Um ensaio simples repórter baseado em fluorescência para identificar componentes celulares necessários para toxina ricina uma cadeia (RTA) o tráfico de levedura

Resumo

O manuscrito, descreveremos o uso de um ensaio de repórter de fluorescência baseada em fermento para identificar componentes celulares envolvidos no tráfico e matar processos dos citotóxicos uma subunidade da ricina de toxina da planta (RTA).

Resumo

Bacteriana e planta A / toxinas B exploram os caminhos naturais de tráfico em células eucarióticas para alcançar seu alvo (s) intracelular no citosol e, finalmente, matar. Tal A / toxinas B consistem geralmente em um enzimaticamente ativo Asubunit (por exemplo, toxina ricina um (RTA)) e uma ou mais células vinculação Bsubunit(s), que é responsáveis por toxina vinculação específica de receptores de superfície da pilha. Nosso conhecimento atual de como A / B toxinas são capazes de intoxicante eficientemente células ajudados cientistas para entender os mecanismos celulares fundamentais, como a endocitose e proteína intracelular em células eucarióticas superiores. Do ponto de vista médico, é igualmente importante identificar as rotas de tráfico de toxina principais para encontrar soluções de tratamento adequado para pacientes ou eventualmente desenvolver aplicações terapêuticas baseadas em toxina para terapia do câncer.

Desde análises de todo o genoma da / toxina B tráfico em células de mamíferos é complexo, demorado e caro, vários estudos na / transporte de toxina B foram executadas no organismo modelo levedura Saccharomyces cerevisiae. Apesar de ser menos complexos, fundamentais processos celulares em leveduras e células eucarióticas superiores são semelhantes e muitas vezes os resultados obtidos no fermento podem ser transferidos para a situação dos mamíferos.

Aqui, descrevemos um ensaio rápido e fácil de usar do repórter para analisar o tráfico intracelular de RTA em levedura. Uma vantagem essencial do novo ensaio é a oportunidade de investigar não só RTA retrô-translocação do retículo endoplasmático (ER) no citosol, mas prefiro endocitose e toxina retrógrada de transporte da membrana plasmática no pronto-socorro. O ensaio faz uso de um repórter do que permite a medição indirecta de toxicidade de RTA através de emissão de fluorescência da proteína verde fluorescente (GFP) após a tradução na vivo . Desde que o RTA eficientemente impede a iniciação da biossíntese de proteínas por depurinação do rRNA 28S, este ensaio permite a identificação de proteínas de célula de acolhimento envolvidas no transporte intracelular de RTA através da detecção de alterações em emissão de fluorescência.

Introdução

Pacientes que sofrem de infecções pela toxina produzindo bactérias representam um fardo de médico e financeiro grave para cada sistema de saúde social, em particular desde tratamentos terapêuticos eficientes ainda são em grande parte faltando. Para desenvolver novas estratégias terapêuticas, os mecanismos complexos de intoxicação do clinicamente relevante A / toxinas B como toxina da cólera, toxina Shiga ou ricina precisam ser completamente compreendido a nível molecular, baseado no romance poderosos ensaios que devem ser implementadas.

Nos últimos anos, vários estudos tentaram analisar A / transporte de toxina B em leveduras e células de mamíferos usando métodos demorados e onerosos como toxinas radioactivas rotulagem^1,2 , bem como a triagem de siRNA-baseado aproxima-se³. Em alguns casos, toxina tráfico tem sido visualizada na vivo por microscopia de fluorescência após acoplamento químico e/ou genético de subunidades de toxina individual com fluorophores, pontos quânticos ou proteínas fluorescentes^4,5. Infelizmente, tais modificações muitas vezes levam a inativas e/ou alteradas propriedades naturais das toxinas. Outra maneira elegante de responder indiretamente uma grande variedade de questões científicas é a utilização de sistemas de repórter baseados em enzimas como lacZ, luciferase, ou proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP ou Discosoma sp. (proteína fluorescente vermelha dsRed)).

Neste manuscrito, um simples protocolo é descrito que identifica celulares componentes necessários para o transporte intracelular de RTA extracelularmente aplicada no S. cerevisiae. Desse modo, um plasmídeo de fluorescência-repórter contendo um sinal de N-terminal ER-importação seguido de GFP funciona como um sensor de biossíntese de proteínas, que mede indiretamente a inibição da tradução de proteínas mediada por RTA por GFP fluorescência emissão após in vivo tradução⁶. No caso que endocitose RTA e/ou tráfico intracelular é negativa (ou positiva) afetado em um mutante de levedura especial exclusão em relação ao tipo selvagem, isto pode ser detectado através de um aumento (ou diminuição) na GFP de emissão de fluorescência⁶.

Até agora, todos os métodos de análise de transporte de RTA em células de levedura foram restringidos ao processo de translocação retrô ER-para-citosol de RTA. Em um sistema artificial, RTA contendo um sinal de importação ER é expressa de um promotor inducible, resultando em um fenótipo suicida^1,7. Embora a célula de ligação B-subunidade de ricina desapareceu da mesma forma na instalação experimental descrita neste manuscrito e, assim, não totalmente representa a situação natural de ricina holotoxin intoxicação⁸, transporte de toxina do plasma membrana através do aparelho de Golgi ao pronto-socorro pode ser imitada estreitamente com este ensaio de romance. Curiosamente, os resultados preliminares obtidos no estudo piloto indicam que as vias de tráfico usadas pelo RTA revelam semelhanças marcantes com a via de intoxicação de ricina holotoxin.

Em resumo, o método descrito pode ser usado para determinar o papel específico das proteínas celulares selecionadas em endocitose RTA e do tráfico de levedura. Além disso, esta configuração experimental pode ser facilmente adaptada para outra Ribossoma inactivar as toxinas produzidas e secretadas de vários espécies de leveduras e bactérias como zymocin ou toxina Shiga.

Protocolo

Nota: Uma visão geral do fluxo de trabalho geral experimental é descrita na Figura 1.

Cuidado: RTA é altamente tóxico para os seres humanos. É necessário permissão do laboratório de segurança S2 (nível de biossegurança 2 equivalente). Por favor, use luvas durante todo o experimento.

1. heteróloga expressão de RTA com sua Tag em Escherichia coli

1. Transforme células de Escherichia coli com o expressão do plasmídeo pET24-RTA_{(seu) 6} ou o vetor vazio pET24a⁽⁺⁾ usando o padrão electroporation protocolos^9,10. Células contendo o plasmídeo vazio servem como um controle negativo.
2. Após a seleção de clones positivos em placas LB (100 µ g/mL) contendo canamicina, inocular as células contendo o plasmídeo de expressão RTA ou o vetor vazio no meio de_kan 5ml LB (LB médio com 100 µ g/mL de canamicina) e incubar a 37 ° C e 220 rpm por 24 h.
3. 1 LB L_kan média com a pré-cultura 5 mL de suplemento e incubar as células a 37 ° C e 220 rpm até células têm alcançado uma OD₆₀₀ de 0.8-1.0 (aproximadamente 3-4 h). Depois disso, reduza a temperatura de cultura a 28 ° C e prepare um 1 M de solução-mãe de isopropil-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) em H₂O.
4. Induzi a expressão de RTA da e. coli pela adição de IPTG para uma concentração final de 1 mM.
5. Depois de 3,5 h de 28 ° c e 220 rpm, com colheita de células por centrifugação a 10.000 x g e 4 ° C por 10 min, lave o pellet duas vezes com 5 mL de tampão de ligação (500 mM NaCl, imidazol 10 mM e 20 mM KH₂PO₄ pH = 7,4) em 10.000 x g e 4 ° C por 10 min e ressuspender pelota em 5 mL de tampão de ligação.
   Nota: O protocolo pode ser pausado, nesta fase, e as células podem ser armazenadas a 80 ° C por vários dias.

2. purificação de RTA com sua Tag através de cromatografia de afinidade

1. Proceda à sonicação células no gelo usando o seguinte protocolo: 15 pulso s (20 mícrons), 30 s de pausa. Repita essa etapa cinco vezes.
2. Centrifugue a célula lisada em 21.000 x g e 4 ° C por 15 min e filtrar o sobrenadante através de um sistema de filtro de seringa estéril (tamanho de poro de 0,2 µm).
   Nota: Pelotas de célula de amostras com sucesso lisadas mostram bordas transparentes.
3. Usar um sistema de purificação automatizados, equipado com um 5 mL Ni^{2 +}-com base em coluna de afinidade para purificar a fração RTA com sua Tag do filtrado estéril Escherichia coli sobrenadante. Em geral, use uma velocidade de eluição de 1 mL/min e fixe o sistema de purificação de todo para impedir a ligação da toxina não-eficiente e perda da atividade da toxina.
   Nota: Parâmetros para a purificação de RTA eficiente estão listados na tabela 1. Veja também Becker et al. para mais informações⁹.
   1. Brevemente, equilibrar a coluna de afinidade com 20 mL de tampão de ligação para remover o buffer de armazenamento. Aplica o sobrenadante filtrado estéril para a coluna de afinidade, usando uma seringa.
   2. Lave a coluna com 25-35 mL de tampão de ligação para remover as proteínas desvinculadas da coluna. Executar a etapa de lavagem até absorção UV em 280 nm aproxima-se o valor inicial de UV.
   3. Eluir acoplada fração RTA em 20-35 mL de tampão de eluição (imidazol 500 mM, 500 mM de NaCl, 20mm KH₂PO₄, pH = 7,2) e manter a amostra em gelo (Figura 2A e 2B figura).
      Nota: A eluição da fração RTA é marcada pelo aumento da absorção de UV. Por favor note para coletar exclusivamente esta fração para evitar a contaminação com proteínas acopladas inespecíficas.
   4. Usar 20 µ l de eluted amostras para realizar¹¹ de coloração de azul de Coomassie ou Western blot análise^12,13 (opcional). Use primário antisua anticorpos (1:1, 000) e secundária anti-mouse-IgG-HRP (01:10, 000) para detectar RTA e verificar a pureza da amostra (Figura 3).
   5. Do desalt eluted fração RTA em uma coluna do desalting 5ml e equilibrar a amostra em sorbitol de 0,8 M.
      1. Substituir a coluna de afinidade do sistema de purificação por coluna do desalting e primeiro equilibrar a coluna com 20 mL de sorbitol de 0,8 M.
      2. Aplica a fração RTA eluted à coluna através de uma seringa. Lavar a coluna com 100 mL de sorbitol 0,8 M e eluir a fração RTA demolhada em um tubo de 15 mL, assim como a absorção de UV começa a aumentar (Figura 2).
      3. Armazenar a fração RTA eluted a 4 ° C.
         Nota: Pare diretamente amostragem de fração RTA quando aumenta a condutância para evitar a contaminação de sal. Parâmetros para o procedimento do desalting estão listados na tabela 1.
4. Eluted fração RTA a 10.000 x g e 4 ° C por 30-180 min usando uma coluna de rotação de corte 10 kDa até um volume final de 1 a 2 mL de concentrar e armazenar a amostra a 4 ° C por 3-4 semanas.
   Cuidado: Não congele a amostra desde congelamento leva a uma perda completa da atividade de RTA.
5. Determine a concentração de proteína usando um kit de determinação de proteína convencional. Concentração de proteína deve ser na faixa de 1-1,5 mg/mL.
   Nota: RTA tende a precipitar-se a concentração de proteínas é muito alta (> 5 mg/mL).

3. transformação e remoção da parede celular de levedura

1. Transforme mutantes de exclusão de levedura selvagem-tipo ou selecionado com o GFP repórter do plasmídeo pRS315-K28_SP- GFP⁶ usando acetato de lítio padrão a transformação métodos¹⁴. Incubar as células no abandono leucina (d/s) placas de glicose (glicose 2%, ágar 1,5%, 0,5% de sulfato de amónio, 0,17% fermento nitrogênio Base (YNB) e mistura de 0,087% d/s sem leucina) a 30 ° C, por 2-3 dias para a seleção de clones positivos.
2. Escolha 3 fermento diferentes clones de cada prato e inocular os clones em 100 mL de meio de rafinose de d/s leucina (rafinose de 2%, 0,5% de sulfato de amónio, 0,17% YNB e misture sem leucina e 0,087% d/s) a 220 rpm e 30 ° C a OD₆₀₀ = 1,0-2,0 (2-4 x 10⁷ células/mL).
   Nota: O crescimento de células das diferentes exclusão cepas de leveduras é diferente. Monitor OD₆₀₀ através de um espectrofotômetro.
3. Para calcular valores de₆₀₀ OD, diluir as amostras para OD₆₀₀ = 0.1-0.3 (1:5 a 01:10 diluições) e medir OD₆₀₀ em um espectrofotômetro. Como referência, use H₂O, complementado com a quantidade correspondente de meio de raffionose de d/s leucina.

Finalmente, resuspenda OD₆₀₀ = 125 em 5 mL de água estéril (5 x 10⁸ células/mL).

Centrifugar as células a 25 ° C durante 5 min à 10.000 x g, lavar as células duas vezes com 5 mL de água estéril e ressuspender as células em 50 mL de tampão de spheroplasting (sorbitol de 0,8 M, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM CaCl₂, 2mm ditiotreitol (DTT) e a enzima lítica de 200 µ g/mL).

Incubar a cultura de 50 mL a 100 rpm e 30 ° C por 90 min. opcional: monitorar a formação do spheroplast cada 15 min por microscopia de contraste de fase. Sob o microscópio, células devem ter uma cor de cinza escura translúcida. Células de Bright (refractile) são insuficientemente digeridas, Considerando que os fantasmas (cinza pálida células com pouca ou nenhuma, estrutura interna) over são digeridos.

Verifica a eficácia de preparação do spheroplast para cada amostra.

1. Depois passo acabamento 3.5, misture 4 µ l da cultura spheroplasted 50 mL com tampão de spheroplasting µ l 496 (aproximadamente 2 × 10⁶ spheroplasts) e centrifugar durante 10 min a 400 g de x.
2. Ressuspender pelota em 10 mL de H₂O destilado, amostra de vórtice para 30 s e a placa para fora 10 µ l da amostra em placas de glicose de d/s leucina (2% de glicose, ágar 1,5%, 0,5% de sulfato de amónio, 0,17% YNB e mistura de 0,087% d/s sem leucina).
3. Incubar as células durante 3 dias a 30 ° C. Conte o número total de colônias de células crescidas na placa. Para a avaliação de dados, use apenas amostras com eficiência superior a 98% (total número de colônia de célula < 40 colônias/placa).

Centrífuga células da etapa 3.5 em 400 x g e 4 ° C para células de 10 min e lavar duas vezes com 5 mL estabilizados leucina d/s rafinose médio (0,8 M sorbitol, rafinose de 2%, 0,5% de sulfato de amónio, 0,17% YNB e 0,087% mistura de abandono sem leucina). Ressuspender as células em meio de rafinose 5ml leucina estabilizado d/s (1 x 10⁸ células/mL) e usar diretamente as células para as medições de ensaio de repórter GFP (secção 4).

4. GFP repórter ensaio medição em placas de 96 poços

1. Semente as spheroplasts de células de levedura obtidos na etapa 3.7 em placas de 96 poços (200 µ l/poço).
2. Adicionar 70 meio de rafinose d e/s de µ l de leucina estabilizado, contendo controle negativo (eluato de um Ni^{2 +}-afinidade purificada lisado celular de células induzida por IPTG Escherichia coli expressando o vetor vazio) ou purificada RTA em concentração final de 5 µM (RTA correspondente a 160 g/L RTA) em cada poço.
3. Imediatamente adicione 30 µ l estabilizado galactose solução (30% de galactose, sorbitol 0,8 M) para induzir a expressão de GFP e posteriormente iniciar a medição.
   Nota: Realizar no mínimo 3 repetições técnicas por experiência e 3 biológicos Replica por levedura.
4. Depois de terminar a preparação da amostra (etapas 4.1-4.3), coloquei a placa de 96 poços em um leitor de fluorescência e iniciar a medição. Use o filtro de 475/509 nm conjunto necessário para a deteção de fluorescência de GFP. Realize medições a 30 ° C, 120 rpm e com um tremendo diâmetro de 1 mm sobre uma janela de tempo de 20 h (medição em intervalos de 10 min).
   Nota: O conjunto de filtro GFP é normalmente disponível em todos os sistemas do leitor. Temperatura, janela de tempo, medindo intervalos e a concentração de RTA pode ser ajustada para as próprias necessidades. Resultados representativos são mostrados na Figura 4.
5. Opcional: Use controles internos adicionais na medição para controle de qualidade. Prepare um controlo negativo, acrescentando meio rafinose d e/s de leucina estabilizado de µ l de 30 em vez de 30% de galactose (sem indução de GFP). Além disso, adicione 70 µ l de solução de G418 de sorbitol estabilizado de 0,8 M (300 µ g/mL). O inibidor da tradução de proteínas G418 serve como controle positivo para inibição da proteína que impede a expressão de GFP no fermento.
6. Calcular a fluorescência de GFP relativa por cento por ponto de tempo de 20 h, de acordo com a seguinte equação (ver Figura 4A): onde NC é a do controlo negativo
   1. Em alternativa, determinar a fluorescência de GFP relativa para cada ponto de medição (neste caso 10 min, ver também passo 4.4) usando a equação acima. Como mostrado na Figura 4B, crie um gráfico borrando as intensidades de fluorescência de GFP (eixo y) ao longo do tempo (eixo x).

Resultados

O fluxo de trabalho geral do protocolo descrito neste manuscrito é ilustrado na Figura 1, aproximadamente, resumindo os passos simples para purificação de RTA bem sucedida e o experimento de ensaio de repórter GFP subsequente. Uma descrição mais detalhada de cada etapa individual pode ser encontrada no protocolo. A Figura 2 ilustra o resultado esperado de uma purificação de RTA bem sucedido por cromatografia de afinidade ...

Discussão

Ao executar o protocolo acima, recomendamos as seguintes sugestões para alcançar um resultado bem sucedido do experimento.

Para a expressão da proteína heteróloga, é importante para não exceder a concentração de IPTG de 1 mM. Concentrações de IPTG > 1mm inibir induzida pelo promotor expressão RTA e chumbo para reduzir a produção de toxina. Além disso, as células não devem ser cultivadas em temperaturas acima de 28 ° C para evitar a formação de corpo de inclusão, dobrad...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial and yeast strains
E. coli BL21 DE3(Gold)	Aligent Technologies	230130
S. cerevisiae BY4742	Euroscarf	Y10000
S. cerevisiae BY4742 deletion mutants	Dharmacon	YSC1054	whole collection
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids used in this protocol
pET24a(+) (Novagen)	Millipore	69772-3
pET-RTA(His6)	Becker et al. (2016)3
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Zymolyase 20T	USBio	Z1000.250	lytic enzyme for cell wall removal
LB broth medium	Thermo Scientific	10855021	15 g agar was added for plate production
YNB	Thermo Scientific	DF0335-15-9
Ammonium sulfate	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Yeast drop-out mix supplemts without leucine	Sigma-Aldrich	Y1376-20G
Agar	Sigma-Aldrich	05040-100G
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
DTT	Sigma-Aldrich	10197777001
D-raffinose	Sigma-Aldrich	83400-25G
D-sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-1KG
D-galactose	Sigma-Aldrich	G0750-10MG
G418	Thermo Scientific	11811031
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Imidazole	Roth	3899.1
PAGE ruler prestained	Fermentas	26616	protein ladder used for Western analysis
Name	Company	Catalog Number	Comments
Material for RTA purification, desalting and reader measurements
Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		old model, other models available
Fluoroskan Ascent	Thermo Scientific	5210470	old model, not available anymore
ÄKTAPurifier	Thermo Scientific	28406266	Product is discontinued and replaced
HisTRAP HP column	GE Healthcare	17-5248-02
HiTRAP desalting column	GE Healthcare	11-0003-29
Midisart sterile filter	Sartorius	16534K	0.2 µm pore size
BCA protein assay kit	Pierce	23225
660 nm assay kit	Thermo Scientific	22660
96 well plates	Thermo Scientific	260860
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies (optional)
Anti-Tetra-His	Qiagen	34670	primary antibody; 1:1,000 dilution
Anti-mouse-HRP	Sigma-Aldrich	A9044-2ML	secondary antibody, 1:10,000 dilution