Teste de tolerância à glicose intraperitoneal, medição da função pulmonar e a fixação do pulmão para estudar o impacto da obesidade e metabolismo prejudicado em resultados pulmonares

Resumo

A incidência da obesidade está aumentando e aumenta o risco de doenças pulmonares crônicas. Estabelecer os mecanismos subjacentes e estratégias preventivas, animal bem definido modelos são necessários. Aqui, nós fornecemos três métodos (teste de tolerância à glicose, pletismografia de corpo e fixação do pulmão) para estudar o efeito da obesidade sobre os resultados pulmonares em camundongos.

Resumo

Obesidade e distúrbios respiratórios são problemas de saúde. A obesidade está se tornando uma epidemia emergente com um número esperado de indivíduos obesos mais 1 bilhão em todo o mundo em 2030, representando assim um peso crescente socioeconômico. Simultaneamente, comorbidades relacionadas à obesidade, incluindo diabetes, bem como o coração e doenças pulmonares crônicas, estão continuamente a aumentar. Embora a obesidade tem sido associada com aumento do risco de exacerbações da asma, agravamento dos sintomas respiratórios e controle pobre, o papel funcional de obesidade e metabolismo perturbado na patogênese da doença de pulmão crônica é muitas vezes subestimado, e mecanismos moleculares subjacentes permanecem indescritíveis. Este artigo tem como objetivo apresentar métodos para avaliar o efeito da obesidade no metabolismo, bem como a estrutura do pulmão e função. Aqui, descrevemos três técnicas para estudos de ratos: (1) avaliação de tolerância de glicose intraperitoneal (ipGTT) para analisar o efeito da obesidade no metabolismo da glicose; (2) medição da resistência das vias aéreas (Res) e conformidade do sistema respiratório (Cdyn) para analisar o efeito da obesidade sobre a função pulmonar; e (3) preparação e fixação do pulmão para posterior avaliação histológica quantitativa. Doenças pulmonares relacionadas com a obesidade são provavelmente multifatoriais, decorrentes da sistêmica desregulação metabólica e inflamatória que potencialmente negativamente influenciam a função pulmonar e a resposta à terapia. Portanto, uma metodologia padronizada para estudar os mecanismos moleculares e o efeito de tratamentos romance é essencial.

Introdução

De acordo com a Saúde Organização Mundial (OMS) em 2008, mais de 1,4 bilhões de adultos, com idades entre 20 e mais velhos, estavam acima do peso com um índice de massa corporal (IMC) maior ou igual a 25; Além disso, mais 200 milhões de homens e mulheres de quase 300 milhões eram obesos (BMI≥30)¹. Obesidade e síndrome metabólica são importantes fatores de risco para uma infinidade de doenças. Enquanto a obesidade e o concomitante desenvolvimento aumentado de tecido adiposo branco massa tem sido intimamente associada ao tipo 2 diabetes^2,3, doenças cardio-vasculares, incluindo doença coronariana (DAC), insuficiência cardíaca (HF), fibrilação atrial⁴ e osteoartrite⁵, seus papéis funcionais na patogênese de doenças respiratórias permanecem mal compreendidos. No entanto, estudos epidemiológicos têm demonstrado que a obesidade está fortemente associada com doenças respiratórias crônicas, incluindo esforço dispneia, síndrome de apneia obstrutiva do sono (SAOS), obesidade hipoventilação síndrome (SST), crônica doença pulmonar obstrutiva (DPOC), embolia pulmonar, pneumonia por aspiração e asma brônquica^6,7,8,9. Potenciais mecanismos de ligação entre obesidade e metabolismo perturbado, por exemplo, resistência à insulina e diabetes tipo II, para a patogênese da doença de pulmão crônica não só compreendem as consequências físicas e mecânicas de peso ganho na ventilação mas também induzi a um estado inflamatório subagudo crônica^10,11. O aumento da obesidade e doenças do pulmão durante a última década, juntamente com a falta de estratégias preventivas eficazes e abordagens terapêuticas, destaca a necessidade de investigar os mecanismos moleculares para definir novas vias para gerenciar o pulmão obesidade doenças.

Aqui, descrevemos três testes padrão, que são princípios importantes para investigar a obesidade e o seu impacto na estrutura do pulmão e função em modelos do rato: glicose (1) intraperitoneal tolerância (ipGTT) (2) medição da resistência das vias aéreas (Res) e respiratória conformidade de sistema (Cdyn); e (3) preparação e fixação do pulmão para posterior avaliação histológica quantitativa. O ipGTT é um teste de rastreio robusto para a absorção de glicose medida e, portanto, o efeito da obesidade no metabolismo. A simplicidade do método permite boa padronização e, portanto, a comparabilidade dos resultados entre os laboratórios. Métodos mais sofisticados, tais como braçadeiras hiperglicêmicos ou estudos sobre ilhotas isoladas, podem ser usados para análise detalhada do fenótipo metabólico¹². Aqui nós avaliar a tolerância à glicose para definir um estado de obesidade associada de desordem metabólica e sistêmica como base para estudos adicionais em um resultado pulmonar. Para avaliar o efeito da obesidade e doença metabólica na função pulmonar, medimos a resistência das vias aéreas (Res) e conformidade do sistema respiratório (Cdyn). Para caracterizar a doença pulmonar, desenfreados, bem como comedidos métodos para avaliação da função pulmonar estão disponíveis. Pletismografia desenfreada em movimentando-se livremente animais imita um estado natural, refletindo os padrões de respiração; em contraste, métodos invasivos, tais como a medição de impedância de entrada do Res e cDyn em ratos anestesiados profundamente para avaliar a mecânica pulmonar dinâmica, são mais precisos¹³. Desde que as condições respiratórias crônicas são refletidas por alterações histológicas do tecido pulmonar, fixação adequada do pulmão, para posterior análise é iminente. A escolha do método de preparação e fixação de tecidos varia de acordo com o compartimento do pulmão que será estudado, por exemplo, realização de vias aéreas ou de parênquima pulmonar¹⁴. Aqui, descrevemos um método que permite a avaliação qualitativa e quantitativa das vias aéreas conduzindo para estudar o efeito da obesidade sobre o desenvolvimento de asma.

Protocolo

Todos os procedimentos de animais foram conduzidos em conformidade com os protocolos aprovados por autoridades do governo local (Land NRW, AZ: 2012.A424) e estavam em conformidade com a lei alemã de bem-estar animal e os regulamentos sobre o bem-estar dos animais utilizados para experiências ou para outros fins científicos. Desde que a análise de função pulmonar pode afetar a estrutura do pulmão e portanto subsequentes analisa histológica, a medição de Res Cdyn e a preparação e fixação do pulmão por Histomorfometria deve ser executada em animais diferentes. No entanto, medição de Res e Cdyn ipGTT a seguir é possível. Desde que o stress durante o ipGTT poderia interferir com a anestesia necessária para a função pulmonar testa, um período de recuperação de aproximadamente 2 semanas depois de ipGTT é recomendado para permitir que os ratos para recuperar da perda de peso corporal e mudanças no sangue parâmetros¹².

1. preparação para o teste de tolerância à glicose Intraperitoneal (ipGTT)

Nota: Após 12 h de jejum, o ipGTT completo leva aproximadamente 2 h.

1. Desde que o stress influencia significativamente a glicemia, certifique-se de que ambos adaptação dos ratos, bem como a formação do cientista, são executadas.
2. Transferi os animais para a área experimental em condições tranquilos e sem stress.
3. Considere a aplicação de uma dieta hypercaloric para induzir obesidade em ratos. Consulte a seção de discussão para mais conselhos.
4. Animais rápidos para 12 h durante a noite, sem limitar o acesso à água. No dia seguinte, após 12 h de jejum, preparar o medidor de glicose de sangue de acordo com o fabricante do protocolo (ver tabela de materiais), inserindo uma nova tira de teste na porta da tira de teste.
5. Incise a ponta da cauda usando tesoura estéril, mantendo-se suavemente o mouse em sua cauda e imediatamente medir a glicemia de jejum, aplicando uma gota de sangue fluxo livre (mínimo de amostra tamanho 0,5 µ l) para a tira de teste do medidor de glicose no sangue.
   Nota: Uma contagem regressiva começa na tela após a aplicação da amostra de sangue suficiente. Após 4 s, o resultado do teste aparece na tela.
6. Depois, pesar e etiquetar os animais individualmente usando cor de marcação.
7. Administre 2G glicose/kg corpo peso através de injeção intraperitoneal. Certifique-se de que o volume de injeção é de 0,1 mL/10 g de massa corporal (1 cc de seringa e agulha 27G).
8. Posteriormente, medir a glicose no sangue após 15, 30, 60 e 120 min, aplicando uma gota de sangue fluindo livremente sobre uma nova tira de teste.
   Nota: O fluxo sanguíneo pode ser aumentado por massageando suave de cauda ponta-alas. Se a ferida de cauda incrustado, limpá-lo usando um cotonete estéril embebido em solução de cloreto de sódio 0,9%.
9. Permitir que os animais possam descansar em suas gaiolas em casa com acesso ilimitado a água entre as medições.

2. análise de função pulmonar a medida Res e cDyn

Nota: Para a medição não perturbada de Res e cDyn, ratos precisam ser ventilado sob anestesia profunda. Estresse animal manipulação e um acompanhamento adequado da anestesia são essenciais. Para obter instruções gerais usando técnicas estéreis, por favor, reveja o artigo por Hoogstraten-Miller et al . ¹⁵

1. Calibrar a pletismografia antes de cada set de experimentos e preparar as configurações de estudo dentro do software (consulte a Tabela de materiais).
2. Antes da cirurgia, profundamente anestesiar animais através de injeção intraperitoneal de xilazina (10mg/kg de peso corporal) e cetamina (100 mg/kg de peso corporal) (1 cc de seringa e agulha 27G). Certifique-se de que o volume de injeção é de 0,1 mL/10g por peso corporal.
   Nota: Desde que a ketamina tem um efeito analgésico adequado nos ratos, nenhum tratamento de dor adicional é necessário. O procedimento invasivo cateter traqueal/pletismografia leva aproximadamente 5-7 minutos, em seguida, pode começar a aquisição de dados.
3. Posicione o mouse na posição supina sobre uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo.
4. Cubra os olhos com pomada para evitar ressecamento sob anestesia.
5. Monitore constantemente a profundidade da anestesia, usando a dedo pitada-resposta.
   Nota: Administração adicional de anestésico pode ser necessária manter um plano cirúrgico da anestesia.
6. Umedece a pele da área cirúrgica na região da tireoide com etanol a 70%.
7. Cuidadosamente, faça uma incisão da pele na linha média para cerca de 1 cm entre o entalhe na jugular do esterno e os symphyses do tubérculo do mentum levantá-la com a pinça e encaixando a pele por inspeção visual, usando a tesoura sem corte (figura 1A).
8. Visualize o tecido adiposo subcutâneo subjacente e a glândula tireoide.
9. Expor a traqueia, cuidadosamente sem corte separando ambos os lobos da tireoide no istmo e dissecação do esternotireoideo e músculos esternotireoideo (figura 1B). Tenha cuidado para não prejudicar qualquer vasos e causar sangramento, pois pode causar efeitos adversos sobre o sistema cardiovascular e, finalmente, nas medidas.
10. Posteriormente, passe uma sutura cirúrgica trançada de 4-0 entre a traqueia e o esófago usando fórceps rombudo. Incise cuidadosamente a traqueia perto da laringe entre as cartilagens traqueais com micro tesouras.
11. Entube com tubo traqueal (0,04 polegadas/1,02 mm de diâmetro) sob o controle visual (Figura 1). Fixe a tubo através da ligadura com a sutura cirúrgica para evitar qualquer vazamento no sistema.
12. Em seguida, mover o animal para a cama aquecida da câmara corpo e ligar o tubo traqueal para a placa de cara (Figura 1) e ligue a ventilação, pressionando o botão de ventilação do painel frontal do controlador (Figura 1E).
13. Levantamento da ventilação, observando o movimento do tórax simultaneamente com a taxa de ventilação. Para confirmar a correcta colocação do tubo traqueal, certifique-se de que ambos os lados do tórax se mover simultaneamente.
14. Cuidado com a pressão de sinal na tela do computador (Figura 1F). Certifique-se de que as curvas de ventilação são uniformes. Se isso não for o caso, retire o animal e verificar o lado da cirurgia. Cuidado com sangue ou muco, bloqueando o tubo traqueal.
    Nota: Para animais adultos com um peso de 20-25 g, as configurações do ventilador como mostrado na Figura 2 são sugeridas em conformidade com as recomendações do fabricante.
15. Para controlar as alterações na pressão trans-pulmonar durante a ventilação, inserir um tubo esofágico (0,04 polegadas/1,02 mm de diâmetro) para o esôfago na profundidade que se aproxima dos níveis dos pulmões. Assista a tela enquanto a colocação do tubo. Coloca o tubo onde a deflexão de pressão máxima e mínima coração artefatos podem ser vistos na tela.
16. Após a cirurgia, prepare o animal para a medição. Reinjeção anestesia através de injeção intraperitoneal de cetamina (100 mg/kg de peso corporal) 1 cc seringa e uma agulha de 27-G. Certifique-se de que o volume de injeção é de 0,1 mL/10g por peso corporal.
    Nota: Para avaliar hyperreagibility brônquica, nebuliza metacolina, um agonista não-seletivo de receptores muscarínicos do sistema nervoso parassimpático, que induz broncoconstrição. Aquisição de dados é realizada em quatro fases distintas (Figura 3).
17. Inicie a aquisição de dados de acordo com o protocolo manufacturer´s.
    Nota: O software automaticamente orienta os usuários através do processo de aquisição.
18. Aplicar 10 µ l de PBS (veículo) sobre o nebulizador e começar a nebulização após 5min de aclimatação. Em seguida, siga uma fase de resposta de 3 min, onde o Res (cmH₂O/mL/s) e cDyn (mL/cmH₂O) são medidos. No final, fornece uma fase de recuperação de 3 min para o animal antes da próxima nebulização.
19. Siga o software de aplicação gradual de 10 µ l de concentrações crescentes de metacolina (2,5 µ g/10 µ l, 6,25 µ l µ g/10 e 12,5 µ g/10 µ l) sobre o ventilador.
20. Uma vez que todas as medições foram realizadas e gravadas, sacrifica o animal por deslocamento cervical.

3. pulmão isolamento para análise histomorfométrica quantitativa de ratos adultos

1. Profundamente anestesiar a animal através de injeção intraperitoneal de xilazina (10mg/kg de peso corporal) e cetamina (100 mg/kg de peso corporal) (1 cc de seringa e agulha 27G). O volume de injeção deve ser 0,1 mL/10g por peso corporal.
   Nota: Depois de atingir o estado de tolerância cirúrgica, a preparação leva cerca de 5 min, seguido por perfusão de órgão e 30 min para fixação.
2. Uma vez que o animal atingiu o estado de tolerância cirúrgico (pitada-resposta negativa do dedo do pé), desinfectar o animal com 70% de etanol e corrigir o animal em uma almofada com fita cirúrgica.
3. Sacrifica o animal por punção cardíaca e hemorragia. Brevemente, abra o abdômen com uma incisão medial através da pele e o peritônio usando tesoura sem corte.
4. Localize as enfermarias de cabeça do diafragma do fígado e cuidadosamente separar o fígado do diafragma.
5. Faça uma pequena incisão no diafragma com uma tesoura sem corte, e punctate do ventrículo esquerdo do coração com uma agulha 20g anexado a uma seringa de 2 mL. Lentamente, extrair sangue do animal.
   Nota: Sangramento lento e cuidadoso é importante para evitar que os ventrículos em colapso devido a pressão negativa, inibindo um fluxo sanguíneo sem ser perturbado.
6. Disse o pulmão, abrindo o tórax suavemente através de uma incisão paraesternal ao longo de todo o comprimento da caixa torácica com uma tesoura curva, sem corte.
7. Depois, levante a caixa torácica para expor a cavidade pleural (Figura 3). Remova o timo para ver o coração e os pulmões.
   Nota: Injeção opcional do ventrículo direito, seguido de perfusão do sistema vascular pulmonar com PBS gelado e, em seguida, com uma fixador solução [por exemplo, paraformaldeído 4% (massa/volume) (PFA)] é possível. Esteja ciente de que há um risco aumentado de ruptura de septos alveolares e afectar negativamente a estrutura pulmonar usando esse método.
8. Dissecar o pulmão pelo primeiro cuidadosamente removendo o coração.
9. Posteriormente, passe uma sutura cirúrgica trançada de 4-0 entre a traqueia e o esófago usando fórceps rombudo.
10. Em seguida, cuidadosamente faça uma incisão na traqueia perto da laringe entre as cartilagens traqueais, entubar com uma cânula intravenosa (26 G) e insufle o pulmão por fixação de pressão a uma pressão constante de 20 cm H₂O usando agente fixador [por exemplo, 4% (em massa /volume) de PFA].
11. Para fixação de PFA, deixe o fixador por 30 min à temperatura ambiente. Depois, ligam a traqueia e remover a cânula. Em seguida, impostos especiais de consumo do pulmão cuidadosamente sem prejudicar o tecido e armazená-lo em agente fixador a 4 ° C durante a noite.
    Nota: Em alternativa, de acordo com o ATS/ETS consenso papel 2,5% GA em buffer OsO4, Uracil solução é usada para estabilização adequada do tecido. Para ainda mais preparação do tecido, consulte o documento de consenso por Hsia et al ¹⁴

Resultados

Resultados representativos de teste de tolerância à glicose intraperitoneal (ipGTT) (Figura 4), produtos de imagens de teste (Figura 5) e representante de função pulmonar ilustrando a hematoxilina e eosina manchado pulmões (Figura 6).

O ipGTT foi realizado em ratos obesos (azuis) depois de 7 semanas de alta--dieta rica em gordura (HFD)...

Discussão

Este relatório fornece três protocolos para três diferentes métodos analisar o impacto da obesidade no metabolismo da glicose e resultados pulmonares. Primeiro, o teste de tolerância à glicose oferece a oportunidade de analisar a absorção de glicose intracelular e pode ser indicativo de resistência à insulina. Em segundo lugar, pletismografia de corpo inteiro é uma técnica para medir a função pulmonar e é assim útil para testar a eficácia de novos tratamentos. Em terceiro lugar, um protocolo padronizado ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
GlucoMen LX	A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy	38969	blood glucose meter
GlucoMen LX Sensor	A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy	39765	Test stripes
Glucose 20%	B. Braun, Melsung, Germany	2356746
FinePointe Software	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1831-002
FinePointe RC Single Site Mouse Table	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1831-001
FPRC Controller	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1075-001
FPRC Aerosol Block	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1106-001
Aerogen neb head-5.2-4um	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-2306-001
Forceps	FST, British Columbia, Canada	11065-07
Blunt scissors	FST, British Columbia, Canada	14105-12
Micro scissors	FST, British Columbia, Canada	15000-00
Perma-Hand 4-0	Ethicon, Puerto Rico, USA	736H	Surgical suture
Roti-Histofix 4%	Roth	P087.1	4% Paraformaldehyd
Ketaset	Zoetis, Berlin, Germany	10013389	Ketamine
Rompun 2%	Bayer, Leverkusen, Germany	770081	Xylazine