복 포도 당 내성 검사, 폐 기능 측정 및 폐의 고정 비만 및 장애인된 대사 폐 결과에 미치는 영향 연구

요약

비만의 발생률 상승 하 고 만성 폐 질환의 위험을 증가 시킵니다. 설정 기본 메커니즘 및 예방 전략, 잘 정의 된 동물 모델 필요 합니다. 여기, 우리는 세 가지 방법 (포도 당 내성 검사, 몸 plethysmography, 및 폐 고정) 쥐에서 폐 결과에 비만의 효과 연구를 제공 합니다.

초록

비만 호흡기 장애는 주요 건강 문제입니다. 비만 따라서 성장 사회 경제적 부담을 나타내는 2030 1 십억 이상의 비만 개인 전세계의 예상된 번호와 신흥 유행 되고있다. 동시에, 비만 관련 comorbidities, 당뇨병, 만성 폐 질환으로 심장 등은 지속적으로 증가입니다. 비록 비만 천식 exacerbations에 대 한 위험 증가와 관련 있다, 호흡기 증상, 그리고 가난한 컨트롤의 악화 비만 만성 폐 질환의 병 인에서 교란된 물질 대사의 기능적 역할은 종종 과소 평가, 그리고 근본적인 분자 메커니즘 애매 남아 있다. 이 기사 물질 대사로 폐의 구조와 기능에 비만의 효과 평가 하는 방법을 제시 하는 것을 목표로. 여기, 우리가 쥐 연구에 대 한 세 가지 기술 설명: 포도 당 대사;에 비만의 효과 분석 하 복 포도 당 포용 력 (ipGTT)의 (1) 평가 (기도 저항 (해상도) 및 호흡기 시스템 준수 폐 기능;에 비만의 효과 분석 (Cdyn)의 측정 2) (3) 준비 및 후속 양적 조직학 평가 대 한 폐의 고정. 비만 관련 된 폐 질환은 아마 multifactorial, 조직의 염증 성 및 대사 dysregulation 잠재적으로 부정적인 영향을 주고 폐 기능 치료에 대 한 응답에서에서 형태소 분석. 따라서, 분자 메커니즘 및 새로운 치료의 효과 공부 하는 표준화 된 방법론은 필수적입니다.

서문

에 세계 보건 기구 (WHO) 2008 년에, 1.4 십억 이상의 성인, 세 20, 신체 질량 지 (수 BMI) 25; 보다 크거나와 체중 했다 또한, 이상의 200 백만 남자 그리고 거의 300 백만 여성 비만 (BMI≥30)¹. 비만 대사 증후군 주요 위험 요소는 다양 한 질병에 대 한 있습니다. 비만 수 반하는 증가 백색 지방 조직 동안 대량 속속들이 연결 되었습니다 입력 2 당뇨병^2,3, 관상 동맥 심장 질환 (CHD), 심장 마비 (HF), 심 방 세 동^{4 포함 하 여 심장 혈관 질병} 관절염⁵, 호흡기 질환의 병 인에 그들의 기능 역할 제대로 이해 남아. 그러나, 역학 학문은 설명 했다 비만 강하게 exertional 호흡, 폐쇄성 수 면 무 호흡 증 증후군 (수), 비만 것 증후군 (OHS), 만성을 포함 한 만성 호흡기 조건, 연관 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐 색 전 증, 포부 폐 렴 및 기관지 천식^6,7,,89. 비만 대사 교란된 연결 잠재적인 메커니즘, 예를 들어인슐린 저항, 유형 II 당뇨병, 만성 폐 질환의 병 인에는 뿐만 아니라 구성 한다 무게의 기계적 및 물리적 결과 환기에 뿐만 아니라 얻을 유도 subacute 만성 염증 상태^10,11. 비만 효과적인 예방 전략 및 치료 접근의 부족으로 결합 된 지난 10 년 동안 폐 병의 비만 관련 폐를 관리 하기 위해 새로운도 정의 하는 분자 메커니즘을 조사할 필요가 강조 질병입니다.

여기, 비만 및 폐 구조와 마우스 모델에서 기능에 미치는 영향을 조사 하기 위해 중요 한 기초는 3 개의 표준 테스트 설명: 기도 저항 (입술)의 (1) 복 포도 당 내성 (ipGTT) (2) 측정 및 호흡기 시스템 준수 (Cdyn); (3) 준비 및 후속 양적 조직학 평가 대 한 폐의 고정. ipGTT 측정 포도 당 통풍 관, 그리고 따라서 비만의 신진 대사에 영향을 강력한 검사입니다. 방법의 단순 실험실 사이 좋은 표준화, 그리고 그러므로 결과의 comparability을 수 있습니다. Hyperglycemic 클램프 또는 격리 된 독도 대 한 연구와 같은 보다 정교한 방법은 대사 표현 형¹²의 자세한 분석을 위해 사용할 수 있습니다. 여기 우리가 폐 결과에 추가 연구에 대 한 기준으로 조직 및 대사 장애의 비만 관련 된 상태를 정의 하는 포도 당 포용 력을 평가 합니다. 폐 기능에 비만 대사 장애의 영향을 평가 하기 위해 우리는 기도 저항 (해상도) 및 호흡기 시스템의 규정 준수 (Cdyn) 측정. 폐 질환의 특성, 폐 기능 평가 대 한 억제 뿐만 아니라 절제 된 방법을 사용할 수 있습니다. 자유롭게 이동 하는 동물에 억제 plethysmography 모방한 자연 상태를 반영 하는 호흡 패턴; 반면, 동적 폐 역학 평가 입술 깊은 마 취 쥐에서 cDyn의 입력된 임피던스 측정 등 침입 방법, 더 정확한¹³있습니다. 만성 호흡기 질환의 폐 조직 조직학 변경 반영 됩니다, 이후 추가 분석을 위해 적절 한 폐 고정 임박입니다. 것입니다 공부 될, 예를 들어 항공 또는 폐 실질¹⁴실시 폐의 조직 고정 및 준비 방법의 선택에 의하여 달려 있다. 여기, 우리가 실시 항공 천식 개발에 비만의 효과 연구의 질적, 양적 평가 허용 하는 방법을 설명 합니다.

프로토콜

모든 동물 절차는 지방 정부 당국에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 실시 되었다 (토지 NRW, AZ: 2012.A424), 그리고 독일 동물 복지 법률 및 실험 또는 사용 하는 동물의 복지에 규정 했다 다른 과학적인 용도입니다. 폐 기능 분석 폐 구조에 영향을 미칠 수 있기 때문에 따라서 연속적인 조직학 분석, 입술 및 Cdyn 준비 및 histomorphometry에 대 한 폐의 정착의 측정 다른 동물에서 수행 되어야 합니다. 그러나, 해상도 Cdyn ipGTT 다음의 측정 가능 하다. ipGTT 동안 스트레스를 방해할 수 있기 때문에 폐 기능에 필요한 마 취 테스트, 복구 기간 약 2 주 후 ipGTT 쥐 몸 무게 손실 로부터 복구할 수 있도록 것이 좋습니다 하 고 혈액 매개 변수¹²에서 변경.

1. 복 포도 당 내성 검사 (ipGTT)에 대 한 준비

참고: 후 금식의 12 h, 완전 한 ipGTT는 약 2 시간 걸립니다.

1. 때문에 스트레스는 혈당을 크게 영향, 마우스의 두 적응 뿐만 아니라 과학자의 훈련 수행 됩니다 확인 합니다.
2. 조용 하 고 스트레스 없는 조건 하에서 실험 지역에 동물을 전송 합니다.
3. 생쥐에서 비만 유발 하는 hypercaloric 규정식의 응용 프로그램을 고려 하십시오. 추가 조언에 대 한 토론 섹션 참조.
4. 12 h에 대 한 빠른 동물 하룻밤 물에 대 한 액세스를 제한 하지 않고. 다음 날, 12 h 금식, 혈액 포도 당 미터 제조 업체에 따라 준비 후의 프로토콜 ( 재료의 표참조) 테스트 스트립 포트에 새로운 테스트 스트립을 삽입 합니다.
5. 꼬리 끝의 꼬리에서 마우스를 부드럽게 유지 하면서 살 균가 위를 사용 하 여 incise 하 고 즉시 혈액 포도 당 미터의 테스트 스트립을 자유롭게 흐르는 혈액 드롭 (최소 샘플 크기 0.5 µ L)를 적용 하 여 단식된 혈액 포도 당을 측정 한다.
   참고: 카운트 다운 타이머는 혈액 샘플의 충분 한 적용 후 화면에 시작 됩니다. 4 후 s, 테스트 결과가 화면에 나타납니다.
6. 이후에, 무게 및 레이블 색 표시를 사용 하 여 개별적으로 동물.
7. 2 g 포도 당/kg 몸 무게를 통해 복 주입을 관리 합니다. 주입 량 0.1 mL/10 g 몸 무게 (27 G 바늘과 1 cc 주사기) 인지 확인 합니다.
8. 그 후, 새로운 테스트 스트립에 자유롭게 흐르는 피 한 방울을 적용 하 여 15, 30, 60, 120 분 후 혈당을 측정 합니다.
   참고: 혈 꼬리 팁-워드의 부드러운 마사지 하 여 늘릴 수 있습니다. 꼬리 상처 encrusts, 0.9% 염화 나트륨 용액으로 젖은 멸 균 면봉을 사용 하 여 청소 합니다.
9. 자신의 집 새 측정 사이 물에 대 한 무제한 액세스와 나머지 동물 허용.

2. 폐 기능 분석 측정 해상도를 cDyn

참고: 해상도 cDyn의 평온한 측정, 쥐 해야 깊은 마 취 통풍이. 스트레스 없는 동물 처리 및 마 취의 적절 한 모니터링이 필수적입니다. 무 균 기술을 사용 하 여 일반 지침을 보려면, 제발 Hoogstraten 밀러 그 외 여러분 에 의해 문서를 참조 ¹⁵

1. 실험의 각 세트 이전 plethysmograph를 보정 하 고 소프트웨어 연구 설정 준비 ( 재료의 표참조).
2. 수술 전에 깊이 anesthetize Xylazine (10 mg/kg 체중)와 케 타 민 (100mg/kg 체중)의 복 주사를 통해 동물 (27 G 바늘과 1 cc 주사기). 주입 량 0.1 mL/10 g 몸 무게 당 인지 확인 합니다.
   참고: 때문에 케 타 민 쥐에 적절 한 진통 효과가지고, 아무 추가 통증 치료 필요 하다. 침략 tracheal 카 테 테 르/plethysmograph 절차 5-7 분 정도 걸립니다 다음 데이터 수집을 시작할 수 있습니다.
3. 체온을 유지 하기 위해가 열 패드에 부정사 위치에 마우스를 놓습니다.
4. 연 고 마 취 건조 방지와 함께 눈을 커버.
5. 끊임없이 발가락 핀치-응답을 사용 하 여 마 취의 깊이 모니터링 합니다.
   참고: 마 취의 추가 관리는 마 취의 수술 평면을 유지 하기 위해 필요할 수 있습니다.
6. 70% 에탄올과 갑 상선 지역에서 외과 영역의 모피 축
7. 조심 스럽게 집게와 그것을 해제 하 고 무딘가 위 (그림 1A)를 사용 하 여 육안 검사에서 피부를 클리핑 하 여 흉 골의 jugular 노치와 괴 경 symphyses는 mentum의 대략 1 cm에 대 한 중간에 피부를 incise.
8. 시각화는 기본 피하 지방 조직을 상선.
9. 신중 하 게 무딘 지협 및 sternothyroid 및 sternothyroid 근육 (그림 1B)의 해 부에 모두 갑 상선 엽을 구분 하 여 기도 노출 합니다. 어떤 혈관 손상 원인과 출혈,이 심장 혈관 시스템에 부작용을 일으킬 수 있기 때문에 하지 조심 및 궁극적으로 측정에.
10. 그 후, 기관지와 식도 무딘 집게를 사용 하 여 4-0 꼰된 외과 봉합 사를 전달 합니다. 신중 하 게 incise 마이크로 위 tracheal 연골 사이 후 두에 가까운 기도.
11. 시각적 컨트롤 (그림 1C) 아래 tracheal 튜브 (0.04 인치/1.02 m m 직경) 넣어야. 시스템에 어떤 누출을 피하기 위해 수술 봉합 사로 결 찰을 통해 튜브를 수정 합니다.
12. 다음, 동물 시체 실의 온수 침대에 이동 하 고 얼굴 플레이트 (그림 1D) tracheal 튜브를 연결 컨트롤러 (그림 1E)의 전면 패널에 환기 버튼을 눌러 환기에 설정.
13. 설문 조사 환기 속도와 동시성 흉부 움직임을 관찰 하 여 환기. Tracheal 튜브의 적절 한 배치를 확인 하려면 가슴의 양쪽 모두 동시에 이동 해야 합니다.
14. 압력을 시계 컴퓨터 화면 (그림 1 층)에 신호. 환기 곡선 유니폼 인지 확인 합니다. 이 경우가 아니라, 동물을 분리 하 고 수술 쪽을 확인. 혈액 이나 점액 tracheal 튜브를 차단의 조심 하십시오.
    참고: 20-25 g의 몸 무게로 성인 동물에 대 한 그림 2 와 같이 송풍기 설정은 제조업체의 권장 사항을 따라 건의 된다.
15. 환기 동안 트랜스 폐 압력에 변화를 제어 하는 식도 튜브 (0.04 인치/1.02 m m 직경) 폐의 수준에 근접 하는 깊이에서 식도에 삽입 합니다. 튜브를 배치 하는 동안 화면을 시계. 최대 압력 편향과 최소한의 심장 아티팩트를 화면에서 볼 수 있는 튜브에 놓습니다.
16. 수술 후 측정을 위해 동물을 준비 합니다. 마 취를 통해 복 주입 마 취 제 (100 mg/kg 체중) 27-G 바늘과 1 cc 주사기를 사용 하 여의 reinject 주입 량 0.1 mL/10 g 몸 무게 당 인지 확인 합니다.
    참고: 기관지 hyperreagibility 평가를 nebulize methacholine 유도 기관지는 부 교감 신경의 선택적 비 muscarinic 수용 체 주 작동 근. 데이터 수집 4 개의 다른 단계 (그림 3)에서 수행 됩니다.
17. Manufacturer´s 프로토콜에 따라 데이터 수집을 시작 합니다.
    참고: 소프트웨어는 자동으로 인수 과정을 통해 사용자를 안내합니다.
18. 분무기에 10 µ L의 PBS (차량)를 적용 하 고 새 환경 순응의 5 분 후 nebulization 시작. 다음, 입술 (cmH₂O/mL/s) 및 cDyn (mL/cmH₂O) 측정은 3 분의 응답 단계를 따릅니다. 끝에, 다음 nebulization 전에 동물에 3 분의 복구 단계를 제공 합니다.
19. 호흡기에 methacholine (2.5 µ g/10 µ L, 6.25 µ g/10 µ L, 및 12.5 µ g/10 µ L)의 농도 증가의 10 µ L의 stepwise 응용 프로그램 소프트웨어에 따라.
20. 일단 모든 측정 수행 되었고 기록, 자 궁 경부 전위에 의해 동물을 희생.

3. 폐 절연 성인 쥐의 양적 Histomorphometric 분석에 대 한

1. 깊이 동물 을 통해 복 주입 Xylazine (10 mg/kg 체중)와 케 타 민 (100mg/kg 체중)의 anesthetize (27 G 바늘과 1 cc 주사기). 주입 량 0.1 mL/10 g 몸 무게 당 해야 합니다.
   참고: 외과 관용의 상태에 도달, 후 준비 기관 관류 및 고정을 위한 30 분 약 5 분 걸립니다.
2. 동물 수술의 상태에 도달 했습니다 일단 공차 (부정적인 발가락 핀치-응답), 70% 에탄올과 동물을 소독 하 고 외과 테이프와 패드에 동물을 해결.
3. 심장 빵 꾸 및 출혈 동물을 희생. 간단히, 복 부 피부와 복 막 무딘가 위를 사용 하 여 통해 중간 절 개를 엽니다.
4. 간, 개 구 횡 경 막 머리 찾아서 조심 스럽게 간 횡 경 막에서 분리 합니다.
5. 무딘가 위를 사용 하 여 횡 경 막에 작은 절 개를 만들고 punctate 20 G 바늘으로 심장의 좌 심 실 2 mL 주사기에 부착 된. 천천히 exsanguinate 동물.
   참고: 느리고 조심 exsanguination 심 그대로 혈 억제 부정적인 압력 때문에 붕괴를 방지 하기 위해 중요 하다.
6. 부드럽게 곡선, 무딘가 위를 사용 하 여 흉 곽의 전체 길이 따라 parasternal 절 개를 통해 가슴을 열고 폐를 해 부.
7. 이후에, 흉 곽 흉 막 캐비티 (그림 3C) 노출 들어올립니다. 심 혼 및 폐를 보러 thymus를 제거 합니다.
   참고: 우 심 실, 폐 혈관 시스템 얼음 처럼 차가운 PBS 그리고 통 솔루션 [예를 들어, 4% (질량/볼륨) paraformaldehyde (PFA)]의 관류 다음의 선택적 주입 가능 하다. 치경 septae 파열 하 여이 메서드를 사용 하 여 폐 구조 저하 위험 증가 다는 것을 유의 하십시오.
8. 처음으로 폐를 신중 하 게 부는 마음을 제거.
9. 그 후, 기관지와 식도 무딘 집게를 사용 하 여 4-0 꼰된 외과 봉합 사를 전달 합니다.
10. 다음, 신중 하 게 가까이 tracheal 연골 사이 후 두 기관지 incise는 정 맥 캐 뉼 러 (26 G)와 함께 넣어야, 20 cm H₂O의 일정 한 압력에서 압력 고정 하 여 폐를 팽창 통 에이전트 [예를 들어, 4% (질량을 사용 하 여 PFA의 /volume)].
11. PFA 고정을 위한 실 온에서 30 분 동안 정착 액을 둡니다. 이후에, 기관지 선 고는 정을 제거 합니다. 그리고, 조직에 손상을 주지 않고 폐를 신중 하 게 소비 세 하룻밤 4 ° C에서 통 에이전트에 저장 합니다.
    참고: 또는, ATS/ETS에 따르면 합의 종이 2.5%가 버퍼링 OsO4, Uracil 솔루션 적절 한 조직 안정화를 위해 사용 된다. 추가 조직 준비 Hsia 외. 여 합의 종이 참조 ¹⁴

결과

복 포도 당 내성 검사 (ipGTT) (그림 4)의 대표적인 결과, 폐 기능 시험 (그림 5), 그리고 대표 이미지 보여주는 되며 오신 스테인드 폐 (그림 6).

ipGTT 높은 지방 다이어트 (HFD)의 7 주 후 (파란색) 비만 생쥐에서 수행 되었다. 표준 다이어트 먹이 마우스 컨트롤 (블랙)...

토론

이 보고서는 포도 당 대사 및 폐 결과 비만 미치는 영향을 분석 하는 세 가지 다른 방법에 대 한 세 가지 프로토콜을 제공 합니다. 첫째, 포도 당 내성 검사 세포내 포도 당 통풍 관을 분석 하는 기회를 제공 하 고 인슐린 저항을 나타내는 수 있습니다. 둘째, 전체 몸 plethysmography 폐 기능을 측정 하는 기술 이며 그로 인하여 소설 치료의 효능을 테스트 도움이 됩니다. 셋째, 표준화 된 고정 프로토콜 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
GlucoMen LX	A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy	38969	blood glucose meter
GlucoMen LX Sensor	A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy	39765	Test stripes
Glucose 20%	B. Braun, Melsung, Germany	2356746
FinePointe Software	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1831-002
FinePointe RC Single Site Mouse Table	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1831-001
FPRC Controller	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1075-001
FPRC Aerosol Block	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1106-001
Aerogen neb head-5.2-4um	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-2306-001
Forceps	FST, British Columbia, Canada	11065-07
Blunt scissors	FST, British Columbia, Canada	14105-12
Micro scissors	FST, British Columbia, Canada	15000-00
Perma-Hand 4-0	Ethicon, Puerto Rico, USA	736H	Surgical suture
Roti-Histofix 4%	Roth	P087.1	4% Paraformaldehyd
Ketaset	Zoetis, Berlin, Germany	10013389	Ketamine
Rompun 2%	Bayer, Leverkusen, Germany	770081	Xylazine