Hücresel bileşenleri tanımlamak için basit Floresans tabanlı muhabir tahlil Risin toksin için Maya ticareti bir zincir (RTA) gerekli.

Özet

El yazması, bir maya tabanlı Floresans muhabir tahlil kaçakçılığı dahil ve bitki toksin Risin (RTA) bir alt birim sitotoksik süreçleri öldürmek hücresel bileşenleri tanımlamak için nasıl kullanılacağını açıklar.

Özet

Bakteriyel ve bitki A / B toksinler yararlanmak doğal ticaret yolları ökaryotik hücrelerde sitozol onların hücre içi isabet ulaşmak için ve en sonunda öldürmek için. Böyle A / B toksinler genellikle oluşur bir enzimatik etkin Asubunit (örneğin, "Risin" toksin (RTA)) ve bir veya daha fazla hücre için belirli bağlama toksin yüzey reseptörleri hücre için sorumlu olan Bsubunit(s), bağlama. Nasıl bizim mevcut bilgi A / B toksinler verimli endositoz ve intraselüler protein yüksek ökaryotik hücrelerde sıralama gibi temel hücresel mekanizmaları anlamaya yardımcı hücreleri bilim adamları sarhoş edici yetenekli. Tıbbi açıdan, aynı şekilde büyük toksin ticaret yolları hastalar için yeterli tedavi çözümleri bulmak veya sonunda kanser tedavisi için tedavi toksin tabanlı uygulamalar geliştirmek için tanımlamak önemlidir.

Beri genom çapında analizleri a / B toksin memeli hücrelerinde kaçakçılığı, zaman alıcı, karmaşık ve pahalı, çeşitli çalışmalarda a / B toksin taşıma Saccharomyces cerevisiaeMaya model organizma olarak gerçekleştirilen. Maya ve daha yüksek ökaryotik hücrelerin daha az karmaşık, temel hücresel süreçler olmasına rağmen çok sık Maya elde edilen sonuçlar ve vardır benzer memeli durumuna aktarılabilir.

Burada, hücre içi RTA Maya ticareti analiz etmek için hızlı ve kolay muhabir tahlil açıklayın. Yeni tahlil önemli bir avantajı sitozol sadece RTA retro-translocation endoplazmik retikulum (ER) üzerinden araştırmak için bir fırsattır, ama oldukça endositoz ve retrograd toksin acil servise plazma zarı taşıma. Tahlil geçici kullanma-in RTA toksisite Floresans emisyon yeşil flüoresan protein (GFP) aracılığıyla dolaylı ölçüm sağlar bir muhabir plazmid vivo içinde çeviri sonra. RTA verimli 28S rRNA depurination tarafından protein biyosentezi inisiyasyon önlediğinden bu tahlil konak hücre proteinleri tanımlaması değişiklikleri tespiti yoluyla hücre içi RTA ulaşım dahil Floresans emisyon sağlar.

Giriş

Etkili tedavi tedaviler hala büyük ölçüde eksik olduğundan hastalarda bulaşan bakteri üreten toksin tarafından her sosyal sağlık sistemi için ciddi bir tıbbi ve mali yük özellikle temsil eder. Yeni tedavi stratejileri, tıbben a karmaşık bağımlılık yapan maddeler mekanizmaları geliştirmek için / B toksinler kolera toksini, Shiga toksin veya "Risin" gibi tam olarak uygulanmalıdır roman güçlü deneyleri üzerinde dayalı moleküler seviyede anlaşılması gerekir.

Son yıllarda, birçok araştırma A analiz girişiminde / B toksin taşımacılığında Maya ve radyoaktif toksin gibi zaman alıcı ve maliyet yoğun yöntemleri kullanarak memeli hücreleri etiketleme siRNA tabanlı tarama yanı sıra^{1,2 3}yaklaşıyor. Bazı durumlarda, toksin kaçakçılığı Floresans mikroskobu tarafından görüntülenmeyecektir vivo içinde bireysel toksini alt birimleri fluorophores, kuantum nokta veya floresan proteinler^4,5ile kimyasal ve/veya genetik kaplin sonra olmuştur. Ne yazık ki, bu değişiklikler genellikle etkin olmayan ve/veya değiştirilmiş doğal özellikleri toksinler için yol. Enzim lacZ, luciferase veya floresan proteinler gibi temel muhabir sistemlerinin kullanımı dolaylı olarak çok çeşitli bilimsel sorular cevap vermenin başka bir zarif yolu yok (örneğin GFP veya Discosoma sp. kırmızı floresan protein () dsRed)).

Bu makale, basit bir protokol, extracellularly uygulanan RTA S. cerevisiaehücre içi taşıma gereken hücresel bileşenleri tanımladığı açıklanmıştır. Böylece, dolaylı olarak GFP Floresans emisyon tarafından sonra içinde vivo RTA-aracılı protein çeviri inhibisyon ölçen bir protein biyosentezi sensör GFP tarafından takip bir N-terminal ER-Mümessillik sinyal içeren bir floresan-muhabir plazmid görür çeviri⁶. RTA endositoz ve/veya hücre içi ticareti olumsuz (veya olumlu) etkilenir ki vahşi-türüne göre belirli Maya silme mutant içinde durumda bu bir artış (ya da azalmak) GFP Floresans emisyon⁶' tespit edilebilir.

Şimdiye kadar tüm yöntemleri Maya hücreleri RTA Ulaştırma analiz RTA ER sitozol retro-translocation sürecine sınırlandı. Böyle yapay bir sistemde, bir ER alma sinyali içeren RTA bir intihar fenotip^1,7' kaynaklanan bir indüklenebilir organizatörü üzerinden ifade edilir. B-alt "Risin" in birim bağlama hücre aynı şekilde bu el yazması açıklanan deneysel kurulumunda eksik ve böylece, tamamen doğal durum "Risin" holotoxin zehirlenme⁸, toksin taşıma plazma temsil etmiyor olsa da, membran acil servise Golgi aygıtı aracılığıyla yakından bu roman tahlil ile taklit. İlginçtir, pilot çalışmada elde edilen ilk sonuçlar RTA tarafından kullanılan ticaret yolları "Risin" holotoxin zehirlenme güzergahı ile çarpıcı benzerlikler ortaya gösterir.

Özet olarak, açıklanan yöntemi belirli bir rolü RTA endositoz seçili hücresel proteinler ve Maya kaçakçılığı belirlemek için kullanılabilir. Ayrıca, bu deneysel kurulumu kolayca diğer ribozom üretilen ve çeşitli Maya ve bakteriyel türler gibi zymocin veya Shiga toksin salgıladığı toksinler ihracı için adapte.

Protokol

Not: Resim 1' de genel deneysel iş akışı genel bakış tasvir edilir.

Dikkat: RTA insanlar için çok toksiktir. Emanet laboratuvar izni S2 (Biyogüvenlik seviye 2 eşdeğeri) gereklidir. Lütfen tüm deneme sırasında eldiven.

1. Contegra ifadesi O'nun öğesini RTA Escherichia coli olarak

1. E. coli hücreleri ifade plazmid pET24-RTA_{(onun) 6} veya standart elektroporasyon protokolleri^9,10kullanarak boş vektör pET24a⁽⁺⁾ ile dönüşümü. Boş plazmid içeren hücreler bir negatif kontrol hizmet vermektedir.
2. Seçimden sefaloridin içeren (100 µg/mL) LB plakalar üzerinde olumlu klonların sonra RTA ifade Plazmid ve 5 mL LB_kan orta (LB orta ile sefaloridin 100 µg/mL) boş vektörde içeren hücre aşılamak ve 37 ° C ve 24 saat için 220 devir/dakika, kuluçkaya.
3. 1 L LB_kan orta 5 mL öncesi kültür ile ek ve hücreleri 0.8-1.0 (yaklaşık 3-4 h) OD₆₀₀ gelinceye hücreleri 37 ° C ve 220 devir/dakika, kuluçkaya. Bundan sonra kültür sıcaklık 28 ° C için azaltmak ve 1 M H₂O. izopropil-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) stok çözüm hazırlamak
4. RTA ifade E. coli 1 mM son bir konsantrasyon IPTG ekleyerek teşvik.
5. 3.5 h 28 ° c ve 220 devir/dakika, hasat hücreleri tarafından Santrifüjü 10.000 x g ve 4 ° C'de 10 dakika, sonra iki kez ile 5 mL de bağlama arabellek (500 mM NaCl, 10 mM imidazole ve 20 mM KH₂PO₄ Pelet yıkama pH 7.4 =) 10.000 x g ve 10 dk ve resuspend Pelet 5 mL bağlama arabelleği için 4 ° C '.
   Not: Bu aşamada Protokolü duraklatılmış ve hücreleri 80 ° C'de için birkaç gün saklanabilir.

2. O'nun öğesini RTA benzeşme Kromatografi ile saflaştırılması

1. Hücreleri aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak buzda solüsyon içeren temizleyicide: 15 s darbe (20 mikron), 30 s Duraklat. Bu beş kez tekrarlayın.
2. Hücre lysate, 21,000 x g ve 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi ve steril enjektör filtre sistemi (0.2 µm gözenek boyutu) kullanarak süpernatant filtre.
   Not: Hücre granül başarıyla sonicated örnekleri şeffaf kenarlıklarını göster.
3. 5 mL ile Ni^{2 +}donatılmış bir otomatik arıtma sistemi kullanın-steril filtre E. coli süpernatant dan O'nun öğesini RTA kesir arındırmak için benzeşme sütun temel. Genel olarak, 1 mL/dk elüsyon hızını kullanın ve verimli olmayan toksin bağlayıcı ve toksin aktivite kaybı önlemek için tüm arıtma sistemi serin.
   Not: Verimli RTA arıtma için parametreleri Tablo 1' de listelenmiştir. Ayrıca bkz: Becker ve ark. daha fazla bilgi⁹için.
   1. Kısaca, benzeşim sütun bağlama arabellek depolama arabellek kaldırmak için 20 mL ile equilibrate. Bir Ģırınga kullanarak benzeşme sütuna süpernatant steril filtre uygulayın.
   2. Sütun bağlama arabellek sütundan ilişkisiz proteinler kaldırmak için 25-35 mL ile yıkayın. 280 Absorbans UV kadar çamaşır adımı gerçekleştirmeniz nm başlangıç UV değeri yakın olduğunu.
   3. Bağlı RTA kesir elüsyon arabellek 20-35 ml elute (500 mM imidazole, 500 mM NaCl, 20 mM KH₂PO₄, pH 7.2 =) ve örnek buz (şekil 2A ve şekil 2B) üzerinde tutun.
      Not: Elüsyon RTA fraksiyonunun UV emme bir artış tarafından işaretlenir. Unutmayın ki sadece spesifik olmayan ilişkili proteinler ile kontaminasyonu önlemek için bu kesir toplamak için.
   4. Eluted örnekleri 20 µL Coomassie mavi¹¹ veya Western blot analizi^12,13 (isteğe bağlı) Boyama gerçekleştirmek için kullanın. Birincil RTA algılamak ve örnek saflık (şekil 3) doğrulamak için anti-O'nun antikorlar (1:1, 000) ve ikincil anti-mouse-IgG-HRP (1:10, 000) kullanın.
   5. Eluted RTA kesir 5 mL desalting sütun desalt ve 0, 8 M sorbitol örnek equilibrate.
      1. Arıtma sistemi benzeşme sütun desalting sütun tarafından eski yerine koymak ve ilk sütun 0, 8 M sorbitol 20 mL ile equilibrate.
      2. Eluted RTA kesir bir şırınga ile sütun uygulanır. Sütun 0, 8 M sorbitol 100 mL ile yıkama ve UV emme (şekil 2C) artmaya başlar başlamaz desalted RTA kesir bir 15 mL tüp elute.
      3. Eluted RTA kesir 4 ° C'de depolayın
         Not: tuz kirlenmesini önlemek için gürültülerinden artırır doğrudan RTA kesir örnekleme durdurur. Desalting yordam parametreleri tablo 1'de listelenmiştir.
4. Eluted RTA kesir 10.000 x g ve 4 ° C'de 30-180 dk 10 kDa kesme spin sütun için 1-2 mL son hacmi kullanarak için konsantre ve örnek 4 ° C'de 3-4 hafta için saklayın.
   Dikkat: RTA etkinlik tam bir kaybına yol açar dondurma beri örnek dondurma değil.
5. Bir geleneksel protein tayini kit kullanarak protein konsantrasyonu belirlemek. Protein konsantrasyonu 1-1.5 mg/mL aralığında olmalıdır.
   Not: RTA protein konsantrasyonu çok yüksek ise çökelti eğilimi (> 5 mg/mL).

3. Maya dönüştürme ve hücre duvarı kaldırma

1. Vahşi-türü veya seçili Maya silme mutantlar standart lityum asetat dönüştürme yöntemleri¹⁴kullanarak GFP muhabir plazmid pRS315-K28_SP- GFP⁶ ile dönüşümü. Hücreleri lösin drop-out (d/o) üzerinde kuluçkaya olumlu klon seçim için 2-3 gün için 30 ° C'de glikoz tabak (% 2 glikoz, %1,5 agar, % 0.5 amonyum sülfat, %0,17 Maya azot Bankası (YNB) ve %0.087 d/o mix lösin olmadan).
2. 3 farklı Maya klonlar her plaka almak ve 220 devir/dakika ve 30 ° C-OD₆₀₀ lösin d/o raffinose orta (%2 raffinose, % 0.5 amonyum sülfat, %0,17 YNB ve %0.087 d/o lösin mix) 100 ml klonlar aşılamak 1.0-2.0 = (2-4 x 10⁷ hücre/mL).
   Not: Hücre büyümesini farklı Maya silme suşlarının farklıdır. OD₆₀₀ bir Spektrofotometre ile izleyin.
3. OD₆₀₀ değerleri hesaplamak için seyreltik örnekleri OD₆₀₀ 0,1-0,3 = (1:5-1:10 dilutions) ve OD₆₀₀ bir Spektrofotometre ölçmek. H₂O lösin d/o raffionose orta karşılık gelen tutarı ile desteklenmiş başvuru olarak kullanın.

Son olarak, OD₆₀₀ resuspend 125 5 ml steril su (5 x 10⁸ hücre/mL) =.

Santrifüj kapasitesi 10.000 x g de 5 min için 25 ° C'de hücreler, hücre iki kez 5 mL steril su ile yıkayın ve 50 mL spheroplasting arabellek hücrelerde resuspend (0,8 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM CaCl₂, 2 mM dithiothreitol (DTT) ve 200 µg/mL litik enzim).

50 mL kültür 100 devir/dakika ve 30 ° C 90 dk. isteğe bağlı için kuluçkaya: faz kontrast mikroskobu tarafından spheroplast oluşumu her 15dk izlemek. Mikroskop altında hücreler koyu şeffaf gri renk olmalıdır. Bright (refractile) hücreleri yeterince sindirilmiş, oysa hayaletler (soluk gri hücreleri küçük, varsa, iç yapısı ile) aşırı sindirilir.

Spheroplast hazırlık etkinliği her örnek için kontrol edin.

1. Bitirme adım 3.5, spheroplasted 50 mL kültürünün 4 µL 496 µL spheroplasting arabellek (yaklaşık 2 × 10⁶ spheroplasts) ile karıştırın ve santrifüj kapasitesi 400 x g de 10 dakika sonra.
2. 10 mL H₂O resuspend Pelet distile, girdap örnek 30 s ve plaka 10 µL lösin d/o glikoz plakaları (% 2 glikoz, %1,5 agar, % 0.5 amonyum sülfat, %0,17 YNB ve %0.087 d/o mix lösin olmadan) örneğinin dışarı için.
3. Hücreleri 30 ° C'de 3 gün kuluçkaya Yetişkin hücre kolonileri plaka üzerinde toplam sayısını saymak. Veri değerlendirme için 98 daha yüksek verimliliği ile sadece örnekleri kullanır (Toplam hücre koloni < 40 kolonileri/plaka).

Santrifüj stabilize hücrelerden adım 3.5 g ve iki kez 5 mL içeren 10 dk ve yıkama hücreler için 4 ° C x 400 lösin d/o raffinose orta (0,8 M sorbitol, % 2'raffinose, % 0.5 amonyum sülfat, %0,17 YNB ve %0.087 bırakma mix lösin olmadan). 5 mL stabilize lösin d/o raffinose orta (1 x 10⁸ hücre/mL) hücrelerde resuspend ve doğrudan hücre GFP muhabir tahlil ölçülerini (Bölüm 4) kullanın.

4. GFP muhabir tahlil ölçüm 96-şey plakaları

1. Tohum dışarı adım 3.7 96-şey tabak (200 µL/de) içine elde Maya hücre spheroplasts.
2. 70 µL stabilize lösin d/o raffinose orta negatif kontrol içeren eklemek (eluate bir Ni^{2 +}-benzeşme arıtılmış lysate hücre boş vektör ifade E. coli IPTG kaynaklı hücrelerden) veya RTA 5 µM (son RTA konsantrasyon içinde saf 160 g/M'ye RTA karşılık gelen) her şey içinde.
3. Hemen GFP ifade ikna etmek ve daha sonra ölçüm başlatmak için 30 stabilize µL galaktoz çözüm (% 30 galaktoz, 0, 8 M sorbitol) ekleyin.
   Not: deney başına en az 3 teknik çoğaltır gerçekleştirmek ve Maya zorlanma 3 Biyolojik çoğaltır.
4. Numune Hazırlama (adımları 4.1-4.3), Floresans Reader'da 96-şey plaka koymak ve ölçüm başlatmak sonra. GFP Floresans algılama için gerekli ayarla 475/509 nm filtre kullanın. Ölçümler 30 ° c, 120 rpm ve sallayarak çapı 1 mm 20 h (10 dk aralıklarla ölçüm) bir zaman penceresi üzerinde gerçekleştirin.
   Not: Normalde tüm okuyucu sistemlerinde GFP filtre kümesi kullanılabilir. Sıcaklık, ölçüm aralıkları ve RTA konsantrasyon zaman penceresini kendi ihtiyaçları için ayarlanabilir. Temsilcisi sonuçları şekil 4' te gösterilmiştir.
5. İsteğe bağlı: kalite kontrol ölçüm ek iç denetimlerini kullanın. Bir negatif kontrol 30 µL stabilize lösin d/o raffinose orta yerine % 30 galaktoz (GFP indüksiyon) ekleyerek hazırlayın. Buna ek olarak, 70 µL 0,8 M stabilize sorbitol G418 çözüm (300 µg/mL) ekleyin. Maya ifadede GFP engeller gibi protein çeviri inhibitörü G418 protein inhibisyonu için pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir.
6. Yüzde 20 h saat noktası göre aşağıdaki denklemi için göreli GFP Floresans hesaplamak (bkz. şekil 4A): nerede NC negatif kontrol olduğunu
   1. Alternatif olarak, her ölçüm için göreli GFP Floresans belirlemek (Ayrıca bkz: adım 4.4 Bu durumda 10 min) Yukarıdaki denklem kullanarak. Şekil 4B' de gösterildiği GFP Floresans yoğunluklarda (y ekseni) Zaman içinde (x ekseni) kurutma tarafından bir grafik oluşturun.

Sonuçlar

Kabaca başarılı RTA ve sonraki GFP muhabir tahlil deney için tek adımları özetleyen Resim 1, bu el yazması açıklanan Protokolü'nün genel iş akışı gösterilmektedir. Tek tek her adım daha ayrıntılı bir açıklamasını iletişim kuralında bulunabilir. Şekil 2 bir başarılı RTA arıtma beklenen sonucu benzeşme Kromatografi (şekil 2A) ve boş vektör kontrolü (

Tartışmalar

Yukarıdaki Protokolü gerçekleştirirken, biz deneme başarılı bir sonuç elde etmek için aşağıdaki önerileri öneririz.

Kapaklı protein ifade için 1 mM IPTG konsantrasyonu aşmayacak şekilde önemlidir. IPTG konsantrasyonları > 1 mM inhibe organizatörü kaynaklı RTA ifade ve toksin verimleri düşürmek için kurşun. Ayrıca, hücreleri 28 ° C eklenmesi vücut oluşumu, verimsiz katlama ve toksin inactivation önlemek için daha yüksek sıcaklıklarda ekili olmamalıdır...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial and yeast strains
E. coli BL21 DE3(Gold)	Aligent Technologies	230130
S. cerevisiae BY4742	Euroscarf	Y10000
S. cerevisiae BY4742 deletion mutants	Dharmacon	YSC1054	whole collection
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids used in this protocol
pET24a(+) (Novagen)	Millipore	69772-3
pET-RTA(His6)	Becker et al. (2016)3
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Zymolyase 20T	USBio	Z1000.250	lytic enzyme for cell wall removal
LB broth medium	Thermo Scientific	10855021	15 g agar was added for plate production
YNB	Thermo Scientific	DF0335-15-9
Ammonium sulfate	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Yeast drop-out mix supplemts without leucine	Sigma-Aldrich	Y1376-20G
Agar	Sigma-Aldrich	05040-100G
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
DTT	Sigma-Aldrich	10197777001
D-raffinose	Sigma-Aldrich	83400-25G
D-sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-1KG
D-galactose	Sigma-Aldrich	G0750-10MG
G418	Thermo Scientific	11811031
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Imidazole	Roth	3899.1
PAGE ruler prestained	Fermentas	26616	protein ladder used for Western analysis
Name	Company	Catalog Number	Comments
Material for RTA purification, desalting and reader measurements
Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		old model, other models available
Fluoroskan Ascent	Thermo Scientific	5210470	old model, not available anymore
ÄKTAPurifier	Thermo Scientific	28406266	Product is discontinued and replaced
HisTRAP HP column	GE Healthcare	17-5248-02
HiTRAP desalting column	GE Healthcare	11-0003-29
Midisart sterile filter	Sartorius	16534K	0.2 µm pore size
BCA protein assay kit	Pierce	23225
660 nm assay kit	Thermo Scientific	22660
96 well plates	Thermo Scientific	260860
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies (optional)
Anti-Tetra-His	Qiagen	34670	primary antibody; 1:1,000 dilution
Anti-mouse-HRP	Sigma-Aldrich	A9044-2ML	secondary antibody, 1:10,000 dilution