JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем докладе описывается протокол для измерения абсолютного уровня плазмы Мирна, использование количественных реального времени обратной транскрипции ПЦР с или без предварительного усиления. Этот протокол предоставляет лучшего понимания количества плазмы адаптивной и позволяет качественной оценки соответствующих данных из различных исследований или лаборатории.

Аннотация

RT-ПЦР является одним из наиболее распространенных методов для оценки отдельных целевых адаптивной. Интерферирующим уровни обычно измеряется относительно эталонного образца. Этот подход является подходящим для изучения физиологических изменений в целевые уровни выражения гена. Тем не менее абсолютное количественной оценки, используя лучше статистический анализ является предпочтительным для всеобъемлющей оценки уровни выражения гена. Абсолютная количественной оценки до сих пор не в общем пользовании. В настоящем докладе описывается протокол для измерения абсолютного уровня плазмы Мирна, используя RT-ПЦР с или без предварительного усиления.

Фиксированный объем (200 мкл) ЭДТА-плазмы был подготовлен из крови, собранные из бедренной вены обезьян Cynomolgus, получавших сознательного (n = 50). Общая РНК был извлечен с использованием коммерчески доступные системы. Интерферирующим плазмы были количественно методом на основе выборки RT-ПЦР анализа, которые содержит Мирна специфического праймера PCR реверса и зонд. Стандартные кривые для абсолютной количественной оценки были получены с помощью коммерчески доступных синтетические олигонуклеотиды РНК. Синтетический чел мир-238 был использован как внешнего управления для нормализации и качества оценки. Адаптивной, которые показали количественного определения цикла (Cq) значения выше 35 были предварительно усиливается до шаг ПЦР.

Среди 8 интерферирующим изучены мир-122, мир 133а и мир-192 были обнаруживаемыми без предварительного усиления, в то время как мир-1, мир-206 и мир 499a требуется предварительное усилители из-за их низкой выражение уровня. Мир 208А и мир 208В не было обнаружено даже после предварительного усиления. Пример обработки эффективность оценивалась по значениям Cq шипами чел мир-238. В этом методе анализа технические различия, по оценкам, будет меньше, чем 3 раза и нижний предел количественного определения (LLOQ) было 102 копии/мкл, для большинства обследованных адаптивной.

Этот протокол обеспечивает более точную оценку количества плазмы адаптивной и позволяет оценки качества соответствующих данных из различных исследований. Учитывая, что небольшое количество интерферирующим в жидкостях организма, предварительного усиления является полезным для улучшения обнаружения плохо выразил адаптивной.

Введение

Все большее количество исследований изучает микроРНК (интерферирующим) в качестве биомаркеров для диагностики и прогноза рака, или мониторинг и обнаружение других заболеваний в доклинических и клинических исследований,1,2,3 . Количественные реального времени обратной транскрипции ПЦР (RT-ПЦР) является одним из наиболее распространенных методов, используемых для оценки отдельных целевых адаптивной, потому что этот метод является более чувствительным, чем microarray дна4 и РНК последовательности на основе платформы5. В общем Мирна выражение измеряется относительно эталонного образца, с помощью метода ΔCq6. Этот подход подходит для изучения физиологических изменений в целевые уровни выражения гена. Однако относительно количественной оценки циркулирующих интерферирующим ограниченную полезность из-за их малого количества. Кроме того технические изменения делает его трудно сравнивать результаты различных исследований, потому что различные лаборатории настроить RT-ПЦР экспериментальные протоколы по-разному, что приводит к несовместимым или даже противоречивые результаты от 7различные исследования.

С учетом проблем, упомянутых выше абсолютной количественной оценки может быть более подходящим для оценки небольших количествах интерферирующим в жидкостях организма. Метод количественной оценки абсолютной использует калибровочной кривой, созданный из известных концентрациях синтетические олигонуклеотиды РНК, которые идентичны в последовательности, соответствующей целевой Мирна8. Здравоохранения и экологических наук Институт (HESI) технический комитет по геномике недавно провели всеобъемлющие исследования для сравнения результатов абсолютных измерений интерферирующим плазмы, нескольких сайтах тест. Результаты показали, что использование стандартного протокола для абсолютной количественный интерферирующим показывают сопоставимые результаты через несколько сайтов тест9. RT-ПЦР анализа методом, описанным в настоящем исследовании практически идентичен HESI стандартный протокол, который включает мультиплексированных анализ нескольких целей Мирна и предварительного усиления помощи обнаружения низких выражение адаптивной.

В этом исследовании, фиксированного объема (200 мкл) ЭДТА-плазмы из крови собранные от бедренной вены обезьян Cynomolgus, получавших сознательного (n = 50) был используется10. Следующий протокол описывает процедуру для подготовки проб плазмы, добыча Мирна и RT-ПЦР, включая предварительное усилители. Что еще более важно дополнительную техническую информацию о протоколе была включена, так что количество целевых интерферирующим в пробах может быть проверен в сочетании с высококвалифицированных процесса. Во-первых стандартной кривой каждого Мирна был апробирован для его обнаружения отдельных диапазона до его количественной оценки в биологических образцах. Во-вторых качество нынешней методологии было всесторонне оценивать с помощью ов значения внешнего контроля (чел мир-238). Таким образом эта платформа дает более информативным и достоверных данных для сравнения результатов различных исследований или лаборатории.

Как представитель результаты в настоящем докладе были включены профили 8 интерферирующим от метода анализа, описанный здесь. Эти интерферирующим были предложены как потенциальной безопасности биомаркеров, связанные с повреждения тканей печени (мир-122 и мир-192), сердца (мир-1, мир 208А, мир 208В и мир 499a) и скелетных мышц (мир 133а и мир-206) в люди и грызунов в3, 11,12,13.

протокол

Все эксперименты были утверждены институциональный уход животных и использование Комитета Daiichi Санкё Co., Ltd.

1. Пробоподготовка

  1. Сбор крови (по крайней мере 0,5 мл) от бедренной вены обезьян Cynomolgus, получавших в 2K-содержащие ЭДТА трубы.
    Примечание: Цитрата и гепарина не приемлемо потому, что эти антикоагулянты подавляют последующих ПЦР14,15.
  2. Место собранные образцы сразу на льду и процесс для плазмы изоляции в течение 2 часов коллекции.
  3. Центрифугуйте образцы на 10000 x g при 4 ° C за 5 мин.
  4. Перенесите супернатант в 2 мл микропробирок, последующим центрифугированием в 16000 x g при 4 ° C за 5 мин для удаления мусора клеток и остаточные тромбоцитов.
    Примечание: Количественная оценка интерферирующим могут быть затронуты существенно тромбоцитов загрязнение16.
  5. Место 200 мкл аликвоты супернатант в свежий 2 мл пробирок и хранить при температуре-80 ° C до использования.
    Примечание: Фиксированный объем каждого образца используется для извлечения РНК; Таким образом объем Алиготе должен быть точным.

2. РНК добыча

  1. Оттепель замороженных образцов на льду (с шагом 1,5).
    1. Держите образец холодный на льду во время извлечения РНК. Chill лизис реагента и метилхлороформа на льду до использования.
  2. Добавьте 5 томов (1000 мкл) лизис реагента, содержащий монофазные раствор фенола и гуанидина Изотиоцианаты, на пример (200 мкл) и смесь энергично, vortexing за 1 мин.
  3. 5 мкл 5 Нм синтетических Мирна Caenorhabditis elegans (Syn чел мир-238-3 p).
  4. Добавление 1 (200 мкл) количества метилхлороформа и смесь энергично, vortexing за 1 мин.
  5. Держите на льду для 2-3 мин, а затем Центрифугуйте образцы на 12000 x g при 4 ° C на 15 мин.
  6. Передать водяной участок тщательно новой микропробирок.
    Примечание: Не передавать любые органические фазы (красный) или межфазовые изолирующие (белый). Объем водной фазы сбора должны быть единообразными чтобы избежать непоследовательности, что приводит к увеличению технических вариантов обработки. Обычно количество водной фазы, переведены в этот протокол был 650 мкл.
  7. Добавить 1,5 томов (975 мкл) этанола и смешайте хорошо закупорить вверх и вниз.
  8. Передача образцов в соответствующий столбец и адаптер, а затем вакуумной сушки на 3 мин, с использованием вакуумных коллекторов. Если объем образца является более чем 700 мкл, повторите этот шаг, чтобы обработать оставшийся раствор.
    Примечание: На основе столбцов РНК изоляция совместимы с методом вакуум и центрифугирования.
  9. Добавьте 200 мкл этанола в столбце, следуют вакуумной сушки за 1 мин.
  10. 800 мкл буфера RWT, в столбце, а затем вакуумной сушки на 2 мин.
  11. 800 мкл буфера НПП, в столбце, а затем вакуумной сушки на 2 мин.
  12. Повторите шаг 2.11.
  13. Добавьте 300 мкл этанола в столбце, следуют вакуумной сушки за 1 мин.
  14. Поместите колонки на новой Микропробирка и центрифуги на 12000 x g при комнатной температуре (15-25 ° C) 1 мин.
  15. Передать новый Микропробирка столбец и добавьте 50 мкл воды, свободной от нуклеиназы.
  16. Постоять при комнатной температуре (15-25 ° C) 3 мин и центрифуги на 8000 × g при комнатной температуре (15-25 ° C) 1 мин.
  17. Повторно примените элюата к столбцу.
  18. Повторите шаг 2.16 и хранить элюата-80 ° c до использования.

3. синтез cDNA

  1. Оттепель замороженных образцов (из шага 2.18).
  2. Подготовьте известной концентрации синтетические олигонуклеотиды РНК, которые соответствуют целевой адаптивной.
    1. Использование синтетических РНК олигонуклеотида для генерации калибровочной кривой в ПЦР. Стоковый раствор 1 x 108 копия/мкл концентрации готовится для целей хранения.
    2. Разбавьте раствор 10 раз для получения 1 x 107 копирования/мкл (не предварительно усиленный образцы) или 1 x 105 копирование/МКЛ (предварительно усиленный образцы) рабочий раствор как самая высокая концентрация для построения калибровочной кривой. В общем предлагаемый диапазон для стандартной кривой концентрации — 1 x 10-7 до 1 x 102 копии/мкл (не предварительно усиленный образцы) или 1 x 10-5 до 1 x 100 копия/мкл (предварительно усиленный образцы).
  3. Подготовьте мультиплекс RT грунтовка бассейн, смешивая равных объемах 20 x RT Праймеры для целевых адаптивной.
    Примечание: Как показано на рисунке 2, бассейн, содержащие до 4 Цель адаптивной могут быть сделаны смешивания 20 x RT праймеры каждого из интерферирующим в бассейне. Чел мир-238 (внешнего управления) должны быть включены в качестве одного из целевых интерферирующим в каждой тюбике. В случае менее 4 Цель адаптивной добавьте равных объемах 1/10 TE буфера вместо 20 x RT грунтовка.
  4. Подготовьте смесь реакции RT: 3 мкл RT грунтовка Бильярд (из шага 3.3), 0,15 мкл дНТФ 100 мм с dTTP, 1 мкл обратной транскриптазы (50 U/мкл), 1.5 мкл 10 x буфер RT, 0.19 мкл АБС битор РНКазы (20 U/мкл) и 4.16 мкл нуклеиназы свободной воды.
  5. Смесь 10 мкл реакции RT смешать с 5 мкл пример РНК (из шага 3.1) или олигонуклеотиды (из шага 3.2), закупорить и инкубировать на льду на 5 мин.
  6. Запуск обратной транскрипции на аппарат тепловая велосипедист: 16 ° C в течение 30 мин, 42 ° C в течение 30 мин, следуют окончательный обратной транскриптазы инактивации шаг на 85 ° C за 5 мин обратной транскрипции образцов магазина-80 ° c до использования.

4. Предварительное усиление (опционально)

Примечание: Адаптивной, которые показывают значения Cq выше 35 или более последующих ПЦР предварительно усиливается.

  1. Оттепель замороженных образцов (из шага 3.6).
  2. Сделать десятикратного серийных разведений RT продукта от синтетические олигонуклеотиды РНК; 1 х 105 0 1 x 10 копирования/мкл для генерации калибровочной кривой.
  3. Подготовиться мультиплекс пробирного грунтовка бассейн смешиванием равных объемах (5 мкл) 20 x пробирного грунтовки целевой интерферирующим с конечной концентрации каждого пробирного грунт, будучи разбавленным кратное буфером TE окончательный объем 1000 мкл.
    Примечание: Пробирного грунты, чья цель адаптивной может быть обнаружено в последующих ПЦР без предварительного усиления и те, для чел мир-238 (внешнего управления) не включены в грунт бассейн.
  4. Подготовка предварительного усиления реакции микс: 12,5 мкл 2 x готовых к использованию идиомой реагента, 3,75 мкл пробирного грунтовка пула (от шага 4.3) и 6,25 мкл воды, свободной от нуклеиназы.
  5. Mix 22,5 мкл предварительное усиление реакции смешать с 2,5 мкл обратной транскрипции образца (от шага 4.1) или олигонуклеотиды (из шага 4.2), закупорить и инкубировать на льду на 5 мин.
  6. Запуск реакции на аппарат тепловая велосипедист: 95 ° C в течение 10 минут; После 12 циклов 95 ° c на 15 s-60 ° C в течение 4 минут хранить предварительно усиленный образцов-80 ° c до использования.

5. Количественная ПЦР в реальном времени (ПЦР)

  1. Оттепель замороженных пробах (шаг 3,6 или шаг 4.6).
  2. 5 раз развести образцы стерильной водой.
  3. Подготовить десятикратного серийных разведений RT продукт, полученный из синтетические олигонуклеотиды РНК; 1 x 10-7 до 1 x 102 копии/мкл (не предварительно усиленный образцы) или 1 x 10-5 до 1 x 100 копия/мкл (предварительно усиленный образцов) для создания стандартных кривых.
  4. Подготовьте смесь реакции ПЦР: 10 мкл 2 x готовых к использованию амплификации реагента, 1 мкл 20 x пробирного реагента, содержащий реверса праймера PCR и соответствующий целевой Мирна, зонд и 7 мкл воды, свободной от нуклеиназы.
  5. Передача 18 мкл из смеси реакции ПЦР на тарелки быстро оптических 96-луночных реакции и 2 мкл разбавленного образцов (от шаг 5.2 или шаг 5.3) в скважинах.
    Примечание: Образцы и стандарты для ПЦР в задаются дубликаты.
  6. Печать пластины с липкой пленкой и кратко центрифуги.
  7. Запуск реакции на реальном времени тепловая велосипедист: 95 ° C 20 s, а затем 45 циклов 95 ° c 1 s и 60 ° C для 20 s.

6. анализ данных

  1. Вычислите сырья копировать количество каждого образца, используя программное обеспечение для анализа данных, которая работает с соответствующего реального времени тепловая велосипедист.
    Примечание: Линия порог устанавливается вручную для «1.0» в всех плит в исследовании, для подтверждения воспроизводимость по сравнению с их vales Cq. Пороговый уровень установлен на Cq > 40 циклов.
  2. Вычислить среднее количество сырой копии каждого образца из дубликатов.
  3. Вычислить поправочный коэффициент путем деления копировать количество чел мир-238 в каждом образце в среднем копировать количество чел мир-238 от всех образцов в соответствующую трубку.
    Примечание: Как показано на рисунке 2, каждая трубка содержит до 4 Цель адаптивной, включая чел мир-238 (внешний элемент). Таким образом поправочный коэффициент рассчитывается для каждой трубы, используя соответствующее значение чел мир-238.
  4. Вычислить число скорректированных копирования путем деления числа усредненной сырой копии каждого образца (от шаг 6.2), поправочный коэффициент (от шаг 6.3) для каждого образца.
  5. Вычислить число абсолютной копией, умножив число скорректированных сырой копии каждого образца (с шагом 6,4) коэффициент разрежения для каждого образца.
    Примечание: Коэффициент разрежения является «5» в настоящем Протоколе, который является производным от шаг 5.2.
  6. Расчет эффективности амплификации PCR от склона участка ов значений для каждого последовательного растворения против журнала cDNA концентрации.
    Примечание: Формула для расчета эффективности; E = (10(-1/склон) -1) x 100%.
  7. Рассчитать технических вариантов, с помощью значения Cq чел мир-238 от всех образцов, используя формулу E = (2 x усиления эффективности)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)).
    Примечание: Шаги 6.5 и 6.7 используются для оценки качества процедуры.

Результаты

Рабочий процесс анализа Мирна, RT-ПЦР и оценкой качестваt
Рисунок 1 показывает процесс Мирна пробирного из образцов крови с помощью ПЦР10. Можно проверить качество экспериментов, включая чел мир-238 как внешний элемент управлен...

Обсуждение

Нашей всеобъемлющей оценки представила более строгий статистический анализ степени динамического диапазона, который четко указал, что масштабы различия между отдельными пробами очень разные среди интерферирующим испытания. Хотя эти различия можно объяснить их небольших количества?...

Раскрытие информации

Автор не имеет никакого конфликта интересов раскрыть.

Благодарности

Это исследование не получил каких-либо конкретных грант от финансирующих учреждений в государственных, коммерческих, или не для некоммерческих секторах.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
BD Microtainer tube (K2EDTA)Becton, Dickinson and Company365974For blood collection
Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mLEppendorf0030124359
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  1.5 mLEppendorf0030120086
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  2.0 mLEppendorf0030120094
Synthetic oligonucleotideHokkaido System Science-Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade)
Tris-EDTA Buffer  (pH 8.0)Nippon Gene314-90021TE buffer
Buffer RPEQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
Buffer RWTQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
miRNeasy Mini KitQIAGEN217004
Nuclease-Free Water QIAGEN129114
QIAzol Lysis ReagentQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic QIAGEN219600ID:MSY0000293, 5 nmol
SC AdaptersTAIGEN Bioscience CorporationS0120For RNA extraction
VacEZor 36 Complete SystemTAIGEN Bioscience CorporationM3610For RNA extraction
7900HT Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific Inc.4351405Fast 96-Well Block
GeneAmp PCR System 9700Thermo Fisher Scientific Inc.9700
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction PlateThermo Fisher Scientific Inc.4346907
MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific Inc.4311971
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific Inc.4444557
TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000248
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002245
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002246
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002222
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000491
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000510
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000511
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002290
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 001352
TaqMan MicroRNA Reverse
Transcription Kit		Thermo Fisher Scientific Inc.4366597
TaqMan PreAmp Master Mix (2×)Thermo Fisher Scientific Inc.4391128
Chloroform Wako Pure Chemicals035-02616
Ethanol (99.5)Wako Pure Chemicals057-00456

Ссылки

  1. Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
  2. Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
  3. D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
  4. Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
  5. Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
  6. Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
  7. Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?--The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
  8. Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
  9. Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
  10. Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
  11. Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
  12. Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
  13. Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
  14. Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
  15. Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
  16. Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
  17. Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson's disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
  18. Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
  19. Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
  20. Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
  21. Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
  22. Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
  23. Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
  24. Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
  25. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
  26. Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
  27. Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
  28. Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

132

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены