.4).
5. Homogeneizar las células con 25 golpes de un homogeneizador de 2 mL con Maja recubierto de politetrafluoroetileno en hielo.
   Nota: Este paso es vital para mantener la integridad mitocondrial y maximizar el rendimiento de la fracción mitocondrial. El número de trazos debe ser optimizado para cada tipo de célula. Preenfriar el homogenizador antes de comenzar el proceso.
6. Transferir el homogenizado a un tubo de microcentrífuga y centrifugar a 600 x g por 10 min a 4 ° C para eliminar los núcleos y células intactas.
7. Recoger el sobrenadante, transferir a un tubo nuevo de microcentrífuga y centrifugue a 7.000 x g durante 10 min a 4 ° C.
   Nota: El pellet es flojo, recoger el sobrenadante con cuidado y trate de no perturbar el sedimento.
8. Quite el sobrenadante, Resuspender el pellet con 200 μL de tampón de aislamiento de mitocondrias helada y transferir la solución a un tubo nuevo de microcentrífuga. Centrifugar el tubo a 7.000 x g por 10 min a 4 ° C.
Repita el paso 3.8 para lavar el sedimento
9. . No es necesario transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga en este paso.
10. Retire el sobrenadante de la pelotilla de lavado y vuelva a suspender el sedimento que contiene mitocondrias con 50 μL de tampón RIPA.
11. Incubar la suspensión en hielo durante 10 minutos
12. Centrifugar la suspensión a 16.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
13. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga. Se trata de la fracción mitocondrial.
14. Cuantificar la cantidad de proteína usando un ensayo BCA.

4. Western blot para proteínas fosfo-específicos

1. realizar una electroforesis del gel de SDS-poliacrilamida (8-16% preconfeccionado gel) y la proteína de la transferencia a una membrana PVDF ⁴.
2. Incubar la membrana con 5% de BSA en TBST (0.1% polisorbato 20) por 30 min a temperatura ambiente para bloquear sitios de Unión inespecífica de fondo.
   Nota: Para la detección de la proteína fosforilada, bloquear la membrana con BSA no leche. La leche contiene caseína, una fosfoproteína abundante, que se traduce en señal inespecífica de alta.
3. Incubar la membrana con el anticuerpo primario (anti-fosfo-ERK1/2) a 4 ° C durante la noche.
4. Al día siguiente, lavar la membrana con TBST (0.1% polisorbato 20) tres veces durante 5 min a temperatura ambiente.
5. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario (anti-conejo HRP) por 1 h a temperatura ambiente.
6. Lavar la membrana con TBST (0.1% polisorbato 20) tres veces durante 5 min a temperatura ambiente.
7. Incubar la membrana con solución de ECL y la membrana en el analizador de imagen de la imagen.
8. Tira de la membrana con stripping buffer durante 15 min a temperatura ambiente y lavar la membrana con TBST tres veces durante 5 minutos
9. Repita los pasos del 4.2 al 4.7 usando el anticuerpo de anti-total ERK1/2.
10. Para comprobar la pureza de cada fracción, correr de SDS-PAGE y realizar immunoblots utilizando anticuerpos reconocer marcadores para cada compartimiento (p. ej., Lamin B1 núcleo, GAPDH de citosol y TOM20 de mitocondrias).

Resultados

Utilizando el procedimiento presentado aquí, tratamos las células HEK293 y SH-SY5Y con 1 μM y 100 μM S14G-humanin, un análogo humanin potente²¹, respectivamente, en completar los medios de comunicación durante los períodos de tiempo indicado (figura 1 y figura 1 B). a continuación examinamos la forma fosforilada y total de ERK1/2 en Thr²⁰²/Tyr²⁰⁴

Discusión

Aquí, demostramos que humanin mediada por el péptido de la activación de ERK1/2 se presenta en dos diferentes tipos de células, y la localización subcelular de activados ERK1/2 puede ser diferente dependiendo de las condiciones (p. ej., dosis de péptido, punto del tiempo y de la célula tipo). Se ha demostrado que humanin señales a través de dos diversos receptores^22,23, que puede explicar las diferencias en la señalización entre las dos varied...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
p44/42 MAPK (ERK1/2)	Cell signaling	9102	Dilution 1:1,000
phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)	Cell signaling	4370	Dilution 1:1,000
Lamin B1	Cell signaling	12586	Nuclear Marker, Dilution 1:1,000
GAPDH	Cell signaling	5174	Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000
Tom20	Santa cruz	SC-17764	Mitochondria marker, Dilution 1:2,000
anti-Rabbit-HRP conjugated	Cell signaling	7074	Dilution 1:30,000
RIPA Lysis and Extraction Buffer	ThermoFisher SCIENTIFIC	89900
100 mm Culture Dish	ThermoFisher SCIENTIFIC	12556002
HNG peptide	Genescript
25mm sylinge filter	ThermoFisher SCIENTIFIC	09-719A
HEPES	Sigma	H3375
MgCl2	Sigma	M8266
KCl	Sigma	P9333
Glycerol	Sigma	G9012
Triton X-100	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP151-100
EDTA	Sigma	3609
MOPS	Sigma	M1254
EGTA	Sigma	E3889
Sucrose	Sigma	S7903
Tris-base	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP152-1
HCL	Sigma	H1758
PBS	Lonza	17-512F
Cell Scraper	FALCON	353085
Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	ThermoFisher SCIENTIFIC	78440
Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles	Thomas Scientific	3432S90
Tween-20	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP337-500
BSA	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP1600-100
8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	BIO RAD	4561104
Mini Trans-Blot Module	BIO RAD	1658030
Trans-Blot Turbo Transfer System	BIO RAD	1704150
Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit	BIO RAD	1704272
Clarity Western ECL Blotting Substrates	BIO RAD	1705060
Restore Western blot stripping buffer	ThermoFisher SCIENTIFIC	21059
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ThermoFisher SCIENTIFIC	11965-092
Sonicator, Medel: FB120	ThermoFisher SCIENTIFIC	695320-07-12