미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드 치료 시 ERK 활성화에 대 한 subcellular 분류

요약

이 프로토콜에는 미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드와 세포 신호 캐스케이드 인 단백질의 지 방화를 평가 하는 방법을 설명 합니다.

초록

미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드 (MDPs) 미토 콘 드리 아 게놈의 다른 알려진된 유전자 내의 작은 열려있는 독서 프레임으로 인코딩됩니다 펩 티 드의 새로운 클래스는. MDPs는 apoptosis에서 신경 세포를 보호, 개선 신진 대사 마커, 화학요법에서 세포를 보호 등 생물학적 효과의 다양 한이 있다. Humanin 발견 첫 번째 민주당 고 민주당 가족 중 가장 공부 펩 티 드 이다. 막 수용 체와 humanin의 하류 신호 경로 신중 하 게 특징 되었습니다. 태그 c와 SHLP1-6 등 추가 MDPs 최근에 발견 되었습니다 고 신호 메커니즘 아직 해명 될. 여기이 펩 티이 드의 기능을 결정 하는 셀 문화 기반 방법을 설명 합니다. 특히, 서 부 럽 함께에서 셀 분류 기법 활성화의 양적 결정 및 중요 한 신호 분자의 전 좌 허용. 세포 분별 법의 다른 방법이 있다, 하는 동안 여기에 설명 된 하나 쉽고 간단한 방법입니다. 이러한 방법은 더 명료이 펩 티이 드 및 다른 치료제의 행동의 메커니즘을 사용할 수 있습니다.

서문

신흥 연구는 미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드 (MDPs) cytoprotection 및 대사^1,2,3중요 한 역할을 재생을 보여줍니다. 신호 변환 통로 MDPs의 존재 이해는 MDPs는 다양 한 기능을 조절 하는 메커니즘에 대 한 통찰력 제공. 첫 번째 확인 된 민주당 humanin, extracellular 신호 통제 키 1/2 (ERK1/2)을 증가 표시 되었습니다^4,5바인딩 그것의 수용 체를 통해 인 산화. 그러나, ERK1/2 활성화의 다운스트림 효과 여전히 underexplored.

ERK1/2 캐스케이드 다양 한 확산, 셀 이동, 세포 물질 대사, 생존, 및 apoptosis^6,,78을 포함 하 여 세포질 과정에에서 필수적인 중재자 역할을 합니다. 모든을 통합 하는 것을이 다른 세포질 과정, 활동 및 ERK1/2의 subcellular 지 방화는 단단히 통제 가수분해 및 비 계 단백질^9,10. 포스트 번역 상 수정 뿐 아니라 그것의 신호 기능, 활동, 및 특이성^11,12조절 또한 ERK1/2의 동적 였죠. ERK1/2 주로 cytosol¹³에서 지역화 됩니다. 고정 및 비 계 단백질의 세트, 세포의 표면 또는 세포질¹³확산에 cytoskeletal 요소에 ERK1/2을 유지 도움이. 자극, ERK1/2은 phosphorylated 고 핵, 미토 콘 드리 아, 골, 리소좀^14, 등 다른 subcellular 구획에 ERK1/2의 전 수 있도록 그 정박 단백질에서 해리 된다 ^{15 , 16}.

비록 humanin는 ERK1/2 신호 전달 경로 활성화, ERK1/2의 활성화만 총 세포 lysates에서 관찰 됩니다. ERK1/2 subcellular 지 방화의 다운스트림 효과, 모두 subcellular 지 방화의 분석 및의 총 수준에 중요 한 역할 때문에 이전에 설명한 대로 phosphorylated ERK1/2는 포괄적인 이해를 제공 하는 데 필요한 ERK1/2 활성화 humanin 유도 및 다운스트림 목표의 활성화.

활성화 ERK1/2의 대상 세포를 이해 하려면 뒤에 phosphorylated ERK1/2 서 부 럽 subcellular 분류 수행 되었다. 이 방법은 표준 실험실 장비 및 시 약 사용으로 쉽게 구현할 수 있습니다. 격리 된 subcellular 구획 straightforwardly 해석 결과 허용 하는 고 순도의 있습니다. ERK1/2 Immunostaining의 비슷한 결과 얻을 수 있습니다. 그러나, 특정 subcellular 구획은 상대적으로 시각화 하 고 특별 한 고정 및 permeabilization 방법이 필요로 어렵습니다. ERK1/2 레벨 subcellular 구획에 변화 하 고 전체 세포 lysates 볼 때이 변화 거짓 긍정과 거짓 부정적인 신호를 발생할 수 있습니다. 따라서, 격리 된 subcellular 구획을 사용 하 여 한 immunoblot 우리가 ERK1/2 지역화의 더 나은 이해를 제공 합니다.

방법의 다양성에 다른 MDPs 또는 STAT3 같은 다른 신호 분자의 전 좌를 포함 하 여 다른 자극의 효과 조사 하는 프로토콜의 수정 수 있습니다. 최근 발견 된 작은 humanin와 같은 펩 티 드 (SHLPs) 16S rRNA 지구 humanin 인코딩 및 HN¹⁷에 비해 유사 하지만 개별 속성에서 인코딩됩니다. 예를 들어 SHLP2 및 SHLP3에 8 h humanin 검토 다른 펩 티 드에 대 한 응답에서 ERK1/2의 subcellular 지 방화 5 분 이내 ERK1/2를 활성화 하는 있지만 우리가 줄 것 이다 이러한 펩 티이 드의 생물학의 더 나은 이해 후 ERK1/2를 활성화 해야 합니다. 증거를 신흥 신호 분자의 subcellular 지 방화의 다운스트림 효과에 중요 한 역할을 담당 했다. 예를 들어, STAT3 전통적으로 주로 휴식 셀에 cytosol에서 지역화는 알려져 있으며 다음 응답 cytokines¹⁸으로 유전자 발현을 활성화 하는 핵으로 translocates. 또한 STAT3 미토 콘 드리 아를 translocates 하 고 TCA 주기 및 ATP 생산¹⁹. Autophagy 규제에 관한 STAT3의 다른 subcellular 지 방화 다양 한 방법으로²⁰에서 autophagy를 조절 한다. 예를 들어 핵 STAT3 transcriptionally autophagy 관련 유전자를 조절 하 고 autophagy 변조기 역할. 세포질 STAT3 constitutively autophagy 신호 분자와 상호 작용 하 여 autophagy를 억제. 미토 콘 드 리아 STAT3 억제 하 고 산화 스트레스 유발 autophagy를 억제 하 여 mitophagy를 방지 합니다. 따라서,이 subcellular 구획 격리 방법은 다른 신호 분자로 ERK1/2의 역할을 이해 하기 위한 중요 한입니다.

프로토콜

1. 셀에 펩 티 드 치료

1. 2 백만 SH-SY5Y 접시 또는 10 cm로 HEK293 세포 (2 x 10 ⁶) 요리와 2 일 동안 그들을 성장
2. (선택 사항) 다음 날, 셀 세럼 무료 Dulbecco 씻어 ' s 수정 매체 (DMEM) 미디어를 한 번 독수리 및 혈 청 치료 혈 청 무료 미디어에서 일을 해야 하는 경우 무료 DMEM 하룻밤 함께 품 어.
3. 3 일에 0.2 µ m 필터링, 증류수, 고 1 m m 재고 솔루션으로 그들을 다시 구성에서 S14G humanin 펩 티 드를 분해.
   참고:는 펩 티 드 (예를 들어, 전체 충전) 펩 티 드의 시퀀스 특성에 의해 결정 될 수 있다 고는 펩 티 드 상업적으로 사용할 수 있는 경우는 제조 업체에 의해 제공 될 수 있습니다 적절 한 용 매에 녹아 해야 합니다. 예를 들어, S14G humanin, SHLP6, SHLP2, 및 태그 c 물에 용 해. Aliquot 동결을 방지 하 고 주기를 해빙 하는 적절 한 볼륨 (예를 들어, 50 μ)에서 펩 티 드. 일단 해 동, 사용 하지 않는 다시.
4. 미리 데워 진 혈 청 포함 약 수 또는 혈 청-무료 미디어 50 ml 원뿔 튜브 및 실내 온도 1 m m 재고 솔루션 작업 농도 (예를 들어, 1 µ M, 10 μ M)에 그것을 만들기 위해 추가.
5. 6 mL 펩 티 드 솔루션 단계 1.4에서에서 미디어 바꿉니다. 시간의 적절 한 금액에 대 한 셀을 품 어 고.
   참고: 선택 ERK 활성화 상태에 따라 보육 시간.

2. Cytosol와 핵 subcellular 분별

1. 얼음 처럼 차가운 PBS의 10 mL로 두 번 셀을 씻고, 얼음 처럼 차가운 PBS의 5 ml에서 접시에서 셀 긁 고 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.
2. 4에서 5 분 동안 500 x g에서 세포를 원심 ° c.
3. PBS를 발음 하 고 다시 얼음 처럼 차가운, 분별 버퍼의 200 µ L에 펠 릿을 일시 중단 (10 mM HEPES pH 7.6, 3 m m MgCl ₂, 10 m m KCl, 5% (v/v) 글리세롤 1% 비 이온 계면 활성 제 (C ₁₃ H ₂₂ O (C ₂ H ₄ O) = _n), 효소/인산 가수분해 효소 억제제).
   참고: 유지 하기 위해 단백질의 인 산화 상태에, 인산 가수분해 효소 억제 물 뿐만 아니라 프로 테아 제 억제 물 갓 추가 되어야 하 고 샘플 지켜져야 한다 얼음에 모든 시간. 동결과 해 동을 반복 샘플의 주기를 피해 야 한다. -80에 그들을 동결 하기 전에 작은 금액 (예: 50 μ g)으로 aliquot 샘플 ° c.
4. 다음 4에 5 분 동안 250 x g에서 원심 고 15 분 동안 얼음에 다시 일시 중단 된 펠 릿을 품 어 ° c.
5. 세포질 분수 상쾌한 수집 하 고 핵 부분을 위해 펠 릿을 유지.
6. 원심 18000 x g 4 ° C에서 10 분 동안에 다른 오염 물질과 세포 파편을 제거 하 고 새로운 microcentrifuge 튜브에는 상쾌한 전송에 상쾌한. 이것은 cytosol 분수.
7. 200 μ 차가운 워시 버퍼에 펠 릿을 resuspend (10 mM HEPES pH 7.6, 1.5 m m MgCl ₂, 420 mM NaCl, 25% (v/v) 글리세롤, 0.2 m m EDTA, 효소/인산 가수분해 효소 저 해제 =) 및 4 ° C에서 5 분 동안 250 x g에서 원심 분리기
8. 는 상쾌한 제거 및 100 μ 얼음 처럼 차가운, 핵 추출 버퍼에 펠 릿을 resuspend (20 mM HEPES pH 7.6, 1.5 m m MgCl ₂, 420 mM NaCl, 25% (v/v) 글리세롤, 0.2 m m EDTA, 효소/인산 가수분해 효소 억제제 =)와 10 번을 sonicate (5 초, 10 s , 30% 앰프.) 얼음에
9. 4 ° c.에서 10 분에 대 한 18000 x g에서 원심 분리기
10. 새로운 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송. 이것은 핵 분수.
11. 계량 BCA 분석 결과 사용 하 여 단백질 금액

3. 원유 미토 콘 드 리아 분수

1. 얼음 처럼 차가운 PBS의 10 mL와 함께 각 10 cm 접시에 셀을 씻어 5 mL의 얼음 처럼 차가운 PBS, 추가 하 고 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀을 분리.
   참고: 서 럽에 대 한 미토 콘 드리 아의 좋은 수확량을 셀의 3 10 cm 요리 사용.
2. 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 한 15 ml 원뿔 튜브에 세 10 cm 요리에서 모든 결합.
3. 4 시 10 분 600 x g에서 세포를 원심 ° c.
4. PBS를 발음 하 고 다시 얼음 처럼 차가운 미토 콘 드리 아 절연 버퍼의 1 mL에 펠 릿을 일시 중지 (10 mM Tris MOPS, pH를 조정 하는 1mm EGTA/트리 스, 자당, 200mm = 7.4).
5. 얼음에 소계 코팅된 유 봉과 2 mL 균질 화기의 25 선 셀 균질
   참고:이 단계는 미토 콘 드 리아 무결성을 유지 하 고 미토 콘 드리 아 분수의 수익률을 극대화 하는 중요 한. 획 수는 각 세포 유형에 최적화 되어야 합니다. 절차를 시작 하기 전에 균질 화기를 쿨.
6. Microcentrifuge 튜브에는 homogenate를 전송 하 고 핵 및 손상 되지 않은 세포 제거 하 4 ° C에서 10 분 600 x g에서 원심.
7. 는 상쾌한 수집 하 고 새로운 microcentrifuge 관에 그것을 전송 하 고, 4에서 10 분 동안 7000 x g에서 원심 ° c.
   참고: 펠 릿은 느슨한 관리와 함께 상쾌한을 수집 하 고는 펠 렛을 방해 하지 않으려고.
8. 는 상쾌한을 제거, 다시 차가운 미토 콘 드리 아 절연 버퍼의 200 μ와 펠 릿을 일시 중단 하 고 새로운 microcentrifuge 튜브에 솔루션을 전송. 4에서 10 분 동안 7000 x g에서 튜브를 원심 ° c.
9. 반복 단계 3.8 펠 릿을 세척입니다. 이 단계에서 새로운 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송할 필요는 없습니다.
10. 는 상쾌한 씻어 펠 릿에서 제거 하 고 다시 RIPA 버퍼의 50 μ와 미토 콘 드리 아를 포함 하는 펠 릿을 일시 중지.
11. 품 10 분에 대 한 얼음에 서 스 펜 션
12. 4에서 16000 x g 15 분 동안에 현 탁 액을 원심 ° c.
13. 새로운 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송. 이것은 미토 콘 드리 아 분수.
14. BCA 분석 결과 사용 하 여 단백질 양을 계량.

4. 인 특정 단백질을 위한 서쪽 Blotting

1. 는 SDS polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (8-16% 들어찬 젤)를 수행 하 고 전송 단백질 PVDF 막 ⁴.
2. TBST에 5 %BSA 막 품 어 (0.1% 폴 20) 배경 비 특정 바인딩 사이트 차단에 실 온에서 30 분.
   참고: phosphorylated 단백질 검출을 위한 BSA 하지 우유와 막을 차단 합니다. 우유 카 세 인, 높은 일반적인 신호는 풍부한 phosphoprotein 포함.
3. 하룻밤 4 ° C에서 1 차 항 체 (안티-인-ERK1/2)와 막 품 어.
4. 다음 날 씻어 TBST 가진 멤브레인 (0.1% 폴 20) 세 번 실 온에서 5 분.
5. 품 어 실 온에서 1 h에 대 한 이차 항 체 (항 토끼 HRP)와 막.
6. TBST 가진 막 세척 (0.1% 폴 20) 세 번 실 온에서 5 분.
7. ECL 솔루션 막 품 어 및 이미지 분석기에서 막 이미지.
8. 스트립 스트립 실내 온도 및 세척 5 분에 대 한 세 번 TBST 가진 막에 15 분에 대 한 버퍼와 막
9. 4.2-4.7 안티 총 ERK1/2 항 체를 사용 하 여 단계를 반복.
10. 각 분수의 순도 확인, SDS 페이지를 실행 하 고 immunoblots (예: 핵, 미토 콘 드리 아에 대 한 TOM20 및 GAPDH cytosol에 대 한 대 한 Lamin B1) 각 구획에 대 한 마커를 인식 하는 항 체를 사용 하 여 수행.

결과

여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 우리 1 μ M와 100 μ M HEK293와 SH SY5Y 셀 치료 S14G-humanin, 강력한 humanin 아날로그²¹, 각각, 완료 미디어 (그림 1 및 그림 1 지정 된 기간에 대 한 B). 우리는 다음 세²⁰²총 단백질 추출 물에서 /Tyr²⁰⁴ 에서 ERK1/2의 총 및 phosphorylated 형태 검사. S14G...

토론

여기, 우리가 보여주는 두 가지 서로 다른 세포 유형, 발생 하는 humanin 펩 티 드-중재 ERK1/2 활성화 및 활성화 ERK1/2의 subcellular 지 방화 (예를 들면, 펩 티 드, 시간 및 셀의 조건에 따라 다를 수 있습니다. 입력) 합니다. 그것은 보였다 그 humanin 두 개의 다른 수용 체^22,23, humanin의 다른 복용량에 대 한 요구 사항 뿐 아니라 두 셀 라인 신호에 차이점을 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
p44/42 MAPK (ERK1/2)	Cell signaling	9102	Dilution 1:1,000
phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)	Cell signaling	4370	Dilution 1:1,000
Lamin B1	Cell signaling	12586	Nuclear Marker, Dilution 1:1,000
GAPDH	Cell signaling	5174	Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000
Tom20	Santa cruz	SC-17764	Mitochondria marker, Dilution 1:2,000
anti-Rabbit-HRP conjugated	Cell signaling	7074	Dilution 1:30,000
RIPA Lysis and Extraction Buffer	ThermoFisher SCIENTIFIC	89900
100 mm Culture Dish	ThermoFisher SCIENTIFIC	12556002
HNG peptide	Genescript
25mm sylinge filter	ThermoFisher SCIENTIFIC	09-719A
HEPES	Sigma	H3375
MgCl2	Sigma	M8266
KCl	Sigma	P9333
Glycerol	Sigma	G9012
Triton X-100	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP151-100
EDTA	Sigma	3609
MOPS	Sigma	M1254
EGTA	Sigma	E3889
Sucrose	Sigma	S7903
Tris-base	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP152-1
HCL	Sigma	H1758
PBS	Lonza	17-512F
Cell Scraper	FALCON	353085
Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	ThermoFisher SCIENTIFIC	78440
Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles	Thomas Scientific	3432S90
Tween-20	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP337-500
BSA	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP1600-100
8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	BIO RAD	4561104
Mini Trans-Blot Module	BIO RAD	1658030
Trans-Blot Turbo Transfer System	BIO RAD	1704150
Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit	BIO RAD	1704272
Clarity Western ECL Blotting Substrates	BIO RAD	1705060
Restore Western blot stripping buffer	ThermoFisher SCIENTIFIC	21059
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ThermoFisher SCIENTIFIC	11965-092
Sonicator, Medel: FB120	ThermoFisher SCIENTIFIC	695320-07-12