一个简单的荧光记者的检测方法, 用于识别蓖麻毒素所需的细胞成分 a 链 (贸易协定) 贩运酵母

摘要

在手稿中, 我们描述了使用模型荧光记者分析, 以确定涉及的细胞成分的贩运和杀伤过程中的毒素 a 亚基的植物毒蓖麻。

摘要

细菌和植物 A/B 毒素利用真核细胞的自然贩运途径达到其在胞的细胞内目标, 并最终杀死。这种/B 类毒素一般由酶活性 Asubunit (如、蓖麻毒素 A ()) 和一个或多个细胞结合 Bsubunit (s) 组成, 后者负责对特定细胞表面受体的毒素结合。我们目前对甲乙毒素如何能有效地令人陶醉的细胞的知识帮助科学家了解基本的细胞机制, 如吞和细胞内蛋白在更高的真核细胞中排序。从医学的角度来看, 同样重要的是要找出主要的毒素贩运路线, 为病人找到适当的治疗方案, 或最终发展治疗毒素的癌症治疗应用。

由于对哺乳动物细胞的 a/b 毒素贩运的全基因组分析是复杂、耗时和昂贵的, 因此在酵母模型生物体酿酒酵母中进行了关于 a/b 毒素转运的几项研究。尽管不那么复杂, 酵母和高真核细胞中的基本细胞过程是相似的, 而且在酵母中获得的结果往往可以转移到哺乳动物的情况。

在这里, 我们描述一个快速和易于使用的记者化验分析的细胞内贩运的酵母。这种新的检测方法的一个重要优点是, 不仅有机会从内质网 (er) 中研究胞, 而且从细胞膜到 ER 的吞和逆行毒素的转运。该分析利用了一个记者质粒, 允许间接测量在体内的绿色荧光蛋白 (GFP) 的荧光发射后,在活体翻译。由于贸易协定有效地防止了蛋白质生物合成的 28S rRNA depurination, 这一分析可以通过检测荧光发射的变化来识别细胞内的细胞间贸易中所涉及的宿主细胞膜蛋白。

引言

由毒素产生菌感染的病人是每个社会保健系统的严重的医疗和经济负担, 特别是因为有效的治疗治疗仍然很大程度上缺失。为了发展新的治疗策略, 在医学上相关的 a/b 毒素, 如霍乱毒素, 志贺毒素, 或蓖麻毒的复杂中毒机制, 需要在分子水平上充分了解, 基于新的强有力的化验, 必须实施。

近年来, 一些研究试图通过使用耗时和成本密集型的方法, 如放射性毒素标记^1,2以及 siRNA-based 筛选来分析酵母和哺乳动物细胞中的 a/b 毒素转运接近³。在某些情况下, 毒素贩运已被可视化的在体内荧光显微镜后, 与荧光, 量子点, 或荧光蛋白的单个毒素亚基的化学和/或遗传耦合^4,5。不幸的是, 这种修改往往导致不活泼和/或改变的自然性质的毒素。另一种可以间接回答各种科学问题的优雅方法是使用基于酶的记者系统, 如lacZ、荧光或荧光蛋白 (如GFP 或Discosoma sp. 红色荧光蛋白 (dsRed))。

在这篇手稿中, 一个简单的协议被描述为 extracellularly 在S. 酿酒酵母中的细胞内传输所需的细胞成分进行识别。因此, 荧光-报告质粒含有一个 N 终端 ER 输入信号, 其次是 gfp 作为蛋白质生物合成传感器, 这间接地测量了在体内的 gfp 荧光发射后的蛋白质的翻译抑制. 翻译⁶。如果与野生型相比, 在特定的酵母缺失突变体中, 吞和/或胞内贩运是消极的 (或积极的), 这可以通过 GFP 荧光发射的增加 (或减少) 检测⁶。

目前, 所有分析酵母细胞中的区域内转运的方法都被限制在 ER-to-cytosol 的转运过程中。在这样的人工系统中, 含有 ER 输入信号的含氟贸易协定是由一个可诱导的启动子表达的, 导致自杀型表现为^1,7。虽然在本手稿中所描述的实验装置中, 蓖麻蛋白的细胞结合 B 亚基同样缺失, 因此, 不完全代表蓖麻毒素 holotoxin 中毒的自然情况⁸, 从等离子体中运毒膜通过高尔基体对 ER 的仪器可以与这种新的检测严密模仿。有趣的是, 在试点研究中取得的初步结果表明, 贸易协定所使用的贩运途径显示出与蓖麻毒 holotoxin 的中毒路线有惊人的相似之处。

总之, 所描述的方法可以用来确定特定的作用, 选择细胞蛋白在吞和贩运酵母。此外, 这种实验装置可以很容易地适应其他的核糖体灭活毒素产生和分泌的各种酵母和细菌物种, 如 zymocin 或志贺毒素。

研究方案

注意: 一般实验工作流的概述如图 1所示。

警告: 对人类来说, 贸易协定是剧毒的。安全实验室许可 S2 (生物安全等级2当量) 是必要的。在整个实验中请戴上手套。

1. 在大肠杆菌中他标记的异种的异源表达

1. 用表达质粒 pET24-RTA_{(其) 6}或空向量 pET24a⁽⁺⁾使用标准的电穿孔协议^9,10转换大肠杆菌单元格。含有空质粒的细胞充当阴性对照。
2. 在含有卡那霉素的阳性克隆 (100 µg/毫升) lb 板后, 在5毫升_kan培养基 (lb 培养基与100µg/毫升卡那霉素) 中接种含有区域内表达质粒或空向量的细胞, 并在37° c 和 220 rpm 下孵育 24 h。
3. 补充 1 L LB_坎培养基与5毫升培养和孵育细胞在37° c 和 220 rpm 直到细胞达到了 OD₆₀₀ 0.8-1.0 (大约 3-4 h)。此后, 将培养温度降低到28° c, 并在 H₂O 中准备1米的 isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 库存解决方案。
4. 通过在1毫米的最终浓度中加入 IPTG, 诱导大肠杆菌的表达。
5. 在 3.5 h 在28° c 和220转每分钟, 收获细胞由离心在 1万 x g 和4° c 为 10 min, 洗涤药丸二次以5毫升的捆绑缓冲 (500 毫米氯化钠, 10 毫米咪唑, 并且20毫米在₂PO₄, pH = 7.4) 在 1万 x g 和4° c 为 10 min, 和重颗粒在5毫升结合缓冲器。
   注意: 协议在这个阶段可以暂停, 并且细胞可以被存放在80° c 几天。

2. 通过亲和层析纯化其标记的贸易量

1. 几种细胞在冰使用以下协议: 十五年代脉冲 (20 微米), 三十年代暂停。重复此步骤五次。
2. 离心分离器在 2.1万 x 和4° c 为15分钟和过滤上清液使用无菌注射器过滤系统 (0.2 µm 孔大小)。
   注: 成功声样品的细胞颗粒显示透明边框。
3. 使用配备了5毫升 Ni^{2 +}的亲和柱的自动净化系统, 从未消毒的过滤后的大肠杆菌上清纯化其标记的含量。一般而言, 使用1毫升/分钟的洗脱速度, 冷却整个净化系统, 以防止效率毒素的结合和毒素活性的丧失。
   注意: 在表 1中列出了有效的贸易协定净化参数。参见贝克尔et al。有关详细信息,⁹。
   1. 简单地, 用 20 mL 的绑定缓冲区平衡关联列来删除存储缓冲区。用注射器将无菌过滤的上清液涂抹在亲和柱上。
   2. 用25-35 毫升的结合缓冲器清洗柱, 从柱上移除未绑定的蛋白质。执行洗涤步骤, 直到 280 nm 的紫外线吸收接近初始 uv 值。
   3. 洗在20-35 毫升的洗脱缓冲液 (500 毫米咪唑, 500 毫米氯化钠, 20 毫米,₂PO₄, pH = 7.2), 并保持样品在冰上 (图 2A和图 2B)。
      注: 在紫外线吸收的情况下, 该组分的洗脱率明显增加。请注意, 专门收集这个分数, 以防止污染与非特异性结合蛋白。
   4. 使用20µL 洗样品执行马斯亮蓝色染色¹¹或西方印迹分析^12,13 (可选)。使用初级抗他的抗体 (1:1, 000) 和第二 anti-mouse-IgG-HRP (1:10,000) 来检测和验证样品纯度 (图 3)。
   5. 淡化洗在5毫升脱盐柱和平衡样品中的0.8 米山梨醇中的含量。
      1. 用脱盐柱取代纯化系统的亲和柱, 先平衡20毫升0.8 米山梨醇的柱。
      2. 通过注射器将洗的比例分数应用到柱子上。当紫外线吸收开始增加 (图 2C) 时, 用100毫升0.8 米山梨醇和洗的盐水在15毫升管中清洗该柱。
      3. 在4° c 下贮存洗的含量。
         注: 当电导增加时, 直接停止含盐量的分数取样, 以避免盐分污染。脱盐过程的参数列于表1。
4. 将洗 1万 x g 和4° c 的30-180 分钟集中度用 10 kDa 截止自旋柱到1-2 毫升的最终体积, 并在4° c 下储存样品3-4 周。
   警告: 不要冻结样品, 因为冷冻会导致整个贸易协定活动的完全丧失。
5. 使用常规蛋白质测定试剂盒确定蛋白质浓度。蛋白质浓度应在 1-1. 5 毫克/毫升的范围内。
   注: 如果蛋白质浓度太高 (#62; 5 毫克/毫升), 就会沉淀。

3. 酵母转化和细胞壁去除

1. 利用 gfp 报告质粒 pRS315-K28_SP-gfp⁶使用标准醋酸锂转化方法¹⁴转换野生型或选定的酵母缺失突变体。在0.087% ° c 下孵育亮氨酸辍学 (d-/o) 葡萄糖板 (2% 葡萄糖, 1.5% 琼脂, 0.5% 硫酸铵, 0.17% 酵母氮基 (YNB) 和30的无亮氨酸混合) 的细胞, 用于阳性克隆选择的2-3 天。
2. 从每个板块挑选3不同的酵母克隆, 在100毫升的亮氨酸糖培养基中接种克隆 (2% 糖, 0.5% 硫酸铵, 0.17% YNB 和0.087% 的无亮氨酸的混合, 在 220 rpm 和30° c 到 OD₆₀₀ = 1.0-2.0 (2-4 x 10⁷细胞/毫升)。
   注意: 不同酵母缺失菌株的细胞生长是不同的。通过分光光度计监视 OD₆₀₀ 。
3. 要计算 od₆₀₀值, 请将样本稀释到 od₆₀₀ = 0.1-0.3 (1:5 到1:10 稀释), 并在分光光度计中测量外径₆₀₀ 。作为参考, 使用 H₂o 辅以相应数量的亮氨酸 raffionose 培养基。

最后, 重 OD₆₀₀ = 125 在5毫升的无菌水 (5 x 10⁸细胞/毫升)。

离心细胞在25° c 为 5 min 在 1万 x g, 洗涤细胞两次与5毫升无菌水, 和重细胞在50毫升 spheroplasting 缓冲 (0.8 米山梨醇, 10 毫米三盐酸 (pH 7.5), 10 毫米 CaCl₂, 2 毫米糖 (德勤), 和200µg/毫升溶解酶)。

孵育50毫升培养在 100 rpm 和30° c 为 90 min. 可选: 每15分钟监测 spheroplast 形成的相衬显微镜。在显微镜下, 细胞应该有一个深半透明的灰色颜色。明亮 (折光) 细胞没有充分地被消化, 而鬼魂 (苍白灰色细胞与少许, 如果任何, 内部结构) 是 over-digested 的。

检查每个样品的 spheroplast 制备效果。

1. 完成步骤3.5 后, 混合4µL 的 spheroplasted 50 mL 文化与496µL spheroplasting 缓冲区 (约 2 x 10⁶原生质) 和离心机为10分钟 400 x g。
2. 重颗粒在10毫升 H₂O 蒸馏, 漩涡样品三十年代, 和板材出10µL 的样品上亮氨酸 d-/O 葡萄糖板 (2% 葡萄糖, 1.5% 琼脂, 0.5% 硫酸铵, 0.17% YNB, 和0.087% 的 d/o 混合没有亮氨酸)。
3. 孵育细胞3天在30° c。计算板上生长细胞菌落总数。对于数据评估, 只使用效率高于98% 的样本 (总细胞菌落数和 #60; 40 殖民地/板块)。

离心机细胞从步骤3.5 在 400 x g 和4° c 为10分钟和洗涤细胞两次与5毫升稳定亮氨酸 d/o 糖培养基 (0.8 M 山梨醇, 2% 糖, 0.5% 硫酸铵, 0.17% YNB, 和0.087% 辍学混合没有亮氨酸)。重细胞在5毫升稳定的亮氨酸 d/o 糖培养基 (1 x 10⁸细胞/毫升), 并直接使用细胞的 GFP 记者化验测量 (4 节)。

4. GFP 报告仪测定96井板

1. 将步骤3.7 中获得的酵母细胞原生质成 96-井板 (200 µL/井)。
2. 添加70µL 稳定的亮氨酸 d/o 糖培养基含有负控制 (洗的镍^{2 +}亲和纯化细胞裂解 IPTG 诱导的大肠杆菌细胞表达空矢量) 或纯化的区域贸易协定在最后的贸易量集中5µM ( 对应于每井160克/升)。
3. 立即添加30µL 稳定的半乳糖溶液 (30% 半乳糖, 0.8 米山梨醇), 以诱导 GFP 的表达, 并随后开始测量。
   注: 每次试验至少进行3技术复制, 每株酵母菌3次生物复制。
4. 完成样品制备后 (步骤 4.1-4.3), 把 96-井板在一个荧光阅读器, 并开始测量。使用 GFP 荧光检测所需的 475/509 nm 过滤器集。执行测量在30° c, 120 转每分钟, 并且以震动直径1毫米在时间窗口 20 h (测量的区间 10 min)。
   注意: GFP 过滤器集通常在所有读卡器系统中都可用。温度、时间窗、测量间隔和浓度可根据自身需要进行调整。有代表性的结果如图 4所示。
5. 可选: 在质量控制的测量中使用额外的内部控制。通过添加30µL 稳定亮氨酸 d/o 糖培养基而不是30% 半乳糖 (无 GFP 诱导) 来准备负控制。此外, 添加70µL 0.8 米山梨醇稳定 G418 溶液 (300 µg/毫升)。蛋白质翻译抑制剂 G418 作为积极控制蛋白质抑制, 因为它防止 GFP 在酵母表达。
6. 根据以下公式计算 20 h 时间点的相对 GFP 荧光百分比 (请参见图 4A): 其中 NC 为负控件
   1. 另外, 确定相对 GFP 荧光为每个测量点 (在这种情况下 10 min, 也参见步骤 4.4) 使用上述等式。如图 4B所示, 通过在时间 (x 轴) 上印迹 GFP 荧光强度 (y-axis) 来创建图形。

结果

本手稿中所描述的协议的一般工作流程在图 1中作了说明, 大致总结了成功的贸易协定纯化和随后的 GFP 报告实验的单一步骤。可以在协议中找到每个单独步骤的更详细的描述。图 2说明了通过亲和层析 (图 2A) 和空矢量控件 (图 2B) 成功进行的贸易协定净化的预期结果。...

讨论

在执行上述协议时, 我们建议以下建议, 以取得成功的实验结果。

对于异源蛋白的表达, 重要的是不超过 IPTG 浓度的1毫米。IPTG 的浓度和 #62; 1 mM 抑制启动子诱导的贸易量表达, 导致毒素产量降低。此外, 细胞不应在高于28° c 的温度下培养, 以防止包涵体形成、低效折叠和毒素失活。在较低的温度 (例如, 20-28 ° c) 是可能的, 也导致生物活性毒素的生产。然而, 额外的温度降...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial and yeast strains
E. coli BL21 DE3(Gold)	Aligent Technologies	230130
S. cerevisiae BY4742	Euroscarf	Y10000
S. cerevisiae BY4742 deletion mutants	Dharmacon	YSC1054	whole collection
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids used in this protocol
pET24a(+) (Novagen)	Millipore	69772-3
pET-RTA(His6)	Becker et al. (2016)3
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Zymolyase 20T	USBio	Z1000.250	lytic enzyme for cell wall removal
LB broth medium	Thermo Scientific	10855021	15 g agar was added for plate production
YNB	Thermo Scientific	DF0335-15-9
Ammonium sulfate	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Yeast drop-out mix supplemts without leucine	Sigma-Aldrich	Y1376-20G
Agar	Sigma-Aldrich	05040-100G
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
DTT	Sigma-Aldrich	10197777001
D-raffinose	Sigma-Aldrich	83400-25G
D-sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-1KG
D-galactose	Sigma-Aldrich	G0750-10MG
G418	Thermo Scientific	11811031
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Imidazole	Roth	3899.1
PAGE ruler prestained	Fermentas	26616	protein ladder used for Western analysis
Name	Company	Catalog Number	Comments
Material for RTA purification, desalting and reader measurements
Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		old model, other models available
Fluoroskan Ascent	Thermo Scientific	5210470	old model, not available anymore
ÄKTAPurifier	Thermo Scientific	28406266	Product is discontinued and replaced
HisTRAP HP column	GE Healthcare	17-5248-02
HiTRAP desalting column	GE Healthcare	11-0003-29
Midisart sterile filter	Sartorius	16534K	0.2 µm pore size
BCA protein assay kit	Pierce	23225
660 nm assay kit	Thermo Scientific	22660
96 well plates	Thermo Scientific	260860
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies (optional)
Anti-Tetra-His	Qiagen	34670	primary antibody; 1:1,000 dilution
Anti-mouse-HRP	Sigma-Aldrich	A9044-2ML	secondary antibody, 1:10,000 dilution