JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bir protokol, arıtma, malzemelerin ve rutenyum tabanlı inhibitörü olan mitokondrial kalsiyum alımı için sunulmaktadır. Permeabilized memeli hücrelerinde onun etkinliğini değerlendirmek için bir yordam gösterilmiştir.

Özet

Sentez ve bir mitokondri kalsiyum alımını inhibitörü, [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)]5 +arıtma ayrıntı. Bu bileşik bir en iyi duruma getirilmiş sentez [Ru (NH3)5Cl] Cl2 den 1 M NH4OH yeşil bir çözüm verimli kapalı bir kap içinde başlar. Arıtma katyon değişim Kromatografi ile gerçekleştirilir. Bu bileşik ile karakterize olan ve saf olmak UV-VIS ve IR spektroskopisi tarafından doğrulandı. Mitokondrial kalsiyum alımını inhibitör özellikleri permeabilized HeLa hücreleri Floresans spektroskopisi tarafından değerlendirilir.

Giriş

Mitokondrial kalsiyum enerji üretimi ve Apoptozis dahil olmak üzere normal hücre işlevi için kritik süreçlerin bir dizi için anahtar bir düzenleyicisidir. 1 , 2 , 3 mitokondrial kalsiyum uniporter (MCU), iç mitokondrial membran üzerinde bulunduğu bir iyon taşıyıcı protein kalsiyum iyonları akını mitokondri düzenlemektedir. 4 , 5 , 6 MCU kimyasal inhibitörleri çalışmaları bu taşıma protein ve mitokondrial kalsiyum hücresel roller ve işlev çalışmaya devam değerli araçlardır. Bileşik [(HCO2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, MCU bildirilen Kd değeri olan 24 µM.7 için tek bilinen seçici inhibitörleri biridir Bu karmaşık ortak bir kirlilik ticari formülasyonları ve rutenyum kırmızı (RuRed), bir triruthenium di-μ-oxo bulunan ,8,9,10 köprü hexacation Formula [(NH3) 5 Aynı zamanda kalsiyum alımını inhibitörü olarak kullanılan (μ-O) Ru Ru (NH3)4(μ-O) Ru (NH3)5)]6 +. Ru360 ticari olarak mevcut olmasına rağmen çok pahalıya mal olur. Ayrıca, sentez ve Ru360 yalıtım, meydan zor arıtma işlemleri ve belirsiz karakterizasyon yöntemleri tarafından.

Son zamanlarda bir Ru360 analog, [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5erişmek için alternatif prosedürler bildirdin. 11 bu bileşik ile yüksek afinite, Ru360 için benzer MCU engeller. Bu protokol için [Ru (NH3)5Cl] Cl2den başlar bizim en etkili sentezi olan bu bileşik anlatacağız. Arıtma kesinlikle asidik katyon değişim reçine kullanarak ürün ile birlikte ortak tuzaklar bu yordam için detaylı. Ayrıca, karakterizasyonu ve bileşik saflık değerlendirme yöntemleri sunmak ve mitokondrial kalsiyum alımını engelleme onun etkinliğini test etmek için basit bir yaklaşım betimlemek.

Protokol

Not: Konsantre asitler ve bazlar bu sentezinde kullanılır. Mühendislik kontrolleri (duman hood) ve koruyucu gözlük, eldiven, önlük, tam uzunlukta pantolon ve kapalı-toe ayakkabı da dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanımı gibi tepki yerine getirirken tüm uygun güvenlik uygulamaları kullanın.

1. hazırlanması [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (μ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5

  1. sentez [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 12
      RuCl 3 · n H 2 O
    1. erimesi 1.00 g (% 40 ağırlık Ru, 4.1 mmol) H 2 O. serin bir buz banyosu 0 ° C'de koyu kahverengi çözümü 5 ml. 11 mL (0,23 mol) % 80 hidrazin hidrat çözüm dropwise bir şekilde ekleyin. İlk tepki kahverengi bir çözümde kaynaklanan evrim gaz ile güçlü olacak. 16 h için oda sıcaklığında karıştırın elde edilen çözüm izin; nihai çözüm koyu kırmızı olacak
      Dikkat: Hidrazin akut toksik ve kanserojen. Ayrıca, susuz Bu reaktif patlayıcı biçimleridir. Her zaman olduğu gibi uygun KKE ve duman davlumbaz işlerken kullanın. Bu çözümler kuruluk için konsantre değil.
    2. Bu, yaklaşık 5-10 mL konsantre HCL pH 2 ayarlamak için ekleyin. Bu noktada, belgili tanımlık eriyik-ecek var olmak sarı-kahverengi renkte.
    3. Bu çözüm karıştırarak 1-2 h için ise 105 ° c ısı. Sarı bir katı eriyik dışarı çökelti. Zaman artık gözle görülür formları çökelti, ısı kaldırmak.
    4. Her etanol ve Dietil eter oda sıcaklığına kadar serin ve 10 dk. toplamak için vakum filtrasyon ve yıkama ile 5 mL sarı katı bir 0 ° C buz banyosunda koyun reaksiyon karışım izin verin.
    5. 15-25 ml sıcak su ham ürün tamamen erimesi. 10 mL konsantre HCl bir çözüm bir filtre şişesi içinde bir buz banyosu yerleştirerek chill. Sarı çözüm soğutulmuş HCl çözüm içine soluk sarı saf sağlam bir yağış ikna etmek için filtre. Bu çökelti filtre ve yıkama 5 mL ile her 0,5 M HCl, etanol ve eter.
    6. Bileşik kullanarak karakterize IR spektroskopisi. By 3226 cm -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1 ve 801 cm -1 germe frekanslarda tanımlaması saflık doğrulayın. 2069 cm -1, ortak bir küçük kirlilik [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3 ' e atanır.
  2. [(OH 2) (NH 3) 4 (μ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 sentezi
    1. 100 mg (0,34 mmol) dağıtılması [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 50 mL / 1 M NH 4 OH 200 mL ağır duvar yuvarlak popolu basınç gemi içinde. Gevşek bir tıpa ile balonun kap ve 75 ° C 6 h. Kaldır ısı için tepki karisimin ısı ve koyu yeşil çözüm verim 4 gün için oda sıcaklığında karıştırın.
      Dikkat! Basınç birikmesi mühürlü gemi sonuçlarında Isıtma. Uygun basınç güvenli cam kullandığınızdan emin olun. Bu reaksiyon, gaz halinde olan yakıtlar NH 3 kaybını en aza indirmek için gemi sızdırmazlık amaçlı var. Bu nedenle, gevşek aşırı baskı yayın için izin vermek için tıpa yerleştirin.
  3. Arıtma katyon değişim Kromatografi tarafından
    1. 25 mL kabı içinde 5 g katyon değişim reçine askıya alma (10 ml 0.1 M Örneğin, kafes (H + form) Dowex 50WX2 200-400 HCl.
    2. 50 mL çözelti su deposu ile yapıştırılmış bu Bulamaç bir 10 mL sütununa (10 mm çap, 15 cm yükseklik) yükleyin. Eluate renksiz olana reçine ile yaklaşık 20-30 mL 0.1 M HCL, yıka.
      3. 1.2.1. adımda izole yeşil tepki çözüm
    3. dönün. Bu, konsantre HCl pH 2, hangi noktasında çözüm renk değiştirir Brown'a ayarlamak için çözüm.
    4. Bu acidified çözüm adım 1.3.2 yavaşça üzerine reçine pipetting tarafından hazırlanan katyon değişim reçine sütuna yerleştirin. Tamamen drenaj ve çözüm yüklemeye devam eluate izin ver. Tüm çözüm eklenene kadar bu işlemi yineleyin. Reçine üst koyu kahverengi/siyah olacak. Reçine hacmindeki biraz azalacak.
    5. Reçine üst kapsayacak şekilde kullanım cam boncuk. Bunlar-ecek önlemek reçine yeni çözümler eklendiğinde rahatsız.
    6. 20 mL 1 M HCL sütunla elute.
    7. Elute sütun ile bir artan 1,5 M HCl konsantrasyonu (≈ 50 mL). Sarı bir çözüm sütun gelmeye başlayacak. 2 m HCl konsantrasyonu artırmak ve devam eluate renksiz olana eluting veya bir çok soluk yeşil-sarı. 150-200 mL toplam hacmi bu işlem için gerekli olacak.
    8. 2.5 m (20-50 mL) HCl konsantrasyonu artırmak. Kesirler testi tüpler olarak eluate toplamak. 3 M HCl artırın. Ürün sütundan bir yeşil-kahverengi çözüm olarak elute. Kırmızı-kahverengi kesir de uzakta-in sütun gelmeye başlayabilir. Bu kesirler oksitlenmiş rutenyum kırmızı kirleri olduğundan, yeşil-kahverengi kesirler ile havuz değil.
  4. Karakterizasyonu ve doğrulama saflık [(OH 2) (NH 3) 4 (μ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
    1. kesirler Test Adım 1.3.8. UV-VIS spektroskopisi tarafından. Bu görevi gerçekleştirmek için belirli bir kısmını 100 µL 3 M NH3 2 mL ekleyin ve UV-VIS spektroskopisi tarafından analiz. Saf ürün içeren kesirleri 360'a büyük Absorbans grubu olacak nm ve daha az yoğun Absorbans 600 nm. 480 veya 533 nm Absorbans oksitlenmiş rutenyum kırmızı ve rutenyum kırmızı kirleri, gösterge sırasıyla.
    2. Saf ürün içeren kesirleri havuz ve kuruluk çözümü tarafından döner buharlaşma buharlaşır. Ürün bir yeşil-kahverengi katı izole olacak. Verimleri genellikle 5-15 mg (% 10-20 verim) sırasına bulunmaktadır. Tek kristalleri, x-ışını kırınımı için uygun etanol buharı difüzyon bahçedeki sulu çözümler içine tarafından elde edilebilir.
      3. Saflık, doğrulamak için
    3. UV-VIS spektroskopisi bir çözüm pH 7.4 fosfat tamponlu tuz (PBS) tarafından bileşik analiz. Saflık-var değerlendirildi 360 yoğunluğu oranı alarak nm ve 600 nm tepeler. Bu oran saf bir bileşiği 31'dir. Saf olmayan bileşikler için oranı daha küçük olur.
    4. Katı hal örnek tarafından IR spektroskopi analiz. Tanılama bantları 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 cm -1 ve 815 cm -1 vardır. Ortak kirlilik bantları 1762 cm -1 ve 1400 cm -1 de görülür, NH karakteristik 4 CL rutenyum kırmızı bantları 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 ve 800 cm -1 belirlenebilir.
  5. Mitokondrial kalsiyum alımını inhibisyon Floresans spektroskopisi tarafından değerlendirilmesi
    dikkat! Memeli hücreleri aşağıdaki yordamları kullanın. İş yürütülen biyolojik güvenlik seviye için 2 (BSL2) araştırma sertifikalıdır uygun laminar akış davlumbaz içinde.
    ​ Not: [(OH 2) (NH 3) 4 (μ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 atıfta [Ru] Bu bölümde
    1. arabelleğe alınmış olun glikoz içeren tuzlu çözüm (BGSS) olarak tahlil medya. BGSS bir çözümdür oluşan 110 mM KCl, 1 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES), 5 mM sodyum süksinat, 30 µM etilen glikol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N ', N '-tetraacetic asit (EGTA). EGTA dışında her şeyi birleştirmek, pH 7.4 için ayarlayın. EGTA ekleyin ve pH 7.4 için yeniden ayarlayabilirsiniz. Tahlil medya için 50 mL 0.5 mL 1 mg/mL glikoz ekleyin.
    2. Kültür HeLa hücreleri 500 cm 2 Petri yemeklerinde Dulbecco ' s % 10 fetal sığır serum (FBS) ile % 5 CO 2 tohum tarafından bir 100 mm Petri kabına büyüyen 37 ° c yükseltmek HeLa hücreleri de oksijen bir kuluçka ile modifiye kartal orta (DMEM) Onları bir 500 cm 2 Petri içinde. 115 mL büyük tabak içinde toplam medya birimdir. Her büyük çanak yaklaşık 18 milyon hücre, iki Floresans spektroskopisi deneyler için yeterli verim.
      1. Büyümek hücreleri % 90-95 ulaşana kadar confluency. Medyayı çıkarın ve 15 mL pH 7.4 PBS hücrelerle durulayın. PBS içinde 15 mL 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ekleyin ve hücreleri ayırmak 10 dakikadır kuluçkaya. Hücreleri alt Şahin tüpler yuvarlak 14 mL transfer
    3. Say trypan mavi ve bir hemasitometre ile ters bir mikroskop kullanarak hücreleri ve hücre ve toplam 7.5 milyon hücre 1,8 mL birim başına ulaşması için gerekli ortam hacmi hesaplamak Orta. Hücreler için 5310 × g. Decant süpernatant, 10 dk santrifüj kapasitesi ve BGSS hesaplanan hacmi ekleyin. Hücreleri nazikçe resuspend.
      1. Bu tahlil için Dimetil sülfoksit (DMSO), 1 mM kalsiyum yeşil-5N H 2 O ve 10 mM CaCl 2 H 2 o [Ru] hisse senedi çözümlerinde, 40 mM digitonin hisse senedi çözümler saf suda hazırlanan hazırlamak, 1-3 mM arasında değişen olabilir.
        ​ Not: kalsiyum yeşil-5N ışığa duyarlı. Saklamak karanlıkta ve pozlama ışık en aza indirgemek.
    4. Fluorimeter 506 nm ve okuma 532, emisyon heyecanlandırmak için kurulum nm ile 37, kontrollü küvet tutucu ° C. hazırlayın bir heyecan bar veya tekerlek, 1,8 mL hücre süspansiyon 1.5.2 yukarıda, 1.8 µL digitonin çözüm, 3.6 üzerinden bir akrilik küvet ve #181; L kalsiyum yeşil-5N (çözüm) ve 9 µL [Ru] (1 mM hisse senedi çözüm, 5 µM son konsantrasyonu için). Hücreler fluorimeter 15dk için kuluçkaya.
      1. Veri ham emme yerine uyarma/emisyon oranı olarak okuyun. Bu uygulama ışık kaynağı şiddeti dalgalanmalar ile ilişkili hatalar en aza indirir.
      2. Hücreleri yanıt CaCl 2 ek etkisini ölçmek için [Ru] yokluğunda ilk örnek analizi gerçekleştirmek.
      3. Begin analiz 1.5.4 içinde açıklanan ayarları ile fluorimeter. Bir sabit emisyon temel kurmak için yaklaşık 2 dakika bekleyin ve sonra 1.8 µL CaCl 2 (10 µM son konsantrasyonu) ekleyin. Emisyon yoğunluğu hemen CaCl 2 eklenmesi artacak ve kalsiyum iyonları mitokondri girerken sonra dakika boyunca çürüme. Çürüme işlemini tamamlayana kadar bekleyin (≈ 5 dk). Mitokondrial kalsiyum alımını yanıt [Ru] tedavi değil hücre belirlemek için ek kalsiyum boluses eklemek.
    5. 1.5.4.3 içinde yukarıda açıklandığı gibi başka bir küvet içinde deneme tekrar 5 mikron [Ru], içeren. İnhibitörü huzurunda emisyon yoğunluğu artırmak ama değil çürük. Bu gözlem ettiğinizi mitokondrial kalsiyum alımı bloke.

Sonuçlar

Bu yöntem bir sentez [Ru (NH3)5Cl] Cl2başlayarak mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 açıklar bir iyi bilinen ruthenium(III) başlangıç materyali. [Ru (NH3)5Cl] CL2 IR spektroskopisi, 3200 cm-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1ve 798 cm-1 (

Tartışmalar

Mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 sentezlenmiş [Ru (NH3)5Cl] Cl2, iyi bilinen bir ruthenium(III) olabilir malzeme, bu yordamda açıklandığı gibi başladı. [Ru (NH3)5Cl] Cl2 sentezi kolayca küçük zorlukla elde edilir. 16 h için RuCl3 hidrazin içinde karıştırma sonra hidrat, çözüm pH HCl ile 2 değeri...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa yoktur

Teşekkürler

Bu araştırma Cornell Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. Bu eser Cornell Merkezi malzemeleri araştırma paylaşılan Tesisatı, NSF MRSEC programı (Grant DMR-1120296) ile desteklenen için kullanın yaptı. S.R.N. destek bir NSF yüksek lisans araştırma bursu (Grant DGE - 1650441) ve Dr Dave Holowka kalsiyum deneyler hakkında yardım almak için kabul eder. Herhangi bir görüş, bulgular ve sonuç ya da öneriler bu malzeme ifade yazarlar (s) ve mutlaka Ulusal Bilim Vakfı görüşlerini yansıtmamaktadır.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Ruthenium Trichloride hydratePressure Chemical3750
Concentrated hydrochloric acidJ.T. Baker9535
Concentrated ammonium hydroxideMallinckrodt Chemical WorksA669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 MeshAlfa Aesar13945
Calcium Green 5NInvitrogenC3737
DigitoninAldrich260746
DMSOAldrich471267
EGTAAldrichE3889
KClUSB20598
KH2PO4AldrichP3786
MgCl2Fisher ScientificM33-500
HEPESFluka54466
Sodium SuccinateAlfa Aesar33386
EDTAJ.T. Baker8993-01
GlucoseAldrichG5000
200 Round bottom flaskChemGlassCG-1506-14
Glass stopperChemGlassCG-3000-05
10 mm x 15 cm glass column with reservoirsCustom - similar to Chemglass columnsSimilar to CG-1203-20
DMEMCorning10-017-CV
FBSGibco10437028
PBSCorning21-040-CV
Round bottom Falcon tubesFisher Scientific14-959-11B 
500 cm2 petri dishesCorning431110
Trypan blueThermoFisher Scientific15250061
HemacytometerAldrichZ359629
Acrylic CuvettesVWR 58017-875
UV-Vis spectrometerAgilent Model Cary 8454 
SpectrofluorimeterSLM Model 8100C
IR spectrometerBruker Hyprion FTIR with ATR attachment
CentrifugeALC Model PM140R
Inverted light microscopeVWR 89404-462

Referanslar

  1. De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
  2. Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
  3. Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
  4. De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
  5. Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
  6. Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
  7. Ying, W. -. L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).
  8. Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -. L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
  9. Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
  10. Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
  11. Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
  12. Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
  13. Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
  14. Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kimyasorunu 128Ru360mitokondrikalsiyummitokondrial kalsiyum Uniporterrutenyum k rm zBiyoinorganik Kimya

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır