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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Un protocollo per la sintesi, purificazione e caratterizzazione di un inibitore dell'assorbimento del calcio mitocondriale basato sul rutenio è presentato. Una procedura per valutare la sua efficacia in cellule di mammifero permeabilized è dimostrata.

Abstract

Dettagliamo la sintesi e la purificazione di un inibitore di assorbimento di calcio mitocondriale, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)]+ 5. La sintesi ottimizzata di questo composto ha inizio dalla [Ru (NH3)5Cl] Cl2 in 1m NH4OH in un contenitore chiuso, ottenendo una soluzione verde. Purificazione viene eseguita mediante cromatografia a scambio cationico. Questo composto è caratterizzato e verificato per essere puro mediante spettroscopia UV-vis e IR. Le proprietà inibitorie di assorbimento di calcio mitocondriale sono valutate in cellule HeLa permeabilized dalla spettroscopia di fluorescenza.

Introduzione

Calcio mitocondriale è un regolatore chiave per un certo numero di processi che sono fondamentali per la funzione normale delle cellule, tra cui l'apoptosi e la produzione di energia. 1 , 2 , 3 il calcio mitocondriale uniporter (MCU), una proteina del trasportatore dello ione che si trova sulla membrana mitocondriale interna, regola l'afflusso degli ioni di calcio nei mitocondri. 4 , 5 , 6 inibitori chimici della MCU sono strumenti preziosi per proseguire gli sforzi per studiare la funzione e i ruoli cellulari di questa proteina di trasporto e di calcio mitocondriale. Il composto [(HCO2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, è uno degli inibitori selettivi noti soli per la MCU con un valore did K riferito di 24 µM.7 ,8,9,10 , questo complesso è una comune impurità trovata in formulazioni commerciali del rutenio rosso (RuRed), un triruthenium di-µ-oxo "a ponte" hexacation della formula [(NH3) 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, che è stato utilizzato anche come un inibitore di assorbimento del calcio. Anche se Ru360 è disponibile in commercio, è molto costoso. Inoltre, la sintesi e l'isolamento di Ru360 è sfidato da purificazione difficili procedure e metodi di caratterizzazione ambigua.

Recentemente abbiamo segnalato procedure alternative per accedere un Ru360 analogici, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 questo composto inibisce la MCU con alta affinità, simile a Ru360. In questo protocollo, descriveremo la nostra sintesi più efficace di questo composto, che comincia da [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Purificazione del prodotto utilizzando la resina a scambio cationico fortemente acido è dettagliato, insieme a trabocchetti comuni per questa procedura. Inoltre presentiamo metodi di caratterizzazione e valutazione della purezza del composto e delineare un approccio semplice per testare la sua efficacia nel bloccare l'assorbimento di calcio mitocondriale.

Protocollo

Nota: acidi concentrati e basi sono utilizzati in questa sintesi. Utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate quando si esegue la reazione compreso l'uso di controlli tecnici (cappa) e dispositivi di protezione individuale (PPE) tra cui occhiali, guanti, camice da laboratorio, pieno lunghezza pantaloni e scarpe chiuse.

1. preparazione di [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5

  1. sintesi di Cl [Ru (NH 3) 5 Cl] 2 12
    1. dissolvere 1.00 g di RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru di peso, 4,1 mmol) in 5 mL di H 2 O. Cool la soluzione marrone scura a 0 ° C in un bagno di ghiaccio. Aggiungere mL 11 (0,23 mol) di soluzione di idrato di idrazina 80% in modo goccia a goccia. La reazione iniziale sarà vigorosa con il gas di evoluzione, risultante in una soluzione marrone. La soluzione risultante si mova augellin a temperatura ambiente per 16 h; la soluzione finale sarà rosso scuro
      Attenzione: L'idrazina è acutamente tossici e cancerogeni. Inoltre, anidra forme di questo reagente sono esplosive. Come sempre, uso appropriati cappe PPE e fumi durante la manipolazione. Non concentrare queste soluzioni per secchezza.
    2. Per questa soluzione, aggiungere circa 5-10 mL di HCl concentrato per aggiustare il pH a 2. A questo punto, la soluzione sarà giallo-marrone a colori.
    3. Calore questa soluzione a 105 ° C continuando a mescolare per 1-2 h. Un solido giallo precipita dalla soluzione. Quando non più visibilmente precipitare forme, togliere dal fuoco.
    4. Permettere la miscela di reazione per raffreddare a temperatura ambiente e quindi posto in un bagno di ghiaccio 0 ° C per 10 min. raccogliere il solido giallo di filtrazione sotto vuoto e lavaggio con 5 mL di etanolo ed etere etilico.
    5. Sciogliere completamente il prodotto grezzo in 15-25 mL di acqua calda. Chill 10 mL di una soluzione di HCl concentrata in una beuta per filtrazione collocandolo in un bagno di ghiaccio. Filtrare la soluzione gialla nella soluzione di HCl refrigerata per indurre la precipitazione di un solido puro giallo pallido. Questo precipitato di filtrare e lavare con 5 mL ciascuno di 0,5 M HCl, etanolo ed etere.
    6. Caratterizzare il composto utilizzando la spettroscopia IR. Verificare purezza tramite l'identificazione delle frequenze d'allungamento a 3226 cm -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1 e cm 801 -1. Una comune impurità minori a 2069 cm -1 è assegnata a [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3.
  2. Sintesi di [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
    1. sciogliere 100 mg (0,34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 in 50 mL di 1m NH 4 OH in un recipiente a pressione a fondo rotondo parete pesante 200 mL. Senza bloccare il recipiente con un tappo di cap e riscaldare la miscela di reazione a 75 ° C per 6 h. Togliere dal fuoco e mescolare a temperatura ambiente per 4 giorni per produrre una soluzione verde scura.
      Attenzione! Riscaldamento un risultati di vaso sigillato in un accumulo di pressione. Assicurarsi di utilizzare appropriato cristalleria di pressione-cassetta di sicurezza. Per questa reazione, lo scopo di sigillare la nave è quello di minimizzare la perdita di gassosa NH 3. Pertanto, inserire il tappo senza stringere per consentire per il rilascio della pressione in eccesso.
  3. Purificazione mediante cromatografia a scambio cationico
    1. In un becher da 25 mL, sospendere la resina a scambio cationico 5g (ad es., Dowex 50WX2 200-400 mesh (forma H +) in 10 mL di 0.1 M HCl.
    2. Caricare questo impasto in una colonna di 10 mL (10 mm di diametro, altezza 15 cm) munito di un serbatoio solvente 50 mL. Lavare la resina con circa 20-30 mL di 0.1 M HCl, finché l'eluato è incolore.
      3. Soluzione di reazione di
    3. ritorno al verde isolata al punto 1.2.1. Per questa soluzione, aggiungere HCl concentrato per regolare il pH a 2, al punto che il colore della soluzione diventa marrone.
    4. Caricare questa soluzione acidificata alla colonna di resina di scambio cationico preparata al punto 1.3.2 pipettando delicatamente sopra la resina. Lasciate che l'eluato completamente scarico e continuare a caricare la soluzione. Ripetere questo processo fino a quando l'intera soluzione è stato aggiunto. Parte superiore della resina sarà marrone scuro/nero. La resina diminuisce di volume leggermente.
    5. Perle di vetro di uso per coprire la parte superiore della resina. Questi impedirà la resina di essere disturbati quando vengono aggiunte nuove soluzioni.
    6. Eluire la colonna con 20 mL di 1 M HCl.
    7. Eluire la colonna con una maggiore concentrazione di HCl di 1,5 M (≈ 50 mL). Una soluzione gialla inizierà a venire fuori la colonna. Aumentare la concentrazione di HCl 2 m e continuare ad eluizione finché l'eluato è incolore o giallo-verde molto pallido. Un volume totale di 150-200 mL sarà richiesto per questo processo.
    8. Aumentare la concentrazione di HCl a 2,5 M (20-50 mL). Raccogliere l'eluato come frazioni in provette. Aumentare a 3 M HCl. Il prodotto sarà eluire dalla colonna come soluzione di verde-marrone. Una frazione di rosso-marrone può anche cominciare a venire fuori la colonna. Come queste frazioni sono le impurità ossidato rutenio rosso, non fare piscina con le frazioni di verde-marrone.
  4. Caratterizzazione e la verifica della purezza di [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
    1. tutte le frazioni da testare Passo 1.3.8. dalla spettroscopia UV-vis. Per eseguire questa operazione, aggiungere 100 µ l di una determinata frazione in 2 mL di 3 M NH3 e analizzare mediante spettroscopia UV-vis. Le frazioni contenenti il prodotto puro avrà una band di grande capacità di assorbimento a 360 nm e una meno intensa assorbanza a 600 nm. Assorbanza a 533 o 480 nm è indicativo di ossidato rutenio rosso e le impurità del rutenio rosso, rispettivamente.
    2. Piscina frazioni contenenti il prodotto puro ed evaporare la soluzione ad essiccazione per evaporazione rotante. Il prodotto sarà isolato come un solido verde-marrone. Rendimenti sono tipicamente dell'ordine di 5-15 mg (10-20% di rendimento). Monocristalli, adatti per diffrazione dei raggi x, possono essere ottenute dalla diffusione del vapore dell'etanolo in soluzioni acquose del composto.
    3. Per verificare la purezza, analizzare il composto dalla spettroscopia UV-vis in una soluzione di soluzione tampone fosfato pH 7.4 (PBS). Purezza può essere valutata prendendo il rapporto di intensità di 360 nm e 600 nm cime. Questo rapporto è 31 per un composto puro. Per i composti impuri, il rapporto sarà più piccolo.
    4. Analizzare il campione nella a stato solido di spettroscopia IR. Bande di diagnostiche sono al 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 cm -1 e 815 cm -1. Bande di impurità comuni sono visti al 1762 cm -1 e 1400 cm -1, caratteristico di NH 4 cl. rutenio rosso può essere identificato da bande a 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 e 800 cm -1.
  5. Valutazione di inibizione di assorbimento del calcio mitocondriale dalla spettroscopia di fluorescenza
    attenzione! Le procedure seguenti utilizzano cellule di mammiferi. Lavoro deve essere svolto in cappe a flusso laminare appropriati che sono certificate per sicurezza biologica di livello 2 (BSL2) ricerca.
    ​ Nota: [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 verrà essere denominato come [Ru] in questa sezione
    1. Make tamponata contenenti glucosio soluzione salina (BGSS) il supporto di analisi. BGSS è una soluzione composta da 110 mM KCl, 1mm KH 2 PO 4, 1mm MgCl 2, 20mm 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES), succinato del sodio di 5 mM, 30 µM glicole etilenico-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N ', N '-acido etilendiamminotetraacetico (EGTA). Combinare tutto tranne l'EGTA, regolare il pH a 7,4. Aggiungere EGTA e regolare il pH a 7,4. Per 50 mL di media saggio aggiungere 0,5 mL di glucosio 1 mg/mL.
    2. Cellule HeLa di cultura in 500 cm 2 piastre Petri Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS) in un incubatore con 5% CO 2 al 37 cellule di C. amplificare HeLa ° che crescono in un 100mm di Petri da semina li in una capsula di Petri 2 500 cm. Il volume totale media nel grande piatto è 115 mL. Ogni piatto grande resa di circa 18 milioni di cellule, abbastanza per due esperimenti di spettroscopia di fluorescenza.
      1. Crescere le cellule fino a quando raggiungono il 90-95% confluenza. Rimuovere i supporti e lavare le cellule con 15 mL di PBS pH 7.4. Aggiungere 15 mL di 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in PBS e incubare per 10 minuti staccare le cellule. Trasferire le cellule a 14 mL fondo falcon tubi tondi
    3. contare le celle utilizzando trypan blu e un emocitometro con un microscopio invertito e calcolare il numero totale delle cellule ed il volume dei mezzi necessari per raggiungere 7,5 milioni di cellule per 1,8 mL di volume del mezzo. Centrifugare le cellule per 10 min a 5310 × g. decantare il supernatante e aggiungere il volume calcolato di BGSS. Risospendere delicatamente le cellule.
      1. Per questo test, preparare soluzioni di riserva di digitonina 40mm in dimetilsolfossido (DMSO), 1 mM calcio verde-5N in H 2 O e 10 mM CaCl 2 in soluzioni di riserva di H 2 O. [Ru], preparati in acqua pura, può variare da 1-3 mM.
        ​ Nota: calcio verde-5N è sensibile alla luce. Conservare al buio e ridurre al minimo l'esposizione alla luce.
    4. Setup il fluorimetro per eccitare a 506 nm e leggere l'emissione a 532 nm con il cuvetta-titolare controllato a 37 ° C. Prepare una cuvetta acrilico con ancoretta o ruota, 1,8 mL di sospensione cellulare da 1.5.2 sopra, 1,8 µ l di soluzione di digitonina, 3.6 & #181; L calcio verde-5N (soluzione) e 9 µ l [Ru] (per la soluzione 1 mM, concentrazione finale di 5 µM). Incubare le cellule per 15 min nel fluorimetro.
      1. Leggere i dati come rapporto di eccitazione/emissione invece l'assorbimento crudo. Questa pratica riduce al minimo gli errori associati con le fluttuazioni dell'intensità della sorgente luminosa.
      2. Svolgere analisi del prima campione in assenza di [Ru] per misurare l'effetto dell'aggiunta di CaCl 2 sulla risposta delle cellule.
      3. Analisi Begin il fluorimetro con le impostazioni descritte 1.5.4. Attendere circa 2 minuti per stabilire una base di emissione stabile e quindi aggiungere 1,8 µ l di CaCl 2 (concentrazione finale di 10 µM). L'intensità di emissione aumenterà immediatamente dopo l'aggiunta di CaCl 2 e quindi decadrà nel corso dei minuti come gli ioni di calcio entra i mitocondri. Attendere che il decadimento ha terminato (≈ 5 min). Aggiungere i boli supplementare del calcio per determinare la risposta di assorbimento del calcio mitocondriale delle cellule non trattate con [Ru].
    5. In un'altra provetta contenente 5 µM [Ru], ripetere l'esperimento, come descritto in precedenza in 1.5.4.3. In presenza dell'inibitore, intensità di emissione farà aumentare, ma non decadere. Questa osservazione indica bloccato l'assorbimento del calcio mitocondriale.

Risultati

Questo metodo descrive una sintesi di calcio mitocondriale assorbimento inibitore [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 a partire da [Ru (NH3)5Cl] Cl2, un materiale di partenza ben noto ruthenium(III). [Ru (NH3)5Cl] CL2 è caratterizzato dalla spettroscopia IR, con modi vibrazionali a 3200 cm-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1<...

Discussione

Il calcio mitocondriale assorbimento inibitore [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 può essere sintetizzato da [Ru (NH3)5Cl] Cl2, un ruthenium(III) ben noto a partire del materiale, come descritto in questa procedura. La sintesi di [Ru (NH3)5Cl] Cl2 è realizzata prontamente con poca difficoltà. Dopo agitazione RuCl3 per 16 h in idrazina idrato, il pH della solu...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata sostenuta dalla Cornell University. Questo lavoro fatto uso del Cornell Center per servizi in comune ricerca materiali, che sono supportati tramite il programma NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. riconosce il sostegno di un NSF Graduate Research Fellowship (Grant DGE - 1650441) e Dr. Dave Holowka per assistenza con gli esperimenti di calcio. Opinioni, conclusioni e conclusioni o raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori (s) e non riflettono necessariamente le opinioni di National Science Foundation.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Ruthenium Trichloride hydratePressure Chemical3750
Concentrated hydrochloric acidJ.T. Baker9535
Concentrated ammonium hydroxideMallinckrodt Chemical WorksA669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 MeshAlfa Aesar13945
Calcium Green 5NInvitrogenC3737
DigitoninAldrich260746
DMSOAldrich471267
EGTAAldrichE3889
KClUSB20598
KH2PO4AldrichP3786
MgCl2Fisher ScientificM33-500
HEPESFluka54466
Sodium SuccinateAlfa Aesar33386
EDTAJ.T. Baker8993-01
GlucoseAldrichG5000
200 Round bottom flaskChemGlassCG-1506-14
Glass stopperChemGlassCG-3000-05
10 mm x 15 cm glass column with reservoirsCustom - similar to Chemglass columnsSimilar to CG-1203-20
DMEMCorning10-017-CV
FBSGibco10437028
PBSCorning21-040-CV
Round bottom Falcon tubesFisher Scientific14-959-11B 
500 cm2 petri dishesCorning431110
Trypan blueThermoFisher Scientific15250061
HemacytometerAldrichZ359629
Acrylic CuvettesVWR 58017-875
UV-Vis spectrometerAgilent Model Cary 8454 
SpectrofluorimeterSLM Model 8100C
IR spectrometerBruker Hyprion FTIR with ATR attachment
CentrifugeALC Model PM140R
Inverted light microscopeVWR 89404-462

Riferimenti

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