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摘要

提出了一种用于线粒体钙吸收的钌抑制剂的合成、纯化和表征的协议。本文介绍了一种评价其在化哺乳动物细胞中的有效性的方法。

摘要

我们详细介绍了线粒体钙吸收抑制剂的合成和纯化, [(oh2) (nh3)4汝 (µ) ru (新罕布什尔州3)4(OH2)5 +。这种化合物的优化合成开始从 [Ru (NH3)5cl] cl2在 1 M NH4OH 在一个封闭的容器, 产生一个绿色的解决方案。纯化是用阳离子交换色谱法完成的。这种化合物的特点和验证是纯紫外-可见光和红外光谱。荧光光谱法对化 HeLa 细胞线粒体钙摄取抑制特性进行了评价。

引言

线粒体钙是对正常细胞功能, 包括能量生产和细胞凋亡至关重要的一些过程的关键调节器。1,2,3线粒体钙 uniporter (MCU), 一种离子转运蛋白, 驻留在线粒体膜上, 调节钙离子流入线粒体。4,5,6单片机的化学抑制剂是继续努力研究这种转运蛋白和线粒体钙的功能和细胞作用的宝贵工具。化合物 [(小贩2) (nh3)4ru (µ) 汝 (nh3)4(o2CH)3 +, Ru360, 是唯一已知的单片机的选择性抑制剂之一, 其报告的 Kd值为24µM.7 ,8,9,10此复合物是在钌红色 (RuRed) 的商业配方中发现的常见杂质, triruthenium µ-羰基桥接 hexacation 的公式 [(NH3)5ru (µ) 汝 (nh3)4(µ) ru (nh3)5)6 +, 这也被用作钙吸收抑制剂。虽然 Ru360 是商用的, 但成本很高。此外, Ru360 的合成和分离受到困难的纯化程序和模糊的表征方法的挑战。

我们最近报告的替代程序访问一个 Ru360 模拟, [(OH2) (nh3)4汝 (µ) ru (新罕布什尔州3)4(oh2)] Cl5。11此复合抑制具有高亲和力的 MCU, 类似于 Ru360。在本协议中, 我们将描述这一化合物的最有效的合成, 它从 [Ru (NH3)5cl] cl2开始。使用强酸性阳离子交换树脂提纯产品, 并对此程序的常见缺陷进行了详细介绍。我们还提出了表征和评估化合物纯度的方法, 并描述了一个简单的方法来测试它的有效性, 阻断线粒体钙摄取。

研究方案

注意: 在这种合成中使用浓酸和碱。在执行反应时使用所有适当的安全措施, 包括使用工程控制 (油烟罩) 和个人防护用品 (PPE), 包括安全眼镜、手套、实验室大衣、全长长裤和闭脚趾鞋.

1. 准备 [(哦 2 ) (NH 3 ) 4 Ru (& #181;-O) 汝 (nh 3 ) 4 (OH 2 )] cl 5

  1. 合成 [ru (nh 3 ) 5 cl] cl 2 12
    1. 溶解1.00 克 RuCl 3 和 #183; n h 2 O (按重量 40% Ru, 4.1 摩尔) 在 5 mL h 2 o 将深褐色溶液冷却到0和 #176; C 在冰浴中。以滴的方式添加11毫升 (0.23 摩尔) 的80% 水合肼溶液。最初的反应将与演化气体一起剧烈, 导致棕色溶液。使所得到的溶液在室温下搅拌16小时;最终的解决方案将是深红色的.
      注意: 肼具有剧毒和致癌性。此外, 这种试剂的无水形式是爆炸性的。与往常一样, 使用适当的 PPE 和通风罩时处理。不要将这些解决方案集中于干燥.
    2. 对此解决方案, 添加约5-10 毫升的浓缩 HCl, 以调整 pH 值为2。在这一点上, 解决方案将是黄褐色的颜色.
    3. 将此解决方案加热到105和 #176; 搅拌1-2 小时黄色固体会沉淀出溶液。当没有更多的沉淀明显的形式, 消除热量.
    4. 允许反应混合物冷却到室温, 然后放置在0和 #176; C 冰浴10分钟. 通过真空过滤, 用5毫升乙醇和乙醚洗涤, 收集黄色固体.
    5. 完全溶解在15-25 毫升热水中的原油产品。将浓缩的 HCl 溶液放在冰浴中冷却10毫升。将黄色溶液过滤到冷却的 HCl 溶液中, 以诱发一个淡黄色纯固体的沉淀。过滤这沉淀物和洗涤以5毫升每 0.5 M HCl, 乙醇并且乙醚.
    6. 用红外光谱表征化合物。通过在3226厘米 -1 、1604 cm -1 、1297 cm -1 和 801 cm -1 的拉伸频率标识来验证纯度。2069 cm -1 的常见次要杂质被分配给 [Ru (NH 3 ) 5 N 2 ] Cl 3 。
  2. 合成 [(哦 2 ) (NH 3 ) 4 Ru (和 #181;-O) 汝 (nh 3 ) 4 (OH 2 )] Cl 5
      溶解100毫克 (0.34 摩尔) [ru (nh
    1. 3 ) 5 cl]Cl 2 在50毫升的1米 NH 4 OH 在200毫升重壁圆形底压力容器。用塞子将烧瓶松散地盖上, 将反应混合物加热75和 #176; C 为 6 h. 从热中取出, 室温下搅拌4天, 产生深绿色溶液.
      谨慎!加热密封容器会导致压力积聚。确保使用适当的压力安全玻璃器皿。对于这个反应, 密封容器的目的是尽量减少气体 NH 的损失 3 。因此, 将塞子松散地放置, 以释放多余的压力.
  3. 通过阳离子交换色谱
      在25毫升烧杯中进行纯化, 悬浮 5 g 阳离子交换树脂 (例如, 阳离子交换树脂 50WX2 200-400 目 (H
    1. + 窗体) 在10毫升 0.1 M HCl 中.
    2. 将此浆料装入一个10毫升的柱子 (10 毫米直径, 15 厘米高) 贴附50毫升溶剂油藏。用大约20-30 毫升的0.1 米 HCl 清洗树脂, 直到洗无色.
    3. 返回到步骤1.2.1 中隔离的绿色反应解决方案。在此解决方案中, 添加浓缩 HCl 以调整 pH 值至 2, 此时溶液颜色会变为褐色.
    4. 将此酸化溶液加载到1.3.2 中的阳离子交换树脂柱上, 轻轻移在树脂上。让洗完全耗尽, 并继续加载解决方案。重复此过程, 直到添加了整个解决方案。树脂的顶端将是深褐色/黑色。树脂的体积会略有减少.
    5. 使用玻璃珠覆盖树脂的顶部。在添加新的解决方案时, 这些将防止树脂受到干扰.
    6. 洗为20毫升的1米 HCl 的列.
    7. 洗增加 HCl 浓度1.5 米 (和 #8776; 50 毫升) 的列。一个黄色的解决方案将开始从列中脱落。将 HCl 浓度提高到2米, 然后继续洗脱, 直到洗无色或呈淡绿色黄色。这个过程将需要150-200 毫升的总容量.
    8. 将 HCl 浓度提高到2.5 米 (20-50 毫升)。在试管中收集洗作为分数。增加到 3 M HCl。该产品将洗从该专栏作为一个绿色棕色的解决方案。红棕色的分数也可能会从柱子上脱落。由于这些分数是氧化钌红色杂质, 不池与绿色棕色的分数.
  4. 的特性和验证 [(OH 2 ) (NH 3 ) 4 汝 (和 #181;-O) 汝 (NH 3 ) 4 (OH 2 )] "Cl 5
    1. 测试所有分数步1.3。8紫外可见光谱学。为了完成这项任务, 添加100和 #181; 将给定分数的 L 升为2毫升的3米 NH3, 并通过紫外可见光谱进行分析。含有纯产品的分数将有一个大的吸光度带在 360 nm 和较低的强烈吸光度在 600 nm。480或 533 nm 的吸光度分别指示氧化钌红和钌红色杂质.
    2. 包含纯产品的池馏分, 并通过旋转蒸发将溶液蒸发干燥。该产品将作为一个绿色棕色固体隔离。产量通常在5-15 毫克 (10-20% 收益率) 的顺序。单晶体, 适用于 X 射线衍射, 可以获得的水蒸气扩散的乙醇水溶液的化合物.
    3. 为了验证纯度, 在 pH 值为7.4 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶液中通过紫外-可见光谱分析化合物。纯度可以通过采取 360 nm 和 600 nm 峰的强度比值来评估。这个比率是31为一个纯净的化合物。对于不纯化合物, 比例将会更小.
    4. 用红外光谱法对 solid-state 样品进行分析。诊断带是在 3234 cm -1 , 3151 cm -1 , 1618 cm -1 , 1313 cm -1 , 和 815 cm -1 。常见的杂质带见于 1762 cm -1 和 1400 cm -1 , NH 4 Cl. 钌红的特征可以通过带在 1404 cm -1 、1300 cm -1 、1037 cm -1 和 800 cm -1 中标识.
  5. 荧光光谱法评价线粒体钙的摄取抑制 警告!以下过程使用哺乳动物细胞。工作应在适当的层流罩, 是认证的生物安全等级 2 (BSL2) 研究.
    #8203; 注意: [(哦 2 ) (NH 3 ) 4 Ru (#181;-O) 汝 (NH 3 ) 4 (OH 2 )] Cl 5 将被称为 [Ru] 在本节
    1. 中使缓冲含葡萄糖的盐水溶液 (BGSS) 作为化验介质。BGSS 是一个解决方案, 包括110毫米氯化钾, 1 mm 2 PO 4 , 1 毫米氯化镁 2 , 20 毫米 4-(2-羟基乙基)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES), 5 毫米琥珀酸钠, 30 和 #181; M 乙二醇双 (和 #946; 乙氨基醚)- n, n, n 和 #39;, n 和 #39; -乙酸酸 (EGTA)。除了 EGTA, 将 pH 值调整到7.4。添加 EGTA 并调整 pH 值至7.4。50毫升的测定培养基中添加0.5 毫升的1毫克/毫升葡萄糖.
    2. 500 cm 中的培养 HeLa 细胞 2 Dulbecco 和 #39 的改良鹰培养基 (DMEM) 和10% 胎牛血清 (FBS) 在湿式恒温箱中, 5% CO 2 37 和 #176; c. 通过播种增强 100 mm Petri 皿中生长的 hela 细胞他们在 500 cm 2 培养皿。大盘中的总介质量为115毫升。每个大盘子将产生大约1800万细胞, 足够的两个荧光光谱实验。
      1. 将单元格增长到 90-95% 70-100。取出培养基, 用15毫升 pH 7.4 PBS 冲洗细胞。在 PBS 中加入15毫升的1毫米乙酸酸 (EDTA), 孵育10分钟以分离细胞。将电池转移到14毫升圆底猎鹰管
    3. 使用台盼蓝和例的计数单元, 并用倒置显微镜计算每1.8 毫升容量达到750万细胞所需的细胞总数和培养基数量 中等。将细胞离心10分钟, 在5310和 #215; 醒酒上清液, 加入 BGSS 的计算量。重细胞轻轻。
      1. 用于此检测, 准备40毫米 digitonin 在二甲基亚砜 (亚砜), 1 毫米钙 Green-5N 在 h 2 o 和10毫米 CaCl 2 在 h 2 o 中的库存解决方案. [汝] 库存解决方案, 在纯净水中, 可以从1-3 毫米不等。 #8203; 注意: Green-5N 钙是光敏的。存储在黑暗中, 尽量减少曝光.
    4. 设置 fluorimeter 以在 506 nm 处激发, 并在 532 nm 上读取试管控制在37和 #176 上的发射器; c. 用搅拌棒或轮子制作丙烯酸试管, 1.8 mL 细胞悬浮1.5.2 以上, 1.8 和 #181; L digitonin 解决方案, 3。6#181;l 钙 Green-5N (溶液), 9 和 #181; l [汝] (1 毫米的股票溶液, 5 和 #181; M 最终浓度)。在 fluorimeter 孵育细胞15分钟。
      1. 将数据读取为激发/发射比而不是原始吸收。这种做法最大限度地减少了与光源强度波动相关的误差.
      2. 在没有 [Ru] 的情况下执行第一个样本分析, 以测量在单元格的响应中添加 CaCl 2 的效果.
      3. 使用1.5.4 中描述的设置开始分析 fluorimeter。等待约2分钟建立一个稳定的排放基线, 然后添加1.8 和 #181; L CaCl 2 (10 和 #181; M 最后的浓度)。在加入 CaCl 2 后, 发射强度会立即增加, 然后随着钙离子进入线粒体而在几分钟内衰变。等到衰变结束 (#8776; 5 分钟)。添加额外的钙 boluses, 以确定不处理的细胞线粒体钙吸收反应 [Ru].
    5. 在包含5和 #181 的另一个试管中; M [Ru], 重复上述1.5.4.3 中所述的实验。在抑制剂的存在下, 排放强度会增加, 但不会衰减。这种观察意味着阻断线粒体钙的摄取.

结果

该方法描述了线粒体钙吸收抑制剂的合成 [(OH2) (nh3)4汝 (µ O) ru (nh3)4(OH2)] cl5从 [Ru (NH3)5cl] cl2开始, 一众所周知的钌 (III) 起动材料。[Ru (NH3)5Cl]Cl2的特征是红外光谱, 具有 3200 cm-1、1608 cm-1、1298 cm-1和 798 cm-1 (图 1) 的...

讨论

线粒体钙吸收抑制剂 [(OH2) (nh3)4汝 (µ O) ru (nh3)4(OH2)] cl5可以从 [Ru (NH3)5cl] cl2中合成众所周知的钌 (III)起始材料, 如本程序所述。合成的 [Ru (NH3)5cl] cl2很容易实现, 但难度很小。在水合肼中搅拌 RuCl3 16 小时后, 溶液的 pH 值应调整为2与 HCl 的数值。pH 值下降是实现所需产品的关键。如果?...

披露声明

作者没有透露

致谢

这项研究得到了康奈尔大学的支持。这项工作利用康奈尔材料研究中心的共享设施, 这是支持通过 NSF MRSEC 计划 (赠款 DMR-1120296)。S.R.N. 承认, 支持由 NSF 研究生研究奖学金 (赠款 DGE-1650441) 和 Dr. 戴夫 Holowka 协助钙实验。在这一材料中发表的任何意见、发现、结论或建议都是作者的观点, 不一定反映国家科学基金会的观点。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Ruthenium Trichloride hydratePressure Chemical3750
Concentrated hydrochloric acidJ.T. Baker9535
Concentrated ammonium hydroxideMallinckrodt Chemical WorksA669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 MeshAlfa Aesar13945
Calcium Green 5NInvitrogenC3737
DigitoninAldrich260746
DMSOAldrich471267
EGTAAldrichE3889
KClUSB20598
KH2PO4AldrichP3786
MgCl2Fisher ScientificM33-500
HEPESFluka54466
Sodium SuccinateAlfa Aesar33386
EDTAJ.T. Baker8993-01
GlucoseAldrichG5000
200 Round bottom flaskChemGlassCG-1506-14
Glass stopperChemGlassCG-3000-05
10 mm x 15 cm glass column with reservoirsCustom - similar to Chemglass columnsSimilar to CG-1203-20
DMEMCorning10-017-CV
FBSGibco10437028
PBSCorning21-040-CV
Round bottom Falcon tubesFisher Scientific14-959-11B 
500 cm2 petri dishesCorning431110
Trypan blueThermoFisher Scientific15250061
HemacytometerAldrichZ359629
Acrylic CuvettesVWR 58017-875
UV-Vis spectrometerAgilent Model Cary 8454 
SpectrofluorimeterSLM Model 8100C
IR spectrometerBruker Hyprion FTIR with ATR attachment
CentrifugeALC Model PM140R
Inverted light microscopeVWR 89404-462

参考文献

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