Prova di tolleranza di glucosio intraperitoneale, misura della funzione polmonare e la fissazione del polmone per studiare l'impatto dell'obesità e metabolismo alterato sugli esiti polmonare

Riepilogo

L'incidenza dell'obesità è in aumento e aumenta il rischio di malattie polmonari croniche. Per stabilire i meccanismi sottostanti e le strategie preventive, animale ben definiti modelli sono necessari. Qui, mettiamo a disposizione tre metodi (prova di tolleranza di glucosio, pletismografia corporea e fissazione del polmone) per studiare l'effetto dell'obesità sui risultati polmonari nei topi.

Abstract

L'obesità e i disturbi respiratori sono gravi problemi di salute. L'obesità sta diventando un'epidemia emergente con un numero previsto di oltre 1 miliardo individui obesi in tutto il mondo entro il 2030, rappresentando così un crescente onere socio-economico. Contemporaneamente, comorbidità associate all'obesità, compreso il diabete così come cuore e malattie polmonari croniche, sono continuamente in aumento. Anche se l'obesità è stata associata con un rischio aumentato per le esacerbazioni di asma, peggioramento dei sintomi respiratori e scarso controllo, il ruolo funzionale di obesità e metabolismo perturbato nella patogenesi della malattia polmonare cronica è spesso sottovalutato, e meccanismi molecolari rimangono evasivi. Questo articolo si propone di presentare i metodi per valutare l'effetto dell'obesità sul metabolismo, così come la struttura del polmone e la funzione. Qui, descriviamo tre tecniche per studi di topi: (1) valutazione della tolleranza al glucosio intraperitoneale (ipGTT) per analizzare l'effetto dell'obesità sul metabolismo del glucosio; (2) misurazione della resistenza delle vie aeree (Res) e la conformità del sistema respiratorio (Cdin) per analizzare l'effetto dell'obesità sulla funzione polmonare; e (3) preparazione e la fissazione del polmone per la successiva valutazione istologica quantitativa. Malattie polmonari legate all'obesità sono probabilmente multifattoriali, derivanti dalla disregolazione infiammatori e metabolici sistemici che potenzialmente compromettere la funzione polmonare e la risposta alla terapia. Pertanto, una metodologia standardizzata per studiare i meccanismi molecolari e l'effetto di nuovi trattamenti è essenziale.

Introduzione

Secondo il mondo salute organizzazione (OMS) nel 2008, più di 1,4 miliardi adulti, di età compresa tra 20 e più anziani, erano in sovrappeso con un indice di massa corporea (BMI) maggiore o uguale a 25; ulteriormente, oltre 200 milioni di uomini e donne quasi 300 milioni erano obesi (BMI≥30)¹. Obesità e sindrome metabolica sono fattori di rischio importanti per un gran numero di malattie. Mentre l'obesità e il tessuto adiposo aumentato concomitante bianco massa è stato intimamente collegato per tipo 2 diabete^2,3, malattie cardiovascolari, tra cui la malattia coronarica (CHD), insufficienza cardiaca (IC), fibrillazione atriale⁴ e osteoartrite⁵, loro ruoli funzionali nella patogenesi dei disordini respiratori rimangono poco compresi. Tuttavia, gli studi epidemiologici hanno dimostrato che l'obesità è fortemente associata con condizioni respiratorie croniche, tra cui dispnea da sforzo, sindrome di apnea ostruttiva del sonno (OSAS), sindrome di hypoventilation di obesità (OHS), cronica malattia polmonare ostruttiva (BPCO), embolia polmonare, polmonite da aspirazione e asma bronchiale^6,7,8,9. Potenziali meccanismi che collegano l'obesità e metabolismo perturbato, per esempio, l'insulino-resistenza e diabete di tipo II, alla patogenesi dell'affezione polmonare cronica comprendono non solo le conseguenze fisiche e meccaniche del peso ma anche di guadagno sulla ventilazione indurre una condizione infiammatoria subacuta cronica^10,11. L'aumento dell'obesità e malattie polmonari durante l'ultimo decennio, accoppiati con la mancanza di efficaci strategie preventive e approcci terapeutici, evidenzia la necessità di studiare i meccanismi molecolari per definire nuove vie per gestire l'obesità-collegata del polmone malattie.

Qui, descriviamo tre prove standard, che sono basi importanti per studiare l'obesità e il suo impatto sulla struttura del polmone e sulla funzione in modelli murini: (1) intraperitoneale glucosio tolleranza (ipGTT) (2) misurazione della resistenza delle vie aeree (Res) e delle vie respiratorie conformità del sistema (Cdin); e (3) preparazione e la fissazione del polmone per la successiva valutazione istologica quantitativa. Il ipGTT è un test di screening robusto per l'assorbimento del glucosio di misura e quindi l'effetto dell'obesità sul metabolismo. La semplicità del metodo consente buona standardizzazione e pertanto la comparabilità dei risultati tra i laboratori. Metodi più sofisticati, come hyperglycemic morsetti o studi sugli isolotti isolati, possono essere utilizzati per un'analisi dettagliata del fenotipo metabolico¹². Qui valutiamo la tolleranza al glucosio per definire uno stato di disordine sistemico e metaboliche associate all'obesità come base per ulteriori studi su un risultato polmonare. Per valutare l'effetto dell'obesità e del disordine metabolico sulla funzione polmonare, abbiamo misurato la resistenza delle vie aeree (Res) e la conformità del sistema respiratorio (Cdin). Per caratterizzare l'affezione polmonare, sono disponibili metodi sfrenati come pure trattenuti per la valutazione della funzione polmonare. Pletismografia sfrenato in animali liberi di muoversi imita uno stato naturale, che riflette i modelli di respirazione; al contrario, metodi invasivi, come misura di impedenza di ingresso di Res e CDIN in topi anestetizzati profondamente per valutare la meccanica polmonare dinamica, sono più accurate¹³. Poiché le condizioni respiratorie croniche sono riflessi da alterazioni istologiche del tessuto polmonare, fissazione del polmone adeguato per un'ulteriore analisi è imminente. La scelta del metodo di fissazione del tessuto e preparazione dipende il vano del polmone che sarà studiato, ad esempio, lo svolgimento di vie respiratorie o del polmone parenchima¹⁴. Qui, descriviamo un metodo che permette la valutazione qualitativa e quantitativa delle vie aeree conduce per studiare l'effetto dell'obesità su sviluppo di asma.

Protocollo

Tutte le procedure di animali sono stati condotti in conformità a protocolli approvati dalle autorità di governo locale (Land NRW, AZ: 2012.A424) ed erano in conformità con la legge tedesca sul benessere degli animali e le norme sul benessere degli animali utilizzati per esperimenti o per altri fini scientifici. Poiché analisi di funzione polmonare possono influenzare la struttura del polmone e quindi successive analisi istologica, la misurazione di Res e CDIN e la preparazione e la fissazione del polmone per istomorfometria dovrebbe essere eseguita in diversi animali. Tuttavia, la misura della Res e CDIN seguendo ipGTT è possibile. Poiché lo stress durante il ipGTT potrebbe interferire con l'anestesia necessaria per la funzione di polmone test, un periodo di recupero di circa 2 settimane dopo ipGTT è consigliato per consentire topi recuperare dalla perdita di peso del corpo e cambia nel sangue parametri¹².

1. preparazione per il Test di tolleranza al glucosio intraperitoneale (ipGTT)

Nota: Dopo 12 ore di digiuno, il ipGTT completo impiegano circa 2 ore.

1. Poiché lo stress influenza significativamente la glicemia, assicurarsi che entrambi adattamento dei topi, così come formazione dello scienziato, sono eseguite.
2. Trasferire gli animali dell'area sperimentale in condizioni tranquille e senza stress.
3. Prendere in considerazione l'applicazione di una dieta ipercalorica per indurre l'obesità in topi. Vedere la sezione di discussione per ulteriori consigli.
4. Animali veloci per 12 h durante la notte, senza limitare l'accesso all'acqua. Il giorno successivo, dopo 12 ore di digiuno, preparare il misuratore di glucosio del sangue secondo il produttore di protocollo (Vedi tabella materiali) inserendo una nuova striscia alla porta della striscia di test.
5. Incidere la punta della coda utilizzando forbici sterili, mantenendo delicatamente il mouse alla sua coda e immediatamente misurare la glicemia a digiuno applicando una goccia di sangue flusso libero (campione minimo dimensioni 0,5 µ l) per la striscia del misuratore di glucosio nel sangue.
   Nota: Avvia un timer di conto alla rovescia sullo schermo dopo l'applicazione sufficiente del campione di sangue. Dopo 4 s, il risultato del test viene visualizzato sullo schermo.
6. In seguito, pesare ed etichettare gli animali individualmente utilizzando il colore di marcatura.
7. Somministrare 2 g glucosio/kg corpo peso tramite l'iniezione intraperitoneale. Assicurarsi che il volume di iniezione è 0,1 mL/10 g di peso corporeo (G 27 ago e siringa da 1 cc).
8. Successivamente, misurare la glicemia dopo 15, 30, 60 e 120 min applicando una goccia di sangue flusso libero su una nuova striscia.
   Nota: Il flusso sanguigno può essere aumentato massaggiando delicata delle circoscrizioni-punta della coda. Se la ferita di coda incrostazioni, pulirlo utilizzando un tampone sterile imbevuto di soluzione di cloruro di sodio 0,9%.
9. Consentire agli animali di riposare nelle loro gabbie casa con accesso illimitato all'acqua tra le misurazioni.

2. analisi di funzione polmonare a misura Res e CDIN

Nota: Per la misura indisturbato di Res e CDIN, topi necessario essere ventilato sotto anestesia profonda. Animale privo di stress gestione e un controllo adeguato dell'anestesia sono essenziali. Per istruzioni generali usando tecniche sterili, consultare l'articolo di Hoogstraten-Miller et al. ¹⁵

1. Calibrare il pletismografo prima di ogni serie di esperimenti e preparare le impostazioni di studio all'interno del software (Vedi Tabella materiali).
2. Prima della chirurgia, profondamente anestetizzare gli animali tramite l'iniezione intraperitoneale di xilazina (10 mg/kg di peso corporeo) e ketamina (100 mg/kg di peso corporeo) (27 G ago e siringa da 1 cc). Assicurarsi che il volume di iniezione è 0,1 mL/10 g per peso corporeo.
   Nota: Poiché la ketamina ha un effetto analgesico adeguato nei topi, nessun trattamento ulteriore dolore è necessario. La procedura invasiva tracheale catetere/pletismografo dura circa 5-7 minuti, quindi acquisizione dati può iniziare.
3. Posizionare il mouse nella posizione supina su un rilievo di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea.
4. Coprire gli occhi con l'unguento per prevenire la secchezza sotto anestesia.
5. Monitorare costantemente la profondità dell'anestesia utilizzando la punta pizzico-risposta.
   Nota: Ulteriore somministrazione di anestetico potrebbe essere necessario mantenere un aereo chirurgico di anestesia.
6. Inumidire il pelo della zona chirurgica della regione della tiroide con etanolo al 70%.
7. Incise con cura la pelle nel midline per circa 1 cm tra la tacca giugulare dello sterno e il symphyses di tubero del mentum sollevandolo con il forcipe e ritaglio la pelle sotto controllo visivo utilizzando forbici smussate (Figura 1A).
8. Visualizzare il tessuto adiposo sottocutaneo sottostante e la ghiandola tiroide.
9. Esporre la trachea separando accuratamente smussato entrambi i lobi della tiroide all'istmo e dissezione dei sternothyroid e sternothyroid muscoli (Figura 1B). Fare attenzione a non danneggiare le navi e causare sanguinamento, poiché ciò può causare effetti negativi sul sistema cardiovascolare e, infine, sulle misurazioni.
10. Successivamente, passare una sutura chirurgica intrecciato 4-0 tra la trachea e l'esofago usando il forcipe smussato. Accuratamente incise la trachea vicino la laringe tra le cartilagini tracheale con micro-forbici.
11. Intubare con un tubo tracheale (0,04 pollici/1,02 mm di diametro) sotto controllo visivo (Figura 1). Fissare il tubo tramite la legatura con la sutura chirurgica per evitare eventuali perdite nell'impianto.
12. Successivamente, spostare l'animale al letto riscaldato della sezione corpo e collegare il tubo trachea per la piastra di faccia (Figura 1) e accendere la ventilazione premendo il pulsante di ventilazione sul pannello frontale del controller (Figura 1E).
13. Sondaggio la ventilazione osservando il movimento del torace contemporaneamente con il tasso di ventilazione. Per confermare il corretto posizionamento del tubo tracheale, assicurarsi che entrambi i lati del torace si muovono simultaneamente.
14. Guarda la pressione segnale sullo schermo del computer (Figura 1F). Assicurarsi che le curve di ventilazione siano uniformi. Se questo non è il caso, staccare l'animale e controllare il lato di chirurgia. Fate attenzione di sangue o muco bloccando il tubo trachea.
    Nota: Per animali adulti con un peso corporeo di 20-25 g, le impostazioni di ventilazione come mostrato nella Figura 2 sono suggerite in conformità con le raccomandazioni del produttore.
15. Per controllare cambiamenti nella pressione trans-polmonare durante la ventilazione, è necessario inserire un tubo esofageo (0,04 pollici/1,02 mm di diametro) nell'esofago alla profondità che approssima i livelli dei polmoni. Guardare lo schermo durante il posizionamento del tubo. Disporre il tubo dove deflessione di pressione massima e minima cuore artefatti possono essere visto sullo schermo.
16. Dopo l'intervento chirurgico, è necessario preparare l'animale per la misurazione. Effettua l'anestesia tramite iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg/kg di peso corporeo) utilizzando un ago 27 G e siringa da 1 cc. Assicurarsi che il volume di iniezione è 0,1 mL/10 g per peso corporeo.
    Nota: Per valutare hyperreagibility bronchiale, nebulizzare methacholine, un agonista del recettore muscarinico non selettivi del sistema nervoso parasimpatico, che induce broncocostrizione. Acquisizione dei dati viene eseguita in quattro diverse fasi (Figura 3).
17. Avviare l'acquisizione di dati secondo il protocollo del produttore.
    Nota: Il software automaticamente Guida gli utenti attraverso il processo di acquisizione.
18. Applicare 10 µ l di PBS (veicolo) il nebulizzatore e iniziare a nebulizzazione dopo 5 min di acclimatazione. Successivamente, seguire una fase di risposta di 3 min, dove la Res (cmH₂O/mL/s) e CDIN (mL/cmH₂O) sono misurate. Alla fine, è necessario fornire una fase di recupero di 3 minuti per l'animale prima della successiva nebulizzazione.
19. Seguire il software di applicazione graduale di 10 µ l di aumento delle concentrazioni di methacholine (2,5 µ g/10 µ l, 6,25 µ g/10 µ l e 12,5 µ g/10 µ l) sul ventilatore.
20. Una volta che tutte le misurazioni sono state eseguite e registrate, sacrificare l'animale di dislocazione cervicale.

3. polmone isolamento per analisi quantitativa di Histomorphometric di topi adulti

1. Profondamente anestetizzare l'animale tramite iniezione intraperitoneale di xilazina (10 mg/kg di peso corporeo) e ketamina (100 mg/kg di peso corporeo) (27 G ago e siringa da 1 cc). Il volume di iniezione dovrebbe essere 0,1 mL/10 g per peso corporeo.
   Nota: Dopo aver raggiunto lo stato di tolleranza chirurgico, la preparazione richiede circa 5 minuti, seguito da perfusione d'organo e 30 min per la fissazione.
2. Una volta che l'animale ha raggiunto lo stato di tolleranza chirurgica (negativo punta pizzico-risposta), disinfettare l'animale con etanolo al 70% e fissare l'animale su un pad con nastro chirurgico.
3. Sacrificare l'animale dalla puntura cardiaca e sanguinamento. Brevemente, aprire l'addome con un'incisione mediale attraverso la pelle ed il peritoneum utilizzando forbici smussate.
4. Individuare i reparti di testa diaframma del fegato e separare con cura il fegato dal diaframma.
5. Praticare una piccola incisione nel diaframma utilizzando forbici smussate e punctate il ventricolo sinistro del cuore con un ago di 20 G collegato ad una siringa 2 mL. Lentamente prosciugare l'animale.
   Nota: Dissanguamento lento ed accurato è importante per prevenire i ventricoli crollando a causa della pressione negativa, inibendo un flusso sanguigno indisturbato.
6. Sezionare il polmone con l'apertura del torace delicatamente attraverso un'incisione parasternal lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica utilizzando forbici curve, smussate.
7. In seguito, sollevare la gabbia toracica per esporre la cavità pleurica (Figura 3). Rimuovere il timo per vedere il cuore ed i polmoni.
   Nota: Facoltativo iniezione del ventricolo destro, seguito da perfusione del sistema vascolare del polmone con PBS ghiacciata e poi con una soluzione fissante [ad es., paraformaldeide al 4% (massa/volume) (PFA)] è possibile. Essere consapevoli che c'è un aumento del rischio di rottura septae alveolari e influenzare negativamente la struttura del polmone usando questo metodo.
8. Sezionare il polmone di primo accuratamente rimuovendo il cuore.
9. Successivamente, passare una sutura chirurgica intrecciato 4-0 tra la trachea e l'esofago usando il forcipe smussato.
10. Successivamente, accuratamente incise la trachea vicino la laringe tra le cartilagini tracheale, intubare con una cannula endovenosa (26 G) e gonfiare il polmone tramite la fissazione di pressione ad una pressione costante di 20 cm H₂O tramite agente fissativo [ad es., 4% (massa /volume) di PFA].
11. Per la fissazione di PFA, lasciare il fissativo per 30 min a temperatura ambiente. In seguito, legare la trachea e rimuovere la cannula. Quindi, asportare il polmone con cautela senza danneggiare il tessuto e memorizzarlo nell'agente fissativo a 4 ° C durante la notte.
    Nota: In alternativa, secondo l'ATS/ETS consenso carta 2,5% GA tamponata OsO4, soluzione di uracile è utilizzato per la stabilizzazione del tessuto adeguato. Per ulteriore preparazione dei tessuti, vedere il documento di consenso di Hsia et al. ¹⁴

Risultati

Risultati rappresentativi del test di tolleranza al glucosio intraperitoneale (ipGTT) (Figura 4), polmone funzione test (Figura 5) e rappresentante immagini che illustrano ematossilina ed eosina macchiato polmoni (Figura 6).

Il ipGTT è stato effettuato in topi obesi (blu) dopo 7 settimane di dieta-alta-grassi (HFD). Standard topi di dieta-...

Discussione

Questo rapporto fornisce tre protocolli per tre diversi metodi analizzare l'impatto dell'obesità sul metabolismo del glucosio e gli esiti polmonari. In primo luogo, il test di tolleranza al glucosio offre la possibilità di analizzare l'assorbimento intracellulare del glucosio e può essere indicativo di insulino-resistenza. In secondo luogo, pletismografia di tutto il corpo è una tecnica per misurare la funzione polmonare ed è quindi utile per testare l'efficacia di nuovi trattamenti. In terzo luogo, un protocollo st...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
GlucoMen LX	A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy	38969	blood glucose meter
GlucoMen LX Sensor	A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy	39765	Test stripes
Glucose 20%	B. Braun, Melsung, Germany	2356746
FinePointe Software	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1831-002
FinePointe RC Single Site Mouse Table	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1831-001
FPRC Controller	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1075-001
FPRC Aerosol Block	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1106-001
Aerogen neb head-5.2-4um	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-2306-001
Forceps	FST, British Columbia, Canada	11065-07
Blunt scissors	FST, British Columbia, Canada	14105-12
Micro scissors	FST, British Columbia, Canada	15000-00
Perma-Hand 4-0	Ethicon, Puerto Rico, USA	736H	Surgical suture
Roti-Histofix 4%	Roth	P087.1	4% Paraformaldehyd
Ketaset	Zoetis, Berlin, Germany	10013389	Ketamine
Rompun 2%	Bayer, Leverkusen, Germany	770081	Xylazine