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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur Messung der absoluten Werte der Plasma MiRNA, quantitative Real-Time reverse Transkription PCR verwenden, mit oder ohne Vorverstärkung. Dieses Protokoll bietet besseres Verständnis für die Menge an Plasma MiRNAs und qualitative Bewertung der entsprechenden Daten aus verschiedenen Studien oder Labors ermöglicht.

Zusammenfassung

RT-qPCR ist eine der häufigsten Methoden, um einzelne Ziel MiRNAs bewerten. MiRNAs sind in der Regel im Vergleich zu einer Referenzprobe gemessen. Diese Methode eignet sich für die Prüfung von physiologischer Veränderungen im gen Ausdruck Zielwerte. Absolute Quantifizierung mit besseren statistischer Analyse ist jedoch für eine umfassende Bewertung der gen-Expression-Ebenen vorzuziehen. Absolute Quantifizierung ist noch nicht gebräuchlich. Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur Messung der absoluten Werte der Plasma MiRNA, mit RT-qPCR, mit oder ohne Vorverstärkung.

Ein bestimmtes Volumen (200 µL) von EDTA-Plasma wurde aus dem Blut gesammelt von der femoral Ader des bewussten Cynomolgus Affen vorbereitet (n = 50). Gesamt-RNS war mit im Handel erhältlichen System extrahiert. Plasma-MiRNAs wurden durch Testbasierte RT-qPCR-Assays die MiRNA-spezifische Vor-/Rücklauf PCR Primer und Sonde enthält quantifiziert. Standardkurven für absolute Quantifizierung wurden mit handelsüblichen synthetische RNA-Oligonukleotide erzeugt. Eine synthetische Cel-MiR-238 diente als eine externe Steuerung für die Normalisierung und Qualität. Die MiRNAs, die Quantifizierung Zyklus (Cq) Werte über 35 gezeigt wurden vorverstärkt vor dem qPCR-Schritt.

Unter den 8 MiRNAs untersucht waren MiR-122, MiR-133a und MiR-192 nachweisbar ohne Vorverstärkung, während MiR-1 und MiR-206 MiR 499a Vorverstärkung aufgrund ihrer niedrigen Ausdruck erforderlich. MiR-208a und MiR 208b waren auch nach Vorverstärkung nicht nachweisbar. Probe Verarbeitungseffizienz wurde durch die Cq-Werte von Spike Cel-MiR-238 bewertet. Bei diesem Assay-Verfahren technische Variation war schätzungsweise weniger als 3-fold und die untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) war 102 Kopie/µL, für den Großteil der untersuchten MiRNAs.

Dieses Protokoll ermöglicht eine bessere Schätzung der Menge an Plasma MiRNAs und Qualitätsbeurteilung von entsprechenden Daten aus verschiedenen Studien ermöglicht. Wenn man bedenkt, dass die geringe Anzahl von MiRNAs in Körperflüssigkeiten, Vorverstärkung nützlich zur Erkennung von schlecht zu verbessern ist, äußerte MiRNAs.

Einleitung

Eine wachsende Zahl von Studien wurden Mikro-RNAs (MiRNAs) als Biomarker für die Diagnose und Prognose von Krebserkrankungen zu erforschen oder Überwachung und Erkennung von anderen Krankheiten in präklinischen und klinischen Studien1,2,3 . Quantitative Real-Time reverse Transkription PCR (RT-qPCR) ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden verwendet, um einzelne Ziel MiRNAs, bewerten, weil diese Technik empfindlicher ist als Microarray4 und RNA Sequenzierung Plattformen5basierend. Im Allgemeinen ist MiRNA Ausdruck im Vergleich zu einer Referenzprobe mit der ΔCq Methode6gemessen. Diese Methode eignet sich für die Untersuchung von physiologischer Veränderungen im gen Ausdruck Zielwerte. Allerdings hat relative Quantifizierung der zirkulierenden MiRNAs Dienstprogramm wegen ihrer geringen Mengen begrenzt. Darüber hinaus macht technische Variation es schwierig, die Ergebnisse aus verschiedenen Studien zu vergleichen, da verschiedene Labors der RT-qPCR experimentelle Protokolle unterschiedlich anpassen, was führt zum inkonsistenten oder sogar widersprüchlich ergibt sich aus verschiedene Studien7.

Angesichts der oben genannten Bedenken möglicherweise absolute Quantifizierung besser geeignet für die Beurteilung von kleinen Mengen von MiRNAs in Körperflüssigkeiten. Die absolute Quantifizierungsmethode verwendet eine Standardkurve generiert aus bekannten Konzentrationen von synthetische RNA-Oligonukleotide, die nacheinander auf die entsprechenden Ziel-MiRNA-8identisch sind. Gesundheit und Environmental Sciences Institute (HESI) Fachausschuss Genomics kürzlich durchgeführten umfassendere Studien um absolute Messergebnisse von Plasma MiRNAs Test standortübergreifend zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigten, dass vergleichbare Ergebnisse mit einem Standardprotokoll für die absolute Quantifizierung von MiRNAs über mehrere Test Seiten9erbracht werden. Die RT-qPCR-Assay-Methode in der vorliegenden Studie beschriebenen ist fast identisch mit der HESI Standardprotokoll, inklusive Multiplex Analyse mehrerer MiRNA Ziele und Vorverstärkung, die Erkennung von geringe Expression MiRNAs unterstützen.

In dieser Studie ein bestimmtes Volumen (200 µL) von EDTA-Plasma vorbereitet aus dem Blut gesammelt von der femoral Ader des bewussten Cynomolgus Affen (n = 50) verwendeten10war. Das folgende Protokoll beschreibt das Verfahren für die Herstellung von Plasma-Proben, Gewinnung von MiRNA und RT-qPCR, einschließlich Vorverstärkung. Noch wichtiger ist, wurde weitere technische Informationen über das Protokoll aufgenommen, so dass die Menge der Ziel-MiRNAs in den Proben in Kombination mit einem gut ausgebildeten Prozess überprüft werden kann. Zunächst wurde die Standardkurve jede MiRNA für seine individuelle Erfassungsbereich, vor seiner Quantifizierung in biologischen Proben überprüft. Zweitens war die Qualität der gegenwärtigen Methode mittels Cq-Werte für eine externe Steuerung (Cel-MiR-238) umfassend bewertet. Daher ergibt sich diese Plattform informativere und zuverlässige Daten für den Vergleich der Ergebnisse aus verschiedenen Studien oder Laboratorien.

Die Profile der 8 MiRNAs wurden in diesem Bericht als repräsentative Ergebnisse aus der Assay-Methode, die hier beschrieben. Diese MiRNAs sind vorgeschlagen worden, wie mögliche Sicherheit Biomarker Gewebeschädigung der Leber (MiR-122 und MiR-192), Herz (MiR-1, MiR-208a, MiR 208b und MiR-499a) und Skelettmuskulatur (MiR-133a und MiR-206) in Nagetieren und Menschen3zugeordnet, 11,12,13.

Protokoll

Alle Experimente stimmten mit den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss von Daiichi Sankyo Co., Ltd.

1. die Probenvorbereitung

  1. Sammeln Sie Blut (mindestens 0,5 mL) der femoralen Ader Cynomolgus Affen in 2K-haltigen EDTA-Röhrchen.
    Hinweis: Die Citrat und Heparin sind nicht akzeptabel, weil diese Antikoagulanzien anschließende PCR14,15hemmen.
  2. Legen Sie die gesammelten Proben sofort auf Eis und Verfahren zur Isolierung von Plasma innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme.
  3. Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 x g bei 4 ° C für 5 min.
  4. Übertragen des Überstands in ein 2 mL Reaktionscup, gefolgt von Zentrifugation bei 16.000 x g bei 4 ° C für 5 min Zellenrückstand und restliche Thrombozyten zu entfernen.
    Hinweis: Quantifizierung der MiRNAs kann Thrombozyten Kontamination16deutlich betroffen.
  5. 200 µL-Aliquots des Überstands in frischen 2 mL Mikroröhrchen und bei-80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
    Hinweis: Ein bestimmtes Volumen von jeder Probe wird für die RNA-Extraktion verwendet; Daher muss das Volumen der aliquoten genau zu sein.

2. RNA-Extraktion

  1. Auftauen von eingefrorenen Proben auf Eis (aus Schritt 1.5).
    1. Halten Sie Probe kalt auf dem Eis während der RNA-Extraktion. Chill-Lyse-Reagenz und chloroform auf Eis vor dem Gebrauch.
  2. 5 Bände (1000 µL) Lyse-Reagenz, mit monophasischen Lösung von Phenol und Guanidin erfolgt, um die Probe (200 µL) und mischen Sie kräftig durch Vortexen für 1 min.
  3. Fügen Sie 5 µL 5 nM synthetischen Caenorhabditis Elegans MiRNA (Syn-Cel-MiR-238-3 p).
  4. Fügen Sie 1 Volumen (200 µL) von Chloroform und mischen Sie kräftig durch Vortexen für 1 min.
  5. Halten Sie für 2 bis 3 min auf Eis, und dann Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g bei 4 ° C für 15 min.
  6. Übertragen Sie die wässrige Phase sorgfältig auf eine neue Reaktionscup.
    Hinweis: Übertragen Sie die organische Phase (rot) oder Interphase (weiß) nicht. Das Volumen der wässrigen Phase gesammelt sein um zu vermeiden, Umgang mit Inkonsistenz, die erhöhte technische Variation führt einheitlich. Die übliche Höhe der wässrigen Phase, die in diesem Protokoll übertragen wurde 650 µL.
  7. Fügen Sie 1,5 Mengen (975 µL) Ethanol, und mischen Sie gut durch Pipettieren rauf und runter.
  8. Übertragen Sie die Probe in einer entsprechenden Spalte und Adapter, gefolgt von Vakuumtrocknung für 3 min mit Vakuum Mannigfaltigkeiten. Wenn das Probenvolumen mehr als 700 µL ist, wiederholen Sie diesen Schritt, um die restliche Lösung verarbeiten.
    Hinweis: Spaltenbasierten RNA Isolierung ist kompatibel mit Vakuum und Zentrifugation Methode.
  9. Die Spalte, gefolgt von Vakuumtrocknung für 1 min fügen Sie 200 µL Ethanol hinzu.
  10. Die Spalte, gefolgt von Vakuumtrocknung für 2 min fügen Sie 800 µL RWT Puffer hinzu.
  11. Die Spalte, gefolgt von Vakuumtrocknung für 2 min fügen Sie 800 µL RPE Puffer hinzu.
  12. Wiederholen Sie Schritt 2.11.
  13. Die Spalte, gefolgt von Vakuumtrocknung für 1 min fügen Sie 300 µL Ethanol hinzu.
  14. Setzen Sie die Säule auf eine neue Reaktionscup, und bei 12.000 x g bei Raumtemperatur (15-25 ° C) für 1 min zentrifugieren.
  15. Übertragen Sie die Spalte an eine neue Reaktionscup zu, und fügen Sie 50 µL Nuklease-freies Wasser.
  16. Bei Raumtemperatur (15-25 ° C) für 3 min und Zentrifuge bei 8.000 × g bei Raumtemperatur (15-25 ° C) für 1 min stehen.
  17. Wenden Sie das Eluat erneut in die Spalte.
  18. Wiederholen Sie Schritt 2.16 und speichern Sie Eluat bei-80 ° C bis zu seiner Verwendung zu.

(3) cDNA Synthese

  1. Auftauen von eingefrorenen Proben (aus Schritt 2.18).
  2. Bereiten Sie bekannten Konzentration der synthetische RNA-Oligonukleotide, die MiRNAs Ziel entsprechen.
    1. Verwenden Sie synthetische RNA-Oligonukleotid zur Erzeugung einer Standardkurve in qPCR. Stammlösung 1 x 108 Kopie/µL Konzentration ist für Speicherzwecke vorbereitet.
    2. Verdünnen Sie die Stammlösung 10-fach um 1 x 107 Kopie/µL (nicht vorverstärkt Proben) oder 1 x 105 Kopie/µL (vorverstärkt Proben) funktionierende Lösung als die höchste Konzentration für die Erstellung der Standardkurve zu erhalten. Im Allgemeinen ist eine empfohlene Intervall für die Konzentrationen der Standardkurve 1 x 107 bis 1 x 102 Kopie/µL (nicht vorverstärkt Proben) oder 1 x 105 bis 1 x 100 Kopie/µL (vorverstärkt Proben).
  3. Bereiten Sie multiplex RT Primer Pool durch Mischen gleiche Volumina von 20 X RT Primer für Ziel MiRNAs.
    Hinweis: Wie in Abbildung 2gezeigt, ein Schwimmbad mit bis zu 4 Ziel MiRNAs erfolgen durch das Mischen von 20 X RT Primer aller MiRNAs im Pool. Als eines der Ziel-MiRNAs in jedem Röhrchen beizufügen Cel-MiR-238 (Fremdüberwachung). Fügen Sie bei weniger als 4 Ziel MiRNAs gleiche Volumina von 1/10-TE-Puffer statt 20 X RT Primer hinzu.
  4. RT Reaktion Mischung vorbereiten: 3 µL RT-Grundierung (aus Schritt 3.3), Schwimmbad, 0,15 µL 100 mM dNTPs mit dTTP, 1 µL Reverse Transkriptase (50 U/µL), 1,5 µL 10 x RT Puffer, 0,19 µL RNase-Inhibitor (20 U/µL) und 4.16 µL Nuklease-freies Wasser.
  5. Mischung 10 µL RT Reaktion durch Pipettieren mit 5 µL RNA-Probe (aus Schritt 3.1) oder Oligonukleotide (aus Schritt 3.2) mischen und inkubieren Sie für 5 min auf Eis.
  6. Reversen Transkription auf einem Thermocycler Apparat laufen: 16 ° C für 30 min, 42 ° C für 30 min, gefolgt von einer endgültigen Reverse Transkriptase Inaktivierung Schritt bei 85 ° C für 5 min. Store reverse Transkription Proben bei-80 ° C bis zur Verwendung.

(4) Vorverstärker (Optional)

Hinweis: Die MiRNAs, die Cq-Werte über 35 oder mehr im nachfolgenden qPCR zeigen sind vorverstärkt.

  1. Auftauen von eingefrorenen Proben (aus Schritt 3,6).
  2. 10-divisibel serielle Verdünnungen von RT Produkt aus synthetischen RNA-Oligonukleotide zu machen; 1 x 105 bis 1 x 100 Kopie/µL für die Erstellung der Standardkurve.
  3. Bereiten Sie Multiplex-Assays Grundierung Pool durch Mischen gleichen Volumina (5 µL) 20 x Assay Primer für Ziel MiRNAs mit die Endkonzentration jedes Assay-Grundierung, 200-fach verdünnt von TE-Puffer in einem Endvolumen von 1.000 µL.
    Hinweis: Die Assay-Primer, deren Ziel MiRNAs in nachfolgenden qPCR ohne Vorverstärkung und die Cel-MiR-238 (Fremdüberwachung) nachweisbar sein kann, nicht Grundierung Pool gehören.
  4. Vorverstärkung Reaktion Mischung vorbereiten: 12,5 µL 2 x Ready-to-Use sorgt Reagenz, 3,75 µL Assays Grundierung Pool (vom Schritt 4.3) und 6,25 µL Nuklease-freies Wasser.
  5. Mix-22,5 µL Vorverstärkung Reaktion durch Pipettieren mit 2,5 µL reverse Transkription Musters (aus Schritt 4.1) oder Oligonukleotide (aus Schritt 4.2) mischen und inkubieren Sie für 5 min auf Eis.
  6. Reaktion auf einem Thermocycler Apparat laufen: 95 ° C für 10 min; gefolgt von 12 Zyklen von 95 ° C für 15 s und 60 ° C für 4 min. vorverstärkt Proben bei-80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.

5. Quantitative Real-Time PCR (qPCR)

  1. Auftauen von eingefrorenen Proben (von 3,6 oder Schritt 4.6).
  2. Verdünnen Sie die Proben 5-Fach mit sterilem Wasser.
  3. Bereiten Sie 10-divisibel serielle Verdünnungen von der RT Produkt aus synthetischen RNA-Oligonukleotide vor; 1 x 107 bis 1 x 102 Kopie/µL (nicht vorverstärkt Proben) oder 1 x 105 bis 1 x 100 Kopie/µL (vorverstärkt Proben) zur Erzeugung von Standardkurven.
  4. QPCR Reaktion Mischung vorbereiten: 10 µL 2 x Ready-to-Use Verstärkung Reagenz, 1 µL 20 x Assay Reagenz, mit vor-/Rücklauf PCR Primer und Sonde entsprechend Ziel MiRNA und 7 µL Nuklease-freies Wasser.
  5. Übertragen Sie 18 µL von qPCR Reaktion Mischung auf die schnelle optische Reaktion der 96-Well-Platten, und fügen Sie 2 µL der verdünnten Proben (von 5.2 oder 5.3 Schritt) in die Vertiefungen.
    Hinweis: Proben und Standards für qPCR sind Duplikate gegründet.
  6. Die Dichtplatte mit Klebefolie und Zentrifugieren Sie kurz.
  7. Reaktion auf eine Echtzeit-Thermocycler laufen: 95 ° C für 20 s, gefolgt von 45 Zyklen von 95 ° C für 1 s bis 60 ° C für 20 s.

(6) Datenanalyse

  1. Berechnen Sie die rohen Kopienzahl jeder Probe mit Datenanalyse-Software, die mit entsprechenden Echtzeit-Thermocycler arbeitet.
    Hinweis: Schwelle Linie manuell auf "1.0" in alle Platten in der Studie soll die Reproduzierbarkeit im Vergleich zu ihren Cq Täler zu bestätigen. Abkürzungniveau befindet sich im Cq > 40 Zyklen.
  2. Berechnen Sie den Mittelwert der rohen Kopienzahl jeder Probe von Duplikaten.
  3. Berechnen Sie Korrekturfaktor, indem eine Kopienzahl der Cel-MiR-238 in jeder Probe durch den Durchschnitt der Kopienzahl des Cel-MiR-238 aus allen Proben in einem entsprechenden Rohr.
    Hinweis: Wie in Abbildung 2dargestellt, enthält jedes Rohr bis zu 4 Ziel MiRNAs einschließlich Cel-MiR-238 (Fremdüberwachung). Daher wird Korrekturfaktor für jedes Rohr mit entsprechenden Cel-MiR-238-Wert berechnet.
  4. Berechnen Sie die angepasste Kopie Anzahl dividiert die gemittelten roh Kopienzahl jeder Probe (ab Schritt 6.2) durch den Korrekturfaktor (aus Schritt 6.3) für jede Probe.
  5. Die absolute Kopienzahl durch Multiplikation der Anzahl der eingestellten raw Kopie jeder einzelnen Probe (ab Schritt 6.4) zu berechnen, indem die den Verdünnungsfaktor für jede Probe.
    Hinweis: Der Verdünnungsfaktor ist "5" in diesem Protokoll Schritt 5.2 abgeleitet ist.
  6. Berechnen Sie die Effizienz der PCR Verstärkung von der Neigung des Grundstücks die Cq-Werte für jede serielle Verdünnung gegen Log cDNA Konzentration.
    Hinweis: Formel für die Berechnung der Effizienz; E = (10(-1/Neigung) -1) x 100 %.
  7. Berechnen Sie die technische Variante mit den Cq-Werten von Cel-MiR-238 aus allen Proben mit Hilfe der Formel E = (2 X Verstärkung Wirksamkeit)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)).
    Hinweis: Schritte, 6.5 und 6.7 dienen zur Qualitätsbewertung des Verfahrens.

Ergebnisse

Workflow der MiRNA-Assay von RT-qPCR und Qualität Assessment
Abbildung 1 zeigt den Workflow der MiRNA-Assay aus Blutproben mit qPCR10. Die Qualität der Versuche kann durch einschließlich Cel-MiR-238 als eine externe Kontrolle überprüft werden. Dadurch wird erkennbar, dass technische Variationen in RNA-Extraktion und anschließende RT-qPCR verarbeitet. In dieser Studie wurde der Mittelwert ± SD der Cq-...

Diskussion

Unsere umfassende Bewertung zur Verfügung gestellt einer strengeren statistischen Analysis des Ausmaßes der Dynamikumfang, die eindeutig darauf hingewiesen, dass das Ausmaß der Unterschiede zwischen den einzelnen Proben sehr unterschiedlich die MiRNAs getestet wurde. Obwohl diese Variationen auf ihre Kleinmengen in Körperflüssigkeiten zurückzuführen sein können, sollte angemerkt werden, dass diese Daten nicht nur biologische Variationen, sondern auch technische Unterschiede widerspiegeln. Die meisten der technisc...

Offenlegungen

Der Autor hat keine Interessenskonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung erhielten keine spezifischen Einräumung von Fördereinrichtungen in den öffentlichen, kommerziellen oder Non-Profit-Sektor.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
BD Microtainer tube (K2EDTA)Becton, Dickinson and Company365974For blood collection
Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mLEppendorf0030124359
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  1.5 mLEppendorf0030120086
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  2.0 mLEppendorf0030120094
Synthetic oligonucleotideHokkaido System Science-Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade)
Tris-EDTA Buffer  (pH 8.0)Nippon Gene314-90021TE buffer
Buffer RPEQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
Buffer RWTQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
miRNeasy Mini KitQIAGEN217004
Nuclease-Free Water QIAGEN129114
QIAzol Lysis ReagentQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic QIAGEN219600ID:MSY0000293, 5 nmol
SC AdaptersTAIGEN Bioscience CorporationS0120For RNA extraction
VacEZor 36 Complete SystemTAIGEN Bioscience CorporationM3610For RNA extraction
7900HT Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific Inc.4351405Fast 96-Well Block
GeneAmp PCR System 9700Thermo Fisher Scientific Inc.9700
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction PlateThermo Fisher Scientific Inc.4346907
MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific Inc.4311971
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific Inc.4444557
TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000248
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002245
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002246
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002222
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000491
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000510
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000511
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002290
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 001352
TaqMan MicroRNA Reverse
Transcription Kit		Thermo Fisher Scientific Inc.4366597
TaqMan PreAmp Master Mix (2×)Thermo Fisher Scientific Inc.4391128
Chloroform Wako Pure Chemicals035-02616
Ethanol (99.5)Wako Pure Chemicals057-00456

Referenzen

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