Synthese und Bewertung von Ruthenium-basierte mitochondrialen Kalzium-Aufnahme-Hemmer

Zusammenfassung

Ein Protokoll für die Synthese, Aufreinigung und Charakterisierung von einer Ruthenium-basierte Inhibitor der mitochondrialen Calciumaufnahme wird vorgestellt. Ein Verfahren zur Bewertung ihrer Wirksamkeit in permeabilized Säugerzellen wird demonstriert.

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Synthese und Reinigung von eine mitochondriale Kalzium-Aufnahme-Hemmer, [(OH-₂) (NH₃)₄Ru (µ-O) Ru (NH₃)₄(OH-₂)]^{5 +}. Die optimierte Synthese dieser Verbindung beginnt ab [Ru (NH₃)₅Cl] Cl₂ in 1 M NH₄OH in einem geschlossenen Behälter, wodurch eine umweltfreundliche Lösung. Reinigung erfolgt mit Kationenaustausch Chromatographie. Diese Verbindung ist gekennzeichnet und rein sein von IR und UV-Vis Spektroskopie überprüft. Die mitochondriale Kalzium-Aufnahme hemmenden Eigenschaften sind in permeabilized HeLa-Zellen von Fluoreszenz-Spektroskopie bewertet.

Einleitung

Mitochondriale Calcium ist ein wichtiger Regulator für eine Reihe von Prozessen, die entscheidend für die normale Zellfunktion, einschließlich Energieerzeugung und Apoptose sind. ^{1 , 2 , 3} die mitochondriale Kalzium Uniporter (MCU), ein Ion-Transporter-Protein, das auf der inneren mitochondrialen Membran befindet regelt den Zustrom von Calcium-Ionen in die Mitochondrien. ^{4 , 5 , 6} chemische Inhibitoren der MCU sind wertvolle Werkzeuge für die Fortsetzung der Bemühungen, die Funktion und die zellulären Funktionen dieses Transportprotein und mitochondriale Kalzium zu studieren. Die zusammengesetzten [(HCO₂) (NH₃)₄Ru (µ-O) Ru (NH₃)₄(O₂CH)]^{3 +}, Ru360, gehört der einzige bekannteren selektive Inhibitoren für die MCU mit einem gemeldeten K-_d -Wert von 24 µM.^{7 ,8,9,10} dieser Komplex eine gemeinsame Verunreinigung gefunden in kommerzielle Formulierungen von Ruthenium rot (RuRed), eine Triruthenium di-µ-Oxo ist überbrückt Hexacation der Formel [(NH₃) ₅ RU (µ-O) Ru (NH₃)₄(µ-O) Ru (NH₃)₅)]^{6 +}, die auch als ein Kalzium-Aufnahme-Hemmer verwendet wurde. Obwohl Ru360 im Handel erhältlich ist, ist es sehr kostspielig. Darüber hinaus wird die Synthese und die Isolierung von Ru360 durch schwierige Reinigung Verfahren und mehrdeutige Charakterisierungsmethoden herausgefordert.

Vor kurzem haben wir alternative Verfahren eine Ru360 analog, [(OH-₂) (NH₃)₄Ru (µ-O) Ru (NH₃)₄(OH-₂)] Cl₅Zugriff auf berichtet. ¹¹ diese Verbindung hemmt die MCU mit hoher Affinität, ähnlich wie bei Ru360. In diesem Protokoll beschreiben wir unsere effektivsten Synthese dieser Verbindung, die von [Ru (NH₃)₅Cl] Cl₂beginnt. Reinigung des Produkts verwenden stark saure Kationenaustauschermembran Harz ist zusammen mit gemeinsamen Fallstricke für dieses Verfahren detailliert. Wir auch Methoden zur Charakterisierung und Beurteilung der zusammengesetzte Reinheit zu präsentieren und einen einfachen Ansatz, um seine Wirksamkeit zu testen, bei der Blockierung der mitochondrialen Calciumaufnahme abzugrenzen.

Protokoll

Hinweis: konzentrierte Säuren und Basen sind in dieser Synthese verwendet. Verwenden Sie alle entsprechenden Sicherheitsmaßnahmen bei der Durchführung der Reaktion, einschließlich des Einsatzes von technischen Kontrollen (Abzug) und persönliche Schutzausrüstung (PSA) einschließlich Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, voller Länge Hosen und geschlossene Schuhe.

1. Vorbereitung der [(OH-₂) (NH ₃) ₄ Ru (µ-O) Ru (NH ₃) ₄ (OH-₂)] Cl ₅

1. Synthese von [Ru (NH ₃) ₅ Cl] Cl ₂ ¹²
   1. auflösen 1,00 g RuCl ₃ · n H ₂ O (40 % Ru nach Gewicht, 4,1 Mmol) in 5 mL H ₂ O. Cool die dunkle braune Lösung auf 0 ° C im Eisbad. 11 mL (0,23 Mol) von 80 % Hydrazin Hydrat Lösung in gewissem Sinne tropfenweise hinzugeben. Die erste Reaktion wird kräftig mit der Evolution Gas, wodurch eine braune Lösung sein. Lassen Sie die resultierende Lösung bei Raumtemperatur für 16 h rühren; die endgültige Lösung werden dunkel rot
      Achtung: Hydrazin ist akut giftig und karzinogen. Darüber hinaus sind wasserfreie Formen von diesem Reagens explosiv. Verwenden Sie geeignete PSA und Rauch Hauben wie immer beim Umgang mit. Nicht konzentrieren, diese Lösungen zu Trockenheit.
   2. Dieser Projektmappe hinzufügen etwa 5-10 mL konzentrierter HCl zur Einstellung des pH-Wertes auf 2. An dieser Stelle werden die Lösung gelb-braune Farbe.
   3. Erhitzen dieser Lösung bei 105 ° C unter ständigem Rühren ca. 1-2 h. Eine gelbliche Lösung wird aus der Lösung ausgefällt. Wenn nicht mehr sichtbare Formen Niederschlag, vom Herd nehmen.
   4. Ermöglichen dem Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen lassen, und dann in ein Eisbad 0 ° C für 10 min. sammeln die gelbliche Lösung durch Vakuumfiltration und waschen mit 5 mL Ethanol und Diethylether.
   5. Lösen sich vollständig auf das Rohprodukt in 15-25 mL heißem Wasser. Chill-10 mL einer konzentrierten HCl-Lösung in einem Filter Kolben indem man sie in ein Eisbad. Filtern Sie die gelbe Lösung in die gekühlte HCl-Lösung Niederschlag eines blass gelbe reinen Feststoffs zu induzieren. Dieser Niederschlag zu filtern und mit 5 mL von 0,5 M HCl, Ethanol und Ether waschen.
   6. Characterize Verbindung mit IR-Spektroskopie. Durch die Identifizierung der Dehnung Frequenzen bei 3226 cm ^-1, 1604 cm ^-1 und 1297 cm ^-1 801 cm ^-1 Reinheit überprüft. Eine gemeinsame kleine Verunreinigung bei 2069 cm ^-1 zugewiesen [Ru (NH ₃) ₅ N ₂] Cl ₃.
2. Synthese von [(OH-₂) (NH ₃) ₄ Ru (µ-O) Ru (NH ₃) ₄ (OH-₂)] Cl ₅
   1. auflösen 100 mg (0,34 Mmol) [Ru (NH ₃) ₅ Cl] CL ₂ in 50 mL 1 M NH ₄ OH in einem 200 mL schwere Wand Runde Talsohle Druckbehälter. Lose den Kolben mit einem Stopfen verschließen und Wärme der Reaktionsmischung bei 75 ° C für 6 h entfernen vom Herd nehmen und rühren bei Raumtemperatur für 4 Tage um eine dunkle grüne Lösung zu erzielen.
      Vorsicht! Heizung eines versiegelten Behälter führt zu einen Druckaufbau. Achten Sie darauf, entsprechenden Druck spülmaschinenfest Glaswaren. Für diese Reaktion dient der Abdichtung des Schiffes zu Verlust von gasförmigen NH ₃ zu minimieren. Legen Sie daher den Stopfen lose, um Freisetzung von Überdruck zu ermöglichen.
3. Reinigung durch Kationenaustausch Chromatographie
   1. In ein 25 mL Becherglas aussetzen 5 g Kationenaustausch Harz (z. B. Dowex 50WX2 200-400 Mesh (H ⁺ Form) in 10 mL 0,1 M HCl.
   2. Laden diese Gülle in einer 10 mL-Spalte (10 mm Durchmesser, Höhe 15 cm) mit 50 mL Lösungsmittel Reservoir angebracht. Das Harz mit ca. 20-30 mL 0,1 M HCl zu waschen, bis das Eluat farblos ist.
   3. Rückkehr zum Grün Reaktionslösung in Schritt 1.2.1 isoliert. Diese Projektmappe hinzufügen konzentrierte HCl zur Einstellung des pH-Wertes auf 2, an welcher Stelle die Lösung braun verfärbt.
   4. Laden diese gesäuerte Lösung der Kationenaustausch Harz-Spalte im Schritt 1.3.2 durch pipettieren sie sanft auf das Harz vorbereitet. Lassen Sie das Eluat vollständig entleeren, und laden die Lösung fortsetzen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die gesamte Projektmappe hinzugefügt wurden. Die Oberkante des Harzes wird dunkelbraun/schwarz sein. Das Harz wird in Volumen leicht zurückgehen.
   5. Verwendung Glasperlen, die Abdeckung des Harzes. Dies werden verhindert, dass das Harz gestört zu werden wenn neue Lösungen hinzugefügt werden.
   6. Die Spalte mit 20 mL 1 M HCl eluieren.
   7. Eluieren die Spalte mit einer erhöhten HCl-Konzentration von 1,5 M (≈ 50 mL). Eine gelbe Lösung beginnen, aus der Spalte zu kommen. Die HCl-Konzentration bis zu 2 M zu erhöhen und weiter eluierenden bis das Eluat farblos ist oder ein sehr blasses Grün-Gelb. Einem Gesamtvolumen von 150-200 mL werden für diesen Prozess erforderlich.
   8. Erhöhen die HCl-Konzentration bis 2,5 M (20-50 mL). Das Eluat als Brüche im Reagenzglas zu sammeln. Bis 3 M HCl erhöhen. Das Produkt wird aus der Spalte als eine grün-braune Lösung eluieren. Eine rot-braune Bruch kann auch damit beginnen, kommen aus der Spalte. Da diese Fraktionen rot oxidierte Ruthenium Verunreinigungen sind, nicht mit den grün-braune Brüchen zu bündeln.
4. Charakterisierung und Prüfung der Reinheit von [(OH-₂) (NH ₃) ₄ Ru (µ-O) Ru (NH ₃) ₄ (OH-₂)] Cl ₅
   1. Testen aller Fraktionen aus Schritt 1.3.8. durch UV-Vis-Spektroskopie. Um diese Aufgabe auszuführen, fügen Sie 100 µL einer bestimmten Fraktion in 2 mL 3 M NH3 und analysieren von UV-Vis-Spektroskopie. Brüche, enthält reines Produkt haben eine große Absorption-Band bei 360 nm und eine weniger intensive Extinktion bei 600 nm. Extinktion bei 480 oder 533 nm ist bezeichnend für rot oxidierte Ruthenium und Ruthenium rote Verunreinigungen bzw..
   2. Fraktionen enthält reines Produkt bündeln und verdunsten der Lösung für Trockenheit durch rotary verdampfen. Das Produkt wird als grün-braune Feststoff isoliert werden. Die Erträge sind in der Regel in der Größenordnung von 5-15 mg (10-20 % Ausbeute). Single-Kristalle, geeignet für x-ray Diffraction, von der Dampf-Diffusion von Ethanol in wässrigen Lösungen der Verbindung abgerufen werden können.
   3. Zur Überprüfung der Reinheit, analysieren die Verbindung mittels UV-Vis Spektroskopie in einer Lösung von pH 7.4 Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Reinheit kann beurteilt werden, indem man das Verhältnis der Intensität der 360 nm und 600 nm Gipfeln. Dieses Verhältnis ist 31 für reine Verbindung. Für unreine Verbindungen wird das Verhältnis kleiner sein.
   4. Analyse die Probe in der Solid-State-durch IR-Spektroskopie. Diagnose-Bänder sind 3234 cm ^-1, 3151 cm ^-1, 1618 cm ^-1, 1313 cm ^-1 und 815 cm ^-1. Gemeinsamen Unreinheit Bands sind auf 1762 cm ^-1 und 1400 cm ^-1, charakteristisch für NH ₄ CL Ruthenium rot erkennen Sie an Bands bei 1404 cm ^-1, 1300 cm ^-1, 1037 cm ^-1 und 800 cm ^-1.
5. Bewertung der mitochondrialen Kalzium-Aufnahme-Hemmung durch Fluoreszenz-Spektroskopie
   Vorsicht! Die folgenden Verfahren verwenden Säugerzellen. Arbeiten sollten in entsprechenden Laminar-Flow-Hauben, die zertifiziert sind, biologische Sicherheit Level 2 (BSL2) Forschung durchgeführt werden.
   ​ Hinweis: [(OH-₂) (NH ₃) ₄ Ru (µ-O) Ru (NH ₃) ₄ (OH-₂)] Cl ₅ wird als bezeichnet werden [RU] in diesem Abschnitt
   1. machen gepuffert Glukose-haltigen Kochsalzlösung (BGSS) der Assay-Medien. BGSS ist eine Lösung, bestehend aus 110 mM KCl, 1 mM KH ₂ PO ₄, 1 mM MgCl ₂, 20 mM 4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES), 5 mM Natrium Succinat, 30 µM Ethylenglykol-Bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N ', N '-Tetraacetic Säure (EGTA). Kombinieren Sie alles außer der EGTA, einstellen Sie pH auf 7,4. EGTA hinzufügen und pH-Wert 7,4 nachjustieren. Für 50 mL Assay Medien hinzufügen 0,5 mL 1 mg/mL Glukose.
   2. Kultur HeLa-Zellen in 500 cm ² Petrischalen in Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO ₂ bei 37 ° c verstärken HeLa-Zellen, die durch Aussaat in ein 100 mm Petrischale wachsen Sie in einer Petrischale 500 cm ². Der gesamte Datenträger in die große Schüssel beträgt 115 mL. Jeder große Schüssel ergibt etwa 18 Millionen Zellen, genug für zwei Fluoreszenz-Spektroskopie-Experimenten.
      1. Die Zellen wachsen bis sie 90-95 erreichen % confluency. Entfernen Sie die Medien, und spülen Sie die Zellen mit 15 mL pH 7.4 PBS. Fügen Sie 15 mL 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) mit PBS-Puffer und inkubieren Sie für 10 Minuten, die Zellen zu lösen. Übertragen Sie die Zellen auf 14 mL Falcon Rundrohre unten
   3. Zellen mit Trypan blau und ein Hemocytometer mit einem inversen Mikroskop zählen, und berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen und die Lautstärke der Medien benötigt um 7,5 Millionen Zellen pro 1,8 mL Volumen zu erreichen des Mediums. Zentrifugieren Sie die Zellen für 10 min bei 5310 × g. Dekantieren des Überstandes und fügen Sie das berechnete Volumen der BGSS. Aufschwemmen Sie Zellen sanft.
      1. Für diese Probe bereiten Stammlösungen von 40 mM Digitonin in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), 1 mM Calcium Green-5N in H ₂ O und 10 mM CaCl ₂ in H ₂ O. [Ru]-Stammlösungen, in reinem Wasser zubereitet, können reichen von 1-3 mM.
         ​ Hinweis: Calcium Green-5N ist lichtempfindlich. Im Dunkeln lagern und Lichteinfall minimieren.
   4. Setup die Fluorimeter zur Anregung im 506 nm und lesen die Emission bei 532 nm mit der Küvettenhalter kontrolliert bei 37 ° C. Prepare eine Acryl Küvette mit einer Stir Bar oder Rad, 1,8 mL Zellsuspension aus 1.5.2 über 1,8 µL Digitonin Lösung, 3.6 & #181; L-Calcium Green-5N (Lösung) und 9 µL [Ru] (für Stammlösung 1 mM, 5 µM Endkonzentration). Inkubieren Sie Zellen für 15 min in die Fluorimeter.
      1. Lesen die Daten als Anregung/Emission Verhältnis statt der rohen Absorption. Diese Praxis minimiert Fehler mit Schwankungen in der Intensität der Lichtquelle verbunden.
      2. Die erste Probenanalyse in Ermangelung [Ru] die Wirkung des Zusatzes von CaCl ₂ auf die Reaktion der Zellen Messen durchführen.
      3. Begin Analyse auf die Fluorimeter mit den Einstellungen in 1.5.4 beschrieben. Warten Sie ca. 2 Minuten um eine stabile Emission Baseline festlegen, und fügen Sie 1,8 µL CaCl ₂ (10 µM Endkonzentration). Die Emissionsintensität steigen sofort auf die Zugabe von CaCl ₂ und wird dann im Laufe von Minuten vergehen, wie die Kalzium-Ionen die Mitochondrien geben. Warten Sie, bis der Zerfall beendet hat (≈ 5 min). Fügen Sie zusätzliche Kalzium Dunkleosteus an die mitochondriale Kalzium Aufnahme Antwort von Zellen, die nicht mit [Ru] behandelt bestimmen.
   5. In einem anderen Küvette mit 5 µM [Ru], wiederholen Sie den Versuch wie oben beschrieben in 1.5.4.3. Im Beisein der Inhibitor Emissionsintensität erhöhen, aber nicht zerfallen. Diese Feststellung bedeutet mitochondriale Calciumaufnahme blockiert.

Ergebnisse

Diese Methode beschreibt, eine Synthese der mitochondrialen Kalzium Aufnahme-Hemmer [(OH-₂) (NH₃)₄Ru (µ-O) Ru (NH₃)₄(OH-₂)] Cl₅ ab [Ru (NH₃)₅Cl] Cl₂, eine bekannte ruthenium(III) Ausgangsmaterial. [Ru (NH₃)₅Cl] CL₂ zeichnet sich durch IR-Spektroskopie mit Schwingungs-Modi bei 3200 cm^-1, 1608 cm^-1und 1298 cm^-1798 cm...

Diskussion

Die mitochondriale Kalzium Aufnahme-Hemmer [(OH-₂) (NH₃)₄Ru (µ-O) Ru (NH₃)₄(OH-₂)] Cl₅ kann synthetisiert [Ru (NH₃)₅Cl] Cl₂, ein bekannter ruthenium(III) Ausgangsmaterial, wie in diesem Verfahren beschrieben. Die Synthese von [Ru (NH₃)₅Cl] Cl₂ gelingt leicht mit wenig Schwierigkeiten. Nach dem Rühren RuCl₃ für 16 h in Hydrazin Hydrat, der pH-Wert der Lösung sollte a...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ruthenium Trichloride hydrate	Pressure Chemical	3750
Concentrated hydrochloric acid	J.T. Baker	9535
Concentrated ammonium hydroxide	Mallinckrodt Chemical Works	A669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 Mesh	Alfa Aesar	13945
Calcium Green 5N	Invitrogen	C3737
Digitonin	Aldrich	260746
DMSO	Aldrich	471267
EGTA	Aldrich	E3889
KCl	USB	20598
KH2PO4	Aldrich	P3786
MgCl2	Fisher Scientific	M33-500
HEPES	Fluka	54466
Sodium Succinate	Alfa Aesar	33386
EDTA	J.T. Baker	8993-01
Glucose	Aldrich	G5000
200 Round bottom flask	ChemGlass	CG-1506-14
Glass stopper	ChemGlass	CG-3000-05
10 mm x 15 cm glass column with reservoirs	Custom - similar to Chemglass columns	Similar to CG-1203-20
DMEM	Corning	10-017-CV
FBS	Gibco	10437028
PBS	Corning	21-040-CV
Round bottom Falcon tubes	Fisher Scientific	14-959-11B
500 cm2 petri dishes	Corning	431110
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	15250061
Hemacytometer	Aldrich	Z359629
Acrylic Cuvettes	VWR	58017-875
UV-Vis spectrometer	Agilent Model Cary 8454
Spectrofluorimeter	SLM Model 8100C
IR spectrometer	Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment
Centrifuge	ALC Model PM140R
Inverted light microscope	VWR	89404-462