ルテニウムによるミトコンドリアのカルシウム吸収阻害剤の合成と評価

要約

合成・精製・ ミトコンドリアのカルシウム吸収のルテニウム系阻害剤の特性のためのプロトコルが表示されます。グリセリンの哺乳類細胞に対する有効性を評価するための手順が示されています。

要約

我々 は、合成、精製、ミトコンドリアのカルシウム吸収阻害剤 [(OH₂) (NH₃)₄とらぶる (μ-O) (NH₃)₄(OH₂)]^{5 +}を詳しく説明します。この化合物の最適化された合成開始 [Ru (NH₃)₅Cl] Cl₂から 1 M で NH₄密閉容器、緑のソリューションを降伏ああ。陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製が行われます。この化合物は特徴あり紫外可視・赤外分光によって純粋に確認します。蛍光分光法によるグリセリンの HeLa 細胞におけるミトコンドリアのカルシウム吸収抑制プロパティを検索します。

概要

ミトコンドリアのカルシウムは、エネルギー生産、アポトーシスなどの正常な細胞機能に不可欠なプロセスの数の重要な調節因子です。^1,2,3ミトコンドリアのカルシウム単一輸送体 (MCU) 内のミトコンドリア膜に存在するイオン運送者蛋白質はミトコンドリアにカルシウム イオンの流入を調節します。^4,5,6 MCU の化学阻害剤は、継続関数、この輸送蛋白質とミトコンドリアのカルシウムの細胞の役割を研究するための貴重なツールです。化合物 [(HCO₂) (NH₃)₄とらぶる (μ-O) (NH₃)₄(O₂CH)]^{3 +}Ru360、^{7 は、24 μ M の報告 K_d値と MCU の唯一知られている選択的阻害剤の一つです。 ,8,9,10}この複合体は一般的な不純物の商業配合ルテニウム赤 (RuRed) ドデカカルボニル ジ-μ-オキソ架橋式 [(NH₃) の hexacation₅Ru (μ-O) Ru (NH₃)₄(μ-O) Ru (NH₃)₅)]^{6 +}、カルシウム吸収の阻害剤としても使用されています。Ru360 は、市販されている、非常に高価です。また、困難な浄化手順やあいまいな評価方法で合成と Ru360 の分離に挑戦します。

我々 は最近、Ru360 アナログ、[(OH₂) (NH₃)₄とらぶる (μ-O) (NH₃)₄(OH₂)] Cl₅にアクセスする代替手段を報告しています。¹¹この化合物は、親和性の高い、Ru360 のように MCU を阻害します。このプロトコルでは、[Ru (NH₃)₅Cl] Cl₂から開始の化合物は、私たちの最も効果的な合成を説明します。この手順の一般的な落とし穴と、強酸性陽イオン交換樹脂を用いた製品の精製の詳細です。また特性と化合物の純度の評価の手法を提示し、ミトコンドリアのカルシウム吸収をブロックでその有効性をテストするための単純なアプローチの輪郭を描きます。

プロトコル

注: 集中された酸と塩基が用いられる。工学的制御 (ドラフト)、安全眼鏡、手袋、白衣、フルの長さのズボン、閉じてつま先の靴を含む個人保護用具 (PPE) の使用を含む反応を実行するときに、すべての適切な安全対策を使用します

。

1 ですの準備 [(OH ₂) (NH ₃) ₄ Ru (μ-O) Ru (NH ₃) ₄ (OH ₂)] Cl ₅

[Ru (NH ₃) ₅ Cl] Cl

1. 合成。₂ ¹²
   RuCl ₃ · n H ₂ O の
   1. 溶解 1.00 g (40% 重量 Ru、4.1 モル) H ₂ o. クール氷浴で 0 の ° C に暗い茶色ソリューション 5 ml。滴状に 80% ヒドラジン水和物溶液 11 mL (0.23 mol) を追加します。最初の反応は積極的な茶色のソリューションで、その結果、進化ガスになります。得られた溶液; 16 時間室温で攪拌ができます。最終的な解決策は、暗い赤になります
      注意: ヒドラジンは鋭く有毒で発がん性です。また、この試薬の無水形態が爆発です。いつものように、処理するときは、適切な PPE とヒューム フードを使用します。乾燥するこれらのソリューションを集中しないでください
   。
   2. このソリューションに 2 pH 調整に濃塩酸の約 5-10 mL を追加。この時点で、ソリューションは、黄褐色になります色で
   。
   3. 熱の 1-2 時間攪拌しながら 105 ° C でこのソリューション。黄色の固体が析出します。多くの沈殿物無しに見えてフォーム、暑さから削除します
   。
   4. エタノールとジエチル エーテルの室温に冷却し、0 ° C の氷浴 10 分収集吸引ろ過及び 5 mL で洗浄で黄色の固体のために反応混合物を許可します
   。
   5. は、15-25 mL のお湯に粗製品を完全に溶解します。氷浴に置くことでフィルターのフラスコの中の濃塩酸溶液の 10 mL を冷やします。淡い黄色の純粋な固体の析出を誘発するチルドの塩酸水溶液に黄色の溶液をフィルターします。この沈殿物をフィルター処理し、0.5 M 塩酸、エタノールとエーテルのそれぞれ 5 mL で洗うです
   。
   6. 特性の複合使用して IR の分光学。3226 cm ^-1、1604 cm ^-1、1297 cm ^-1 に、801 cm ^-1 にストレッチ頻度の同定、純度を確認します。2069 cm ^-1 に一般的なマイナーな不純物は [Ru (NH ₃) ₅ N ₂] Cl ₃ に割り当てられます
   。
2. [(OH ₂) (NH ₃) ₄ とらぶる (μ-O) (NH ₃) ₄ (OH ₂)] Cl ₅ の合成
   1. 100 mg (0.34 mmol) を解散 [Ru (NH ₃) ₅ Cl]1 M NH ₄ 200 mL 重い壁丸底圧力容器中の OH の 50 mL の Cl ₂。緩く、ストッパー付きフラスコのキャップ 6 h 削除暑さから 75 ° C で反応混合物を熱し、暗い緑色のソリューションを生成するため 4 日間室温で攪拌します
      。 注意!圧力上昇により密閉された容器を加熱します。適切な圧力安全ガラスを使用することを確認します。この反作用のため容器のシールの目的はガスの NH ₃ の損失を最小限に抑えることです。したがって、過剰な圧力のリリースでは、大まかにストッパーを配置します
   。
3. 陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製
   1. 25 mL のビーカーに 5 g 陽イオン交換樹脂を中断 (例えば、ダウエックス 50WX2 200-400 メッシュ (H ⁺ フォーム) 10 mL 0.1 M HCl
   。
   2. は、50 mL の溶媒貯水池を貼付したもの (直径 10 mm、高さ 15 cm) 10 mL 列にこのスラリーをロードします。溶出液が無色になるまでに約 20-30 ml の 0.1 M HCl の樹脂を洗浄します
   。
   3. は 1.2.1 の手順で分離された緑の反応液に戻ります。このソリューションでは、2 は、その時点でソリューション色が茶色に変化する pH 調整に濃塩酸を追加します
   。
   4. は、1.3.2 の手順で優しく樹脂上にピペッティングにより作製した陽イオン交換樹脂カラムにこの酸性のソリューションを読み込みます。溶出液は完全にドレインし、ソリューションの読み込みを続行できます。ソリューション全体が追加されるまで、このプロセスを繰り返します。樹脂の上部はダークブラウン/ブラックになります。樹脂が少し減少 in ボリューム
   。
   5. 樹脂の上部をカバーするガラス製のビーズを使用。これらの新しいソリューションが追加されたときに邪魔されてから樹脂が防ぐされます
   。
   6. 20 ml 1 M HCl の列を溶出します
   。
   7. 溶出 1.5 M の塩酸濃度の増加の列 (≈ 50 mL)。黄色の溶液は、列をオフに来て開始されます。2 m HCl 濃度を増加し、続ける溶出溶出液が無色になるまでまたは非常に薄い緑、黄色。150-200 mL の容量は、このプロセスに必要になります
   。
   8. は、2.5 メートル (20-50 mL) 塩酸濃度を高めます。溶出液を試験管内の分数として収集します。3 M HCl に増加します。製品は、緑褐色のソリューションとして列から溶出が。赤茶色の分数列オフ来ても始めます。これらの画分は酸化ルテニウム赤不純物、行うプール緑茶色分数ありません
   。
4. 特性と [(OH ₂) (NH ₃) ₄ とらぶる (μ-O) (NH ₃) ₄ (OH ₂)] Cl ₅ の純度検証
   1. すべてから分数のテスト1.3.8 のステップ。紫外可視分光法による。このタスクを達成するために 3 M NH3 の mL の 2 に与えられた分数の 100 μ L を追加し、紫外可視分光法による分析します。純粋な製品を含む分数大吸光度バンドが 360 nm と 600 以下の強烈な吸光度 nm。480 または 533 nm における吸光度はそれぞれ酸化ルテニウム赤とルテニウム赤不純物を示す
   。
   2. は純粋なプロダクトを含む画分をプール、回転蒸発によって乾燥を解決を蒸発させます。製品は、緑褐色の固体として分離されます。利回りは、5-15 mg (10-20% の利回り) は通常およそ。単結晶 x 線回折に適した化合物の水溶液にエタノールの水蒸気拡散によって取得できます
   。 純度を確認する
   3. は、溶液 pH 7.4 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 紫外可視分光法による化合物を分析します。純度の 360 の強度の比で評価がある nm と 600 nm ピーク。この比率は、純粋な化合物の 31 です。不純化合物の比率は小さくなります
   。
   4. 赤外分光法による固体状態のサンプルを分析します。診断のバンドは、3234 cm ^-1、3151 cm ^-1、1618 cm ^-1、1313 cm ^-1 815 cm ^-1。1762 cm ^-1 1400 cm ^-1 に共通の不純物バンドを見て、NH の特徴 ₄ Cl. ルテニウム赤で識別できます 1404 cm ^-1、1300 cm ^-1、1037 cm ^-1 と 800 cm ^-1 に帯
   。
5. 蛍光分光法によるミトコンドリアのカルシウム吸収抑制の評価
   注意!次の手順は、哺乳動物細胞を使用します。生物学的安全性レベル 2 (BSL2) 研究のために認定されている適切な層流フードの仕事行われる必要があります
   。 ​ 注: [(OH ₂) (NH ₃) ₄ とらぶる (μ-O) (NH ₃) ₄ (OH ₂)] Cl ₅ が呼びます [Ru] としてこのセクション
   1. バッファーをグルコース含有生理食塩水溶液 (BGSS) のアッセイのメディア。BGSS は 110 mM KCl、1 mM KH ₂ PO ₄、1 mM MgCl ₂、20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)、5 mM コハク酸ナトリウム、30 μ M エチレング リコール-bis(β-aminoethyl ether)-ソリューション N, N、N '、N '-四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸)。PH 7.4 に調整、グリコールエーテルジアミン四酢酸を除くすべてを組み合わせます。グリコールエーテルジアミン四酢酸を加えて pH 7.4 に調整。50 ml アッセイ メディアの 1 mg/mL のブドウ糖の 0.5 mL を追加します
   。
   2. ダルベッコで 500 cm ² シャーレで培養 HeLa 細胞 ' s 修正イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) 5% CO ₂ 播くことによって 100 mm ペトリ皿の成長している 37 ° c. を増幅する HeLa 細胞での加湿のインキュベーターでの500 cm ² シャーレでそれら。大きな皿に総メディア ボリュームは 115 mL です。各大皿約 1800 万細胞、2 つの蛍光分光実験のために十分になります。
      1. のセルに達するまで成長 90-95% 合流。メディアを取り出して、15 mL pH 7.4 PBS のセルをすすいでください。PBS で 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 15 の mL を追加し、セルをデタッチするのには 10 分間インキュベートします。14 mL の丸底の隼の管にセルを転送
   3. 倒立顕微鏡とトリパン ブルー色素および診断を使用してセルをカウントし、セルの合計数とメディア 1.8 mL 体積当たり 750 万の細胞に到達するために必要な量を計算 媒体。5310 × g. 上清をデカントで 10 分の細胞を遠心分離し、BGSS の計算された容積を追加します。優しく細胞を再懸濁します。
      1. この試金のため純粋な水で準備ジメチルスルホキシド (DMSO)、1 mM H ₂ O と 10 mM CaCl ₂ H ₂ o. [Ru] 在庫ソリューション、カルシウム グリーン 5N で 40 mM ジギトニンの原液を準備、1-3 mM の範囲で指定できます
         。 ​ 注: カルシウム グリーン-5N は、光に敏感な。暗闇の中で保存し、光の露出を最小限にします
      。
   4. 506 nm と 532 で発光励起、蛍光をセットアップ 37 で制御キュベット ホルダー付き nm ° C. 準備攪拌棒やホイール、3.6 1.8 μ L ジギトニン ソリューション上記 1.5.2 から 1.8 mL 細胞懸濁液とアクリル キュベット &# 181;L カルシウム グリーン 5N (ソリューション) と 9 μ [Ru] (1 mM 原液、5 μ M 最終濃度) のため。セル蛍光で 15 分間を、インキュベートします。
      1. は、生の吸収ではなく励起/蛍光比としてデータを読み取ります。この実習は光源の輝度変動に関連付けられているエラーを最小限に抑えます
      。
      2. [Ru] 細胞の反応に CaCl ₂ 添加の効果を測定するための不在で最初のサンプル分析を実施します
      。
      3. 1.5.4 で説明する設定と蛍光の分析を開始。安定した排出量ベースラインを確立する約 2 分間待機し、CaCl ₂ (10 μ M 最終濃度) の 1.8 μ L を追加します。放射強度は、CaCl ₂ の添加によってすぐに増加し、カルシウム イオンは、ミトコンドリアを入力分のコース上が崩壊します。崩壊が完了するまで待つ (≈ 5 分)。[Ru] と扱われない細胞のミトコンドリアのカルシウム吸収反応を決定する、追加のカルシウム ボーラスを追加します
      。
   5. 別キュベットで 5 μ M [Ru] を含む実験を繰り返す 1.5.4.3 で前述。阻害剤の存在下で発光強度は増加が崩壊します。この観察を意味するミトコンドリアのカルシウムの取り込みをブロックします
   。

結果

このメソッドは、ミトコンドリアのカルシウム吸収阻害剤 [(OH₂) (NH₃)₄とらぶる (μ-O) (NH₃)₄(OH₂)] Cl₅ [Ru (NH₃)₅Cl] Cl₂から始まっての合成をについて説明します、よく知られている ruthenium(III) の出発原料。[Ru (NH₃)₅Cl]Cl₂は 3200 cm^-1、1608 cm^-1、1298 cm^-1...

ディスカッション

ミトコンドリアのカルシウム吸収阻害剤 [(OH₂) (NH₃)₄とらぶる (μ-O) (NH₃)₄(OH₂)] Cl₅ [Ru (NH₃)₅Cl] から合成された Cl₂、よく知られている ruthenium(III) をすることができます。開始材料は、この手順で説明するよう。[Ru (NH₃)₅Cl] Cl₂の合成は少し難しさと容易に実現できます。水和ヒドラジンの 16 h ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ruthenium Trichloride hydrate	Pressure Chemical	3750
Concentrated hydrochloric acid	J.T. Baker	9535
Concentrated ammonium hydroxide	Mallinckrodt Chemical Works	A669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 Mesh	Alfa Aesar	13945
Calcium Green 5N	Invitrogen	C3737
Digitonin	Aldrich	260746
DMSO	Aldrich	471267
EGTA	Aldrich	E3889
KCl	USB	20598
KH2PO4	Aldrich	P3786
MgCl2	Fisher Scientific	M33-500
HEPES	Fluka	54466
Sodium Succinate	Alfa Aesar	33386
EDTA	J.T. Baker	8993-01
Glucose	Aldrich	G5000
200 Round bottom flask	ChemGlass	CG-1506-14
Glass stopper	ChemGlass	CG-3000-05
10 mm x 15 cm glass column with reservoirs	Custom - similar to Chemglass columns	Similar to CG-1203-20
DMEM	Corning	10-017-CV
FBS	Gibco	10437028
PBS	Corning	21-040-CV
Round bottom Falcon tubes	Fisher Scientific	14-959-11B
500 cm2 petri dishes	Corning	431110
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	15250061
Hemacytometer	Aldrich	Z359629
Acrylic Cuvettes	VWR	58017-875
UV-Vis spectrometer	Agilent Model Cary 8454
Spectrofluorimeter	SLM Model 8100C
IR spectrometer	Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment
Centrifuge	ALC Model PM140R
Inverted light microscope	VWR	89404-462