腹腔葡萄糖耐受试验、肺功能测定和肺固定研究肥胖和代谢障碍对肺部结局的影响

摘要

肥胖的发病率在上升, 并增加了慢性肺病的风险。为了建立基本机制和预防战略, 需要有明确定义的动物模型。在这里, 我们提供三种方法 (葡萄糖耐受性测试, 身体 plethysmography 和肺固定), 以研究肥胖对肺结局的影响小鼠。

摘要

肥胖和呼吸系统疾病是主要的健康问题。肥胖正在成为一个新兴的流行病, 预计到2030年世界各地有超过10亿的肥胖人口, 这就代表了社会经济负担的增加。同时, 肥胖相关的并发症, 包括糖尿病以及心脏和慢性肺病, 都在不断上升。虽然肥胖与哮喘加重的风险、呼吸道症状恶化和控制不力有关, 但肥胖和摄动代谢在慢性肺病发病中的功能作用往往被低估,而潜在的分子机制仍然难以捉摸。本文旨在探讨肥胖对代谢的影响以及肺结构和功能的评估方法。在这里, 我们描述了三技术的老鼠研究: (1) 评估腹腔葡萄糖耐受 (ipGTT), 以分析肥胖对葡萄糖代谢的影响;(2) 测量气道阻力 (Res) 和呼吸系统依从性 (Cdyn), 分析肥胖对肺功能的影响;(3) 肺的制备和固定, 供随后的定量组织学评估。肥胖相关的肺部疾病可能是多因素的, 其产生于全身炎症和代谢失调, 可能对肺功能和治疗反应产生不利影响。因此, 研究分子机制和新疗法效果的标准化方法是必不可少的。

引言

根据世界卫生组织 (卫生组织) 的数据, 在 2008年, 超过14亿个年龄在20岁以上的成年人超重, 身体质量指数 (BMI) 大于或等于 25;此外, 2亿多名男子和近3亿名妇女肥胖 (BMI≥30)¹。肥胖和代谢综合征是多种疾病的主要危险因素。肥胖和随之增加的白脂肪组织质量与2型糖尿病有密切关系^2,3, 心血管疾病包括冠心病 (CHD), 心力衰竭 (HF), 心房颤动⁴和骨关节炎⁵, 它们在呼吸道疾病发病机制中的功能作用仍然不甚了解。然而, 流行病学研究表明, 肥胖与慢性呼吸道疾病密切相关, 包括劳力呼吸困难、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征 (OSAS)、肥胖低通气综合征 (职业职业治疗)、慢性阻塞性肺病 (COPD), 肺栓塞, 吸入肺炎和支气管哮喘^6,7,8,9。将肥胖和摄动代谢、例如、胰岛素抵抗和 II 型糖尿病与慢性肺病发病机制联系起来的潜在机制, 不仅包括对通气的体重增加的机械和物理后果, 而且还诱发慢性亚急性炎症状态^10,11。过去十年中肥胖和肺部疾病的增加, 加上缺乏有效的预防策略和治疗方法, 突显出需要调查分子机制, 以确定管理肥胖相关肺的新途径。疾病.

在这里, 我们描述了三标准测试, 这是研究肥胖及其对小鼠肺结构和功能的影响的重要基础知识: (1) 腹腔葡萄糖耐受 (ipGTT) (2) 气道阻力 (Res) 和呼吸的测量系统遵从性 (Cdyn);(3) 肺的制备和固定, 供随后的定量组织学评估。ipGTT 是一个强有力的筛选测试, 以测量葡萄糖摄取量, 从而影响肥胖对新陈代谢。这种方法的简单性使得标准化很好, 因此实验室之间的结果可比性。更复杂的方法, 如高血糖钳或研究孤立胰岛, 可用于详细分析代谢表型¹²。在这里, 我们评估葡萄糖耐受性, 以确定肥胖相关的系统性和代谢紊乱的状态, 作为进一步研究肺部结局的基础。为了评估肥胖和代谢紊乱对肺功能的影响, 我们测量了气道阻力 (Res) 和呼吸系统依从性 (Cdyn)。为描述肺部疾病, 有无节制的和克制的方法评估肺功能。无拘无束的 plethysmography 在自由运动的动物模仿自然状态, 反映呼吸模式;与此相反, 侵入性方法, 如输入阻抗测量的 cDyn 在深麻醉小鼠评估动态肺力学, 是更准确的¹³。由于慢性呼吸道疾病是由肺组织的组织学改变反映出来的, 因此适当的肺部固定术是迫在眉睫的。组织固定和制备方法的选择取决于肺的隔间, 例如传导气管或肺实质¹⁴。在这里, 我们描述了一种方法, 允许定性和定量评估传导气道, 以研究肥胖对哮喘发展的影响。

研究方案

所有动物程序都是按照地方政府当局批准的议定书进行的 (土地北威州, 亚利桑那州: 2012. A424), 并符合德国动物福利法和关于动物福利的条例, 用于试验或为其他科学目的。由于肺功能分析可能会影响肺结构, 因此随后的组织学分析, 应在不同的动物中进行 Cdyn 的测定和肺形态计量学的制备和固定。然而, ipGTT 后的 Cdyn 的测量是可能的。由于 ipGTT 期间的压力可能会干扰肺功能测试所需的麻醉, 因此建议在 ipGTT 后大约2周的恢复期, 允许小鼠从体重损失和血液参数的变化中恢复¹²。

1. 腹腔葡萄糖耐受试验的准备 (ipGTT)

注: 禁食12小时后, 完整的 ipGTT 需要大约2小时。

1. 由于压力对血糖的影响很大, 所以要保证小鼠的适应和科学家的训练。
2. 在安静和无应力条件下将动物转移到实验区。
3. 考虑使用 hypercaloric 饮食诱发小鼠肥胖。有关进一步建议, 请参阅讨论部分。
4. 快速动物在一夜之间12小时, 不限制获得水。第二天, 12 小时禁食后, 根据制造商的协议准备血糖表 (参见材料表), 方法是在测试条端口插入一个新的测试条。
5. 使用无菌剪刀切割尾部尖端, 同时轻轻地将鼠标保留在尾部, 并立即通过将自由流动的血滴 (最小样本大小0.5 µL) 应用于血糖表的试纸来测量禁食的血糖。
   注: 在血液样本充分应用后, 在屏幕上开始倒计时计时器。4秒后, 测试结果显示在屏幕上。
6. 之后, 使用颜色标记分别对动物进行称量和标记。
7. 管理2克葡萄糖/千克体重通过腹腔注射。确保注射量为 0.1 mL/10 g 体重 (27 克针和 1 cc 注射器)。
8. 随后, 通过在新的试纸上应用一滴自由流动的血液来测量15、30、60和120分钟后的血糖。
   注: 通过对尾部尖病房的温和按摩, 可以增加血流量。如果尾部伤口 encrusts, 用0.9% 氯化钠溶液浸泡的消毒拭子清洗。
9. 允许动物在他们的家庭笼子里休息, 在测量之间可以无限制地获得水。

2. 肺功能分析测量 cDyn

注: 对于不受干扰的测定和 cDyn, 小鼠需要在深部麻醉下通风。无压力的动物处理和正确的麻醉监测是必不可少的。有关使用无菌技术的一般说明, 请 Hoogstraten-米勒et查看文章。¹⁵

1. 在每组实验之前校准 plethysmograph, 并在软件中准备学习设置 (请参阅材料表)。
2. 手术前, 深麻醉动物通过腹腔注射甲苯噻嗪 (10 毫克/千克体重) 和氯胺酮 (100 毫克/千克体重) (27 克针和 1 cc 注射器)。确保注射量为每体重 0.1 mL/10 克。
   注意: 由于氯胺酮对小鼠有适当的镇痛作用, 因此不需要额外的止痛治疗。侵袭性气管导管/plethysmograph 程序大约需要5-7 分钟, 然后才能开始数据采集。
3. 将鼠标放在加热垫上的仰卧位, 以保持体温。
4. 用药膏捂住眼睛, 以防麻醉时干燥。
5. 用脚趾捏-反应不断监测麻醉深度。
   注: 额外的麻醉管理可能是必要的, 以维持手术平面的麻醉。
6. 用70% 乙醇滋润甲状腺区域的皮草。
7. 在胸骨的颈静脉切口和 mentum 的块茎 symphyses 之间, 小心地切开中线的皮肤1厘米, 用镊子将其抬起, 用钝剪刀在目视检查下修剪皮肤 (图 1A)。
8. 可视化皮下脂肪组织和甲状腺。
9. 通过仔细的钝器将甲状腺裂片与 sternothyroid 和 sternothyroid 肌肉的解剖分开, 使气管暴露出来 (图 1B)。小心不要伤害任何血管和导致出血, 因为这可能会对心血管系统造成不良影响, 最终对测量。
10. 随后, 用钝钳在气管和食道之间通过4-0 编织手术缝合。用微剪刀仔细切开气管软骨与喉部之间的气管。
11. 使用气管插管 (0.04 英寸/1.02 毫米直径) 在视觉控制下 (图 1C)。修复管通过结扎与手术缝合, 以避免任何泄漏的系统。
12. 接下来, 将动物移动到身体室的加热床上, 将气管管连接到面板 (图 1D), 然后按控制器前面板上的通风按钮 (图 1E) 打开通风。
13. 通过观察胸部运动作保和通气率来测量通气量。确认气管导管的正确放置, 确保胸腔两侧同时移动。
14. 监视计算机屏幕上的压力信号 (图 1F)。确保通风曲线均匀。如果情况并非如此, 请将动物分离并检查手术侧。当心血或粘液堵塞气管管。
    注意: 对于体重为20-25 克的成年动物, 根据制造商的建议, 建议使用图 2中所示的通风机设置。
15. 为了控制通气过程中的反式肺压力的变化, 在接近肺部水平的深度处插入食道管 (0.04 英寸/1.02 毫米直径)。放置管道时, 注意屏幕。放置在屏幕上可以看到最大的压力偏转和最小的心脏工件的管。
16. 手术后, 准备动物的测量。注入麻醉通过腹腔注射氯胺酮 (100 毫克/千克体重) 使用27克针和 1 cc 注射器。确保注射量为每体重 0.1 mL/10 克。
    注: 评估支气管 hyperreagibility, nebulize 乙酰甲胆碱, 一个非选择性毒蕈受体激动剂的副交感神经系统, 这诱导支气管收缩。数据采集是在四不同阶段执行的 (图 3)。
17. 根据 manufacturer´s 协议启动数据采集。
    注意: 软件会自动引导用户完成采集过程。
18. 应用10µL 的 PBS (车辆) 在喷雾器, 并开始雾化后5分钟的驯化。接下来, 请遵循3分钟的响应阶段, 其中的 Res (cmH₂o/毫升/秒) 和 cDyn (mL/cmH₂O) 被测量。最后, 在下一个雾化之前, 为动物提供3分钟的恢复阶段。
19. 按照软件逐步应用10µL 增加浓度的乙酰甲胆碱 (2.5 µg/10 µL, 6.25 µg/10 µL, 12.5 µg/10 µL) 在通风机上。
20. 一旦所有的测量已经执行和记录, 牺牲的动物宫颈脱位。

3. 肺隔离法定量分析成年小鼠的形态计量学

1. 深麻醉动物通过腹腔注射甲苯噻嗪 (10 毫克/千克体重) 和氯胺酮 (100 毫克/千克体重) (27 克针和 1 cc 注射器)。注射量应为每体重 0.1 mL/10 克。
   注: 在达到手术耐受状态后, 术后的准备需要大约5分钟, 其次是器官灌注和30分钟的固定。
2. 一旦动物达到了手术耐受的状态 (负趾捏-反应), 用70% 乙醇消毒动物, 用手术胶带将动物固定在垫上。
3. 通过心脏穿刺和流血牺牲动物。简单地, 用钝剪刀在皮肤和腹膜切开腹部用内侧切口。
4. 找到肝脏的隔膜头病房, 并仔细地将肝脏与隔膜分开。
5. 用钝剪刀在隔膜上做一个小切口, 用20克针附着在2毫升的注射器上, 使心脏的左心室有斑点。慢慢地抽血化验动物。
   注意: 慢和仔细的放血是重要的, 以防止心室崩溃由于负压, 抑制不受干扰的血液流动。
6. 用弯曲的钝剪刀在肋骨的整个长度上通过胸骨旁切口轻轻地打开胸腔来解剖肺。
7. 然后, 抬起肋骨笼露出胸腔 (图 3C)。摘除胸腺以观察心脏和肺部。
   注: 右心室可选择性注射, 其次为带有冰寒 PBS 的肺血管系统灌注, 然后用固定液 (例如, 4% (质量/体积) 多聚甲醛 (粉煤灰)] 是可能的。应注意的是, 有一个增加的风险, 破裂牙槽 septae 和负面影响肺结构使用这种方法。
8. 先仔细取出心脏, 解剖肺。
9. 随后, 用钝钳在气管和食道之间通过4-0 编织手术缝合。
10. 接下来, 仔细切割气管软骨与喉部之间的气管, 用静脉注射套管 (26 克) 插管, 并用固定剂 (例如, 4% (质量) 在20厘米 H₂O 的恒定压力下, 充气肺部。/容积) 的粉煤灰]。
11. 对于粉煤灰固定, 在室温下将定影液保持在30分钟。之后, 结扎气管, 取出套管。然后, 小心地在不损害组织的情况下对肺进行切除, 并将其贮存在4摄氏度的固定剂中过夜。
    注: 另外, 根据 ATS/ETS 共识纸 2.5% GA 缓冲 OsO4, 尿溶液用于适当的组织稳定。要进一步组织准备, 请参阅夏et 等的协商一致文件。¹⁴

结果

腹腔葡萄糖耐受试验 (ipGTT) (图 4)、肺功能测试 (图 5) 的代表性结果, 以及说明苏木精和红红染色肺部的代表性图像 (图 6)。

ipGTT 7 周高脂饮食 (风) 后, 在肥胖小鼠 (蓝色) 中进行。标准膳食喂养的老鼠作为控制 (黑色)。肥胖小鼠在腹腔葡萄糖注射液后显示血糖水...

讨论

本报告为三种不同方法分析肥胖对葡萄糖代谢和肺部结局的影响提供三项议定书。首先, 葡萄糖耐受性试验提供了分析细胞内葡萄糖吸收的机会, 并可以表明胰岛素抵抗。第二, 全身 plethysmography 是一种测量肺功能的技术, 从而有助于测试新疗法的疗效。第三, 标准化的固定协议是定量形态学分析的关键, 以评估肥胖对结构变化的影响。

饮食诱发肥胖在动物研究中的作用

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
GlucoMen LX	A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy	38969	blood glucose meter
GlucoMen LX Sensor	A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy	39765	Test stripes
Glucose 20%	B. Braun, Melsung, Germany	2356746
FinePointe Software	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1831-002
FinePointe RC Single Site Mouse Table	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1831-001
FPRC Controller	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1075-001
FPRC Aerosol Block	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1106-001
Aerogen neb head-5.2-4um	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-2306-001
Forceps	FST, British Columbia, Canada	11065-07
Blunt scissors	FST, British Columbia, Canada	14105-12
Micro scissors	FST, British Columbia, Canada	15000-00
Perma-Hand 4-0	Ethicon, Puerto Rico, USA	736H	Surgical suture
Roti-Histofix 4%	Roth	P087.1	4% Paraformaldehyd
Ketaset	Zoetis, Berlin, Germany	10013389	Ketamine
Rompun 2%	Bayer, Leverkusen, Germany	770081	Xylazine