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摘要

本报告描述了一种测量血浆 miRNA 绝对水平的协议, 使用定量的实时反向转录 PCR 或不预放大。该议定书对血浆 miRNAs 的数量有了更好的了解, 并允许对来自不同研究或实验室的相应数据进行定性评估。

摘要

qPCR 是评估个体目标 miRNAs 的最常用方法之一。MiRNAs 水平通常是相对于参考样本进行测量的。这种方法适用于检查目标基因表达水平的生理变化。然而, 使用更好的统计分析进行绝对量化, 对基因表达水平的综合评估是可取的。绝对量化仍然没有共同使用。本报告描述了一种用于测量血浆 miRNA 绝对水平的协议, 使用的是带有或不具有预放大的 qPCR。

从有意识猕猴猴股静脉收集的血液中制备了一定量 (200 µL) EDTA 血浆 (n = 50)。利用商用系统提取总 RNA。以探针为基础的 qPCR 检测方法对血浆 miRNAs 进行量化, 其中含有 miRNA 特异的正向/反向 PCR 底漆和探针。利用商用合成 RNA 寡核苷酸生成绝对量化的标准曲线。合成 cel-miR-238 被用作标准化和质量评估的外部控制。在 qPCR 步骤之前, 显示量化周期 (miRNAs) 值超过35的数据是预放大的。

在检查的 8 miRNAs 中, miR-122、miR-133a 和 miR-192 没有预放大, 而 miR-1、miR-206 和 miR-499a 需要预放大, 因为它们的表达水平较低。MiR-208a 和 miR-208b 在预扩后都无法检测到。用尖刺 cel-miR-238 的取值评价样品的加工效率。在这种检测方法中, 技术变异估计小于3倍, 量化的下限 (LLOQ) 为 102拷贝/µL, 对于大多数被检查的 miRNAs。

该协议提供了一个更好的估计血浆 miRNAs 的数量, 并允许质量评估的相应数据从不同的研究。考虑到体液中 miRNAs 的数量较少, 预扩有助于提高对表达不良 miRNAs 的检测。

引言

越来越多的研究一直在探索 microRNAs (miRNAs) 作为癌症诊断和预后的标志物, 或监测和检测其他疾病的有意和临床研究1,2,3.定量实时反向转录 PCR (RT qPCR) 是评估单个目标 miRNAs 最常用的方法之一, 因为该技术比微阵列4和基于 RNA 排序的平台5更敏感。通常, miRNA 表达式是使用ΔCq 方法6来相对于引用示例进行度量的。这种方法适合于研究目标基因表达水平的生理变化。然而, 相对量化的循环 miRNAs 的效用有限, 因为它们的数量很小。此外, 技术的变化使得很难比较不同研究的结果, 因为不同的实验室对 RT qPCR 实验协议进行了不同的定制, 从而导致不一致甚至矛盾的结果从不同的研究7。

鉴于上述关注, 绝对量化可能更适合于评估体液中微量的 miRNAs。绝对量化方法使用由已知的合成 RNA 寡核苷酸所产生的标准曲线, 其顺序与相应的目标 miRNA8相同。卫生和环境科学研究所 (何思) 基因组学技术委员会最近进行了综合研究, 以比较在多个试验场的等离子 miRNAs 的绝对测量结果。结果表明, 使用标准协议进行绝对定量的 miRNAs 在多个测试站点9中产生了可比较的结果。本研究所描述的 RT qPCR 法与何思的标准协议几乎相同, 包括多 miRNA 靶的复用分析和预放大, 以帮助检测低表达 miRNAs。

在本研究中, 从有意识的猕猴猴 (n = 50) 的股静脉收集的血液中制备的 EDTA 等离子体固定容积 (200 µL) 使用了10。下面的协议描述了制备血浆样品、提取 miRNA 和 qPCR 的过程, 包括预放大。更重要的是, 还包括了有关该协议的其他技术信息, 以使样品中的目标 miRNAs 数量能够与一个合格的流程相结合来验证。首先, 在生物样品定量化之前, 对每个 miRNA 的标准曲线进行了验证。其次, 利用外部控制 (cel-miR-238) 的值对当前方法的质量进行综合评价。因此, 这个平台提供了更多的信息和可靠的数据, 以比较不同的研究或实验室的结果。

本文介绍了 8 miRNAs 的概况, 作为本报告所述化验方法的代表性结果。这些 miRNAs 被建议作为潜在的安全生物标志物与组织损伤的肝脏 (miR-122 和 miR-192), 心脏 (miR-1, miR-208a, miR-208b 和 miR-499a), 骨骼肌肉 (miR-133a 和 miR-206) 在啮齿目动物和人3, 11,12,13。

研究方案

所有实验均由第一惠州市三协有限公司机构动物护理和使用委员会批准。

1. 样品准备

  1. 收集血液 (至少0.5 毫升) 从猕猴猴的股静脉进入 EDTA 2 含钾管。
    注: 柠檬酸和肝素是不可接受的, 因为这些抗凝剂抑制后续 PCR14,15。
  2. 将收集的样品立即放在冰上, 并在收集2小时内等离子隔离过程。
  3. 离心样品在 1万 x g 在4°c 为5分钟。
  4. 将上清液转移到2毫升微细, 然后离心 1.6万 x 克, 4 摄氏度, 以去除细胞碎片和残余血小板。
    注: 血小板污染可显著影响 miRNAs 的量化16。
  5. 放置200µL 整除数到新鲜2毫升-管内, 并存储在-80 °c, 直到使用。
    注: 每个样品的固定体积用于 RNA 提取;因此, 整除的体积必须准确。

2. RNA 提取

  1. 在冰上解冻冰冻样品 (从步骤 1.5)。
    1. 在 RNA 提取过程中, 将样品冷藏在冰上。冷却裂解试剂和氯仿在冰使用之前。
  2. 加入5卷 (1000 µL) 的裂解试剂, 含有苯酚和异硫氰酸胍的单相溶液, 对样品 (200 µL), 并积极混合涡流1分钟。
  3. 添加5µL 5 nM 合成秀丽线虫miRNA (Syn-cel-miR-238-3p)。
  4. 添加1体积 (200 µL) 氯仿, 并大力混合涡流1分钟。
  5. 在冰上保持2到3分钟, 然后离心样品在 1.2万 x g 在4°c 为15分钟。
  6. 小心地将水相转移到新的微细。
    注意: 不要转移任何有机相 (红色) 或界面 (白色)。所收集的水相的体积应均匀, 以避免处理不一致, 从而增加技术变化。该协议中通常的水相转移量为650µL。
  7. 添加1.5 卷 (975 µL) 的乙醇, 并混合良好的吹打上下。
  8. 将样品转移到相应的列和适配器中, 然后用真空流形进行真空干燥3分钟。如果示例卷超过700µL, 请重复此步骤以处理剩余的解决方案。
    注意: 基于柱的 RNA 隔离与真空和离心法是相容的。
  9. 在柱上加200µL 乙醇, 然后真空干燥1分钟。
  10. 添加800µL 的 RWT 缓冲柱, 其次是真空干燥2分钟。
  11. 将800µL 的 RPE 缓冲器添加到柱上, 然后真空干燥2分钟。
  12. 重复步骤2.11。
  13. 在柱上加300µL 乙醇, 然后真空干燥1分钟。
  14. 将该列置于新的微细上, 并在室温下 (15 至25°c) 的离心机在 1.2万 x g 处进行1分钟。
  15. 将该列转移到新的微细, 并添加50µL 的核酸酶水。
  16. 在室温下 (15 至25°c) 站立3分钟, 离心机在室温下 (15 至25°c) 为1分钟。
  17. 将洗脱液重新应用于该列。
  18. 重复步骤 2.16, 并存储洗脱液在-80 °c, 直到使用。

3. cDNA 合成

  1. 解冻冷冻样品 (从步骤 2.18)。
  2. 准备已知与靶 miRNAs 相对应的合成 RNA 寡核苷酸的浓度。
    1. 使用合成 RNA 寡核苷酸在 qPCR 中生成标准曲线。为存储目的准备了 1 x 108复制/µL 浓度的库存解决方案。
    2. 稀释库存解决方案10倍, 以获得 1 x 107复制/µL (不预放大的样本) 或 1 x 105复制/µL (预放大的样本) 工作解决方案作为最集中的构造标准曲线。一般而言, 标准曲线浓度的建议范围为 1 x 107到 1 x 102复制/µL (不预放大样本) 或 1 x 105到 1 x 100复制/µL (预放大的样本)。
  3. 为目标 miRNAs 混合等量的 20x rt 底漆, 制备复合 rt 引物池。
    注意: 如图 2所示, 可以通过混合池中每个 miRNAs 的 20x RT 底漆来进行包含多达4个目标 miRNAs 的池。Cel-miR-238 (外部控制) 必须包括在每管的目标 miRNAs 之一。如果目标 miRNAs 少于 4, 则添加等量的 1/10 TE 缓冲器, 而不是 20x RT 底漆。
  4. 准备 rt 反应组合: 3 µL 的 rt 底漆池 (从步骤 3.3), 0.15 µL 100 毫米 dNTPs 与 dTTP, 1 µL 逆转录酶 (50 U/µL), 1.5 µL 10x RT 缓冲器, 0.19 µL RNase 抑制剂 (20 U/µL), 4.16 µL 无核酸酶水。
  5. 混合10µL 的 RT 反应混合与5µL RNA 样品 (从步骤 3.1) 或寡核苷酸 (从步骤 3.2) 吹打, 并在冰上孵化5分钟。
  6. 在热循环仪装置上运行反向转录:16 °c 为30分钟, 42 摄氏度为30分钟, 其次为85°c 的最终逆转录酶失活步骤5摄氏度, 直到使用。

4. 前置放大 (可选)

注意: 在后续 qPCR 中显示 miRNAs 值超过35或更多的数据被预放大。

  1. 解冻冷冻样品 (从步骤 3.6)。
  2. 用合成 RNA 寡核苷酸制作10倍稀释的 RT 产品;1 x 105到 1 x 100复制/µL 生成标准曲线。
  3. 用20x 检测引物的等量容积 (5 µL) 混合等体积的方法制备靶 miRNAs, 并将每种测定底漆的最终浓度稀释200倍, 最后体积为1000µL。
    注: 检测底漆的靶 miRNAs 可以在随后的 qPCR, 而不预先放大, 而那些 cel-miR-238 (外部控制) 不包括在底漆池。
  4. 准备预放大反应组合: 12.5 µL 2x 准备使用的前置放大试剂, 3.75 µL 的化验底漆池 (从步骤 4.3), 6.25 µL 核酸酶水。
  5. 混合22.5 µL 预放大反应混合与2.5 µL 的反向转录样品 (从步骤 4.1) 或寡核苷酸 (从步骤 4.2) 吹打, 并在冰上孵化5分钟。
  6. 在热循环仪装置上运行反应:95 °c 为10分钟;其次是12周期95°c 为十五年代和60°c 为4分钟. 在-80 摄氏度之前存储预放大的样品, 直到使用。

5. 定量实时 PCR (qPCR)

  1. 解冻冷冻样品 (从步骤3.6 或步骤 4.6)。
  2. 用无菌水稀释样品5倍。
  3. 制备由合成 RNA 寡核苷酸衍生的 RT 产品的10倍串行稀释;1 x 107到 1 x 102复制/µL (不预放大的样本) 或 1 x 105到 1 x 100复制/µL (预放大的样本), 用于生成标准曲线。
  4. 准备 qPCR 反应组合:10 µL 的2x 准备使用的扩增试剂, 1 µL 20x 化验试剂, 含有前/反 PCR 底漆和探针对应的目标 miRNA, 7 µL 无核酸酶水。
  5. 将18µL 从 qPCR 反应混合到快速光学96阱反应板, 并将稀释后的样品的2µL (从步骤5.2 或步骤 5.3) 添加到油井中。
    注: qPCR 的样品和标准以重复的方法设置。
  6. 用胶膜密封板材, 并简要地进行离心。
  7. 在实时热循环仪上运行反应:95 °c 二十年代, 其次45周期95°c 为 1 s 和60°c 为二十年代。

6. 数据分析

  1. 使用与相应实时热循环仪对应的数据分析软件计算每个示例的原始副本数。
    注: 在研究中, 所有板块的阈值线被手动设置为 "1.0", 以确认其重现性。截止级别设置在重庆 > 40 周期。
  2. 计算每个样本的原始副本数与重复项的平均值。
  3. 通过将每个样本中的 cel-miR-238 的拷贝数除以相应管中所有样本的 cel-miR-238 的平均值来计算校正因子。
    注意: 如图 2所示, 每个管都包含多达4个目标 miRNAs, 包括 cel-miR-238 (外部控件)。因此, 用相应的 cel-miR-238 值计算各管的校正系数。
  4. 通过将每个样本的平均原始副本编号 (从步骤 6.2) 除以每个样本的修正因子 (从步骤 6.3) 来计算调整后的副本编号。
  5. 通过将每个样本的调整原始副本编号 (从步骤 6.4) 乘以每个样本的稀释系数来计算绝对副本数。
    注: 该协议中的稀释系数为 "5", 这是从步骤5.2 派生的。
  6. 计算每种序列稀释对测井 cDNA 浓度的预测, 提高 PCR 放大值的效率。
    注: 计算效率的公式;E = (10(-1/斜率) -1) x 100%。
  7. 使用公式 E = (2 x 放大效果)ΔCt (最大 (cel-miR-238) Min (重庆)), 用所有样本中的值计算技术变化。
    注: 步骤6.5 和6.7 用于质量评估程序。

结果

miRNA 检测工作流 qPCR 和质量 assessment
图 1显示了使用 qPCR10的血液样本 miRNA 检测的工作流。实验的质量可以通过将 cel-miR-238 作为外部控制来验证。这将揭示 RNA 提取和随后的 qPCR 过程的技术变化。在本研究中, 由50个样本计算出的重庆值的平均值为 21.0 0.4 (表 1)。如果 cel-miR-238 由于预放大步骤而被稀?...

讨论

我们的综合评估对动态范围的范围提供了更严格的统计分析, 这清楚地表明, 在 miRNAs 测试中, 单个样品之间的变化幅度极不相同。虽然这些变化可能是由于其体液中的少量, 但应该指出, 这些数据不仅反映了生物的变化, 而且还体现了技术上的变化。大多数技术变化可以通过外部控制 (cel-miR-238) 的值来评估, 在其他检测平台18中使用。由于 miRNA 分析中没有标准化的内部控制, 因此在?...

披露声明

提交人没有任何利益冲突可供披露。

致谢

这项研究没有得到公共、商业或非营利部门的资助机构的任何具体补助金。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
BD Microtainer tube (K2EDTA)Becton, Dickinson and Company365974For blood collection
Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mLEppendorf0030124359
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  1.5 mLEppendorf0030120086
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  2.0 mLEppendorf0030120094
Synthetic oligonucleotideHokkaido System Science-Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade)
Tris-EDTA Buffer  (pH 8.0)Nippon Gene314-90021TE buffer
Buffer RPEQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
Buffer RWTQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
miRNeasy Mini KitQIAGEN217004
Nuclease-Free Water QIAGEN129114
QIAzol Lysis ReagentQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic QIAGEN219600ID:MSY0000293, 5 nmol
SC AdaptersTAIGEN Bioscience CorporationS0120For RNA extraction
VacEZor 36 Complete SystemTAIGEN Bioscience CorporationM3610For RNA extraction
7900HT Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific Inc.4351405Fast 96-Well Block
GeneAmp PCR System 9700Thermo Fisher Scientific Inc.9700
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction PlateThermo Fisher Scientific Inc.4346907
MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific Inc.4311971
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific Inc.4444557
TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000248
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002245
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002246
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002222
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000491
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000510
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000511
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002290
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 001352
TaqMan MicroRNA Reverse
Transcription Kit		Thermo Fisher Scientific Inc.4366597
TaqMan PreAmp Master Mix (2×)Thermo Fisher Scientific Inc.4391128
Chloroform Wako Pure Chemicals035-02616
Ethanol (99.5)Wako Pure Chemicals057-00456

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