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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Este relatório descreve um protocolo para medir os níveis absolutos de plasma miRNA, usando quantitativo em tempo real a transcrição reversa PCR com ou sem pré-amplificação. Este protocolo permite melhor entendimento da quantidade de plasma miRNAs e permite a avaliação qualitativa da correspondentes dados de diferentes estudos ou laboratórios.

Resumo

RT-qPCR é um dos métodos mais comuns para avaliar os miRNAs destino individual. Níveis de MiRNAs são geralmente medidos em relação a uma amostra de referência. Esta abordagem é apropriada para examinar as alterações fisiológicas em níveis de expressão de gene alvo. No entanto, quantificação absoluta usando melhor análise estatística é preferível para uma avaliação global dos níveis de expressão do gene. Quantificação absoluta é ainda não de uso comum. Este relatório descreve um protocolo para medir os níveis absolutos de plasma miRNA, usando RT-qPCR, com ou sem pré-amplificação.

Um volume fixo (200 µ l) de plasma-EDTA foi preparado a partir do sangue coletado da veia femoral de macacos cynomolgus consciente (n = 50). O RNA total foi extraído utilizando sistema comercialmente disponível. Plasma miRNAs foram quantificados por ensaios de RT-qPCR sonda-based, que contém a sonda e a primeira demão PCR de avanço/retrocesso miRNA-específica. Curvas padrão para quantificação absoluta foram geradas usando oligonucleotides de RNA sintéticos disponíveis comercialmente. Um sintético cel-miR-238 foi usado como um controle externo para avaliação de normalização e qualidade. Os miRNAs que mostrou a quantificação ciclo (Cq) valores acima de 35 foram pre-amplificados antes da etapa de qPCR.

Entre os 8 miRNAs examinados, 122-miR, miR-133a e miR-192 foram detectáveis sem pré-amplificação, Considerando que miR-1 e miR-206 miR-499a pré-amplificação por causa de seus níveis baixos de expressão. MiR-208a e miR-208b não foram detectáveis mesmo após pré-amplificação. Eficiência de processamento da amostra foi avaliada pelos valores da cel-miR-238 cravado de Cq. Neste método de ensaio, variação técnica foi estimada em menos de 3 vezes e o limite inferior de quantificação (LLOQ) foi 102 cópia / µ l, para a maioria dos miRNAs examinadas.

Este protocolo fornece uma melhor estimativa da quantidade de plasma miRNAs e permite a avaliação da qualidade de correspondentes dados de diferentes estudos. Considerar que o baixo número de miRNAs em fluidos corporais, pré-amplificação é útil para realçar a deteção de mal expressa miRNAs.

Introdução

Um número crescente de estudos foram explorar microRNAs (miRNAs) como biomarcadores para o diagnóstico e prognóstico de câncer, ou monitoramento e detecção de outras doenças em estudos clínicos e adequado1,2,3 . Quantitativo em tempo real transcrição reversa PCR (RT-qPCR) é um dos métodos mais comuns utilizados para avaliar os miRNAs destino individual, porque esta técnica é mais sensível do que microarray4 e sequenciamento de RNA baseiam plataformas5. Em geral, expressão de miRNA é medido em relação a uma amostra de referência usando o método de ΔCq6. Esta abordagem é apropriada para investigar mudanças fisiológicas nos níveis de expressão de gene alvo. No entanto, quantificação relativa de miRNAs em circulação tem limitado utilitário por causa de suas pequenas quantidades. Além disso, variação técnica torna difícil comparar os resultados de estudos diferentes, porque diferentes laboratórios personalizar os protocolos experimentais RT-qPCR diferente, que leva a inconsistente ou contraditório mesmo resulta da diferentes estudos7.

Tendo em conta as preocupações acima mencionadas, a quantificação absoluta pode ser mais adequada para a avaliação das quantidades pequenas de miRNAs em fluidos corporais. O método de quantificação absoluta usa uma curva padrão gerada a partir de concentrações conhecidas de oligonucleotides RNA sintéticos idênticos em sequência ao destino correspondente miRNA8. A saúde e a Comissão técnica do Instituto de ciências ambientais (HESI) na genômica recentemente conduziram estudos abrangentes para comparar os resultados de medições absolutas de plasma miRNAs, através de vários sites de teste. Os resultados mostraram que usando um protocolo padrão para a quantificação absoluta de miRNAs produziu resultados comparáveis entre os múltiplos de sites teste9. O método de ensaio de RT-qPCR descrito no presente estudo é quase idêntico ao protocolo padrão do HESI, que inclui análise multiplexada de múltiplos alvos de miRNA e pré-amplificação para auxiliar a detecção de baixa expressão miRNAs.

Neste estudo, um volume fixo (200 µ l) de plasma-EDTA preparada a partir do sangue coletado da veia femoral de macacos cynomolgus consciente (n = 50) foi utilizado10. O protocolo seguinte descreve o procedimento para a preparação de amostras de plasma, extração de miRNA e RT-qPCR, incluindo pré-amplificação. Mais importante ainda, informações técnicas adicionais sobre o protocolo foi incluídas, para que a quantidade de alvo miRNAs nas amostras pode ser validada em combinação com um processo bem qualificado. Primeiro, a curva padrão de cada miRNA foi validada para a sua gama de deteção individuais, antes da sua quantificação, em amostras biológicas. Em segundo lugar, a qualidade da metodologia atual foi exaustivamente avaliada através de valores de Cq de um controle externo (cel-miR-238). Portanto, esta plataforma produz dados mais informativos e confiável para comparar resultados de diferentes estudos ou laboratórios.

Os perfis dos 8 miRNAs foram incluídos neste relatório como resultados representativos do método de ensaio descrito aqui. Estes miRNAs têm sido propostos como potenciais biomarcadores de segurança associados a lesões de tecidos para o fígado (miR-122 e miR-192), coração (miR-1, miR-208a, miR-208b e miR-499a) e o músculo esquelético (miR-133a e miR-206) em roedores e humanos3, 11,12,13.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da Daiichi Sankyo co., Ltd.

1. preparação da amostra

  1. Colete sangue (pelo menos de 0,5 mL) da veia femoral de macacos cynomolgus em tubos de 2K-contendo EDTA.
    Nota: Citrato e heparina não são aceitáveis porque estes anticoagulantes inibem subsequente PCR14,15.
  2. Coloca as amostras coletadas imediatamente sobre o gelo e o processo de isolamento do plasma dentro de 2 horas de coleção.
  3. Centrifugar as amostras a 10.000 x g a 4 ° C por 5 min.
  4. Transferi o sobrenadante para um microtubo de 2 mL, seguido de centrifugação a 16.000 x g a 4 ° C por 5 min remover os restos de células e plaquetas residuais.
    Nota: Quantificação dos miRNAs pode ser afetada significativamente por plaquetas contaminação16.
  5. Coloque 200 alíquotas µ l do sobrenadante no frescos 2 mL-microtubos e armazene a-80 ° C até o uso.
    Nota: Um volume fixo de cada amostra é utilizado para extração de RNA; Portanto, o volume da alíquota deve ser exato.

2. extração do RNA

  1. Descongele as amostras congeladas no gelo (da etapa 1.5).
    1. Não deixar amostra no gelo durante a extração do RNA. Refrigere o reagente de Lise e clorofórmio na prévia de gelo para usar.
  2. Adicione 5 volumes (1000 µ l) de reagente de Lise, contendo solução monofásica de isotiocianato de fenol e de guanidina, para a amostra (200 µ l) e misture vigorosamente num Vortex durante 1 min.
  3. Adicionar 5 µ l de 5 nM sintético miRNA Caenorhabditis elegans (Syn-cel-miR-238-3 p).
  4. Adicionar 1 volume (200 µ l) de clorofórmio e misture vigorosamente num Vortex durante 1 min.
  5. Fique no gelo durante 2 a 3 min e centrifugar as amostras a 12.000 x g a 4 ° C por 15 min.
  6. Transferi a fase aquosa com cuidado para um microtubo de novo.
    Nota: Não transfira a fase orgânica (vermelho) ou interfase (branco). O volume da fase aquosa recolhida deve ser uniforme para evitar a inconsistência, o que resulta em maior variação de técnica de manipulação. A quantidade habitual de fase aquosa transferido neste protocolo foi 650 µ l.
  7. Adicione 1,5 volumes (975 µ l) de álcool etílico e misture bem pipetando para cima e para baixo.
  8. Transferi a amostra para uma coluna correspondente e adaptador, seguido de secagem a vácuo para 3 min usando Manifold. Se o volume da amostra é mais de 700 µ l, repita este passo para processar o restante da solução.
    Nota: Isolamento de RNA baseado na coluna é compatível com o método de vácuo e centrifugação.
  9. Adicione 200 µ l de etanol para a coluna, seguida de secagem a vácuo por 1 min.
  10. Adicione 800 µ l de tampão de RWT à coluna, seguida de secagem a vácuo por 2 min.
  11. Adicione 800 µ l de tampão de RPE para a coluna, seguida de secagem a vácuo por 2 min.
  12. Repita a etapa 2.11.
  13. Adicione 300 µ l de etanol para a coluna, seguida de secagem a vácuo por 1 min.
  14. Coloque a coluna para um microtubo de novo e centrifugar a 12.000 x g, à temperatura ambiente (15 a 25 ° C) por 1 min.
  15. Transferir a coluna para um microtubo de novo e adicionar 50 µ l de água livre de nuclease.
  16. Ficar à temperatura ambiente (15 a 25 ° C) por 3 min e centrifugar 8.000 × g, à temperatura ambiente (15 a 25 ° C) por 1 min.
  17. Re-aplica o eluato à coluna.
  18. Repita a etapa 2.16 e armazenar eluído a-80 ° C até o uso.

3. síntese de cDNA

  1. Descongele as amostras congeladas (da etapa 2.18).
  2. Prepare uma concentração conhecida de oligonucleotides sintéticos do RNA que correspondem ao alvo miRNAs.
    1. Use sintético do oligonucleotide do RNA para a geração de uma curva padrão em qPCR. Solução de concentração de cópia / µ l 1 x 108 está preparada para fins de armazenamento.
    2. Dilua a solução-mãe 10-fold para obter 1 x 107 cópia / µ l (não pre-amplificadas amostras) ou solução de trabalho de cópia / µ l (amostras pre-amplificadas) 1 x 105 como a concentração mais elevada para a construção da curva padrão. Em geral, um intervalo sugerido para as concentrações da curva padrão é 1 x 107 a 1 x 102 cópia / µ l (não pre-amplificadas amostras) ou 1 x 105 a 1 x 100 cópia / µ l (pre-amplificadas amostras).
  3. Prepare-se piscina de cartilha multiplex RT misturando volumes iguais de 20 x RT as primeiras demão para miRNAs alvo.
    Nota: Conforme mostrado na Figura 2, uma piscina que contém até 4 miRNAs alvo pode ser feita misturando os primers de RT 20 x de cada um dos miRNAs na piscina. Cel-miR-238 (controle externo) deve ser incluído como um dos alvo miRNAs em cada tubo. Em caso de menos de 4 alvo miRNAs, adicione volumes iguais de buffer de TE 1/10 em vez de cartilha de RT x 20.
  4. Preparar a mistura de reação de RT: 3 µ l de primer RT pool (da etapa 3.3), 0,15 µ l de dNTPs 100mm com dTTP, 1 µ l de transcriptase reversa (50 U / µ l), 1,5 µ l 10 x buffer de RT, 0,19 µ l de inibidor de RNase (20 U / µ l) e 4,16 µ l de nuclease-livre de água.
  5. Mix 10 µ l de reação de RT misturar com 5 µ l de amostra de RNA (da etapa 3.1) ou oligonucleotídeos (da etapa 3.2) pipetando e incubar no gelo por 5 min.
  6. Executar a transcrição reversa em um aparelho termociclador: 16 ° C por 30 min, 42 ° C por 30 min, seguido por uma etapa de inactivação final transcriptase reversa a 85 ° C por 5 min. amostras transcritas reversos de loja a-80 ° C até o uso.

4. preamplificação (opcional)

Nota: Os miRNAs que mostram valores de Cq acima de 35 ou mais em qPCR subsequente são pre-amplificados.

  1. Descongele as amostras congeladas (da etapa 3.6).
  2. Fazer 10 vezes diluições em série do produto RT de oligonucleotides sintéticos de RNA; 1 x 105 a 1 x 100 cópia / µ l para gerar a curva padrão.
  3. Preparar piscina de cartilha de ensaio multiplex misturando volumes iguais (5 µ l) de 20 x primeiras demão de ensaio para alvo miRNAs com a concentração final de cada primer de ensaio sendo diluído 200-fold pelo buffer TE em um volume final de 1.000 µ l.
    Nota: Os primers de ensaio cujos destino os miRNAs podem ser detectáveis em qPCR subsequente sem pré-amplificação e os de cel-miR-238 (controle externo) não estão incluídos na piscina da primeira demão.
  4. Preparar a mistura de reação de Pre-amplificação: 12,5 µ l de 2 x 6,25 µ l de água livre de nuclease, 3,75 µ l de piscina de cartilha do ensaio (da etapa 4.3) e reagente de pré-amplificação ready-to-use.
  5. Mix 22,5 µ l da reação de pré-amplificação misturar com 2,5 µ l de amostra transcrita reversa (da etapa 4.1) ou oligonucleotídeos (da etapa 4.2) pipetando e incubar no gelo por 5 min.
  6. Executar a reação em um aparelho termociclador: 95 ° C por 10 min; seguido por 12 ciclos de 95 ° C por 15 s e 60 ° C durante 4 min. armazenam amostras pre-amplificadas a-80 ° C até o uso.

5. quantitativo PCR em tempo real (qPCR)

  1. Descongele as amostras congeladas (do passo 3.6 ou 4.6).
  2. Diluir as amostras 5-fold com água estéril.
  3. Prepare-se 10 vezes diluições em série do produto RT derivado sintéticos oligonucleotides de RNA; 1 x 107 a 1 x 102 cópia / µ l (não pre-amplificadas amostras) ou 1 x 105 a 1 x 100 cópia / µ l (pre-amplificadas amostras) para a geração de curvas padrão.
  4. Preparar a mistura de reação de qPCR: 10 µ l de 2 x reagente de amplificação de ready-to-use, 1 µ l de reagente de ensaio, contendo a primeira demão do PCR e sonda correspondente ao alvo miRNA, avanço/retrocesso de 20x e 7 µ l de água livre de nuclease.
  5. Transferência de 18 µ l da mistura de reação de qPCR para as placas de reação rápido óptico de 96 poços e adicionar 2 µ l das amostras diluídas (de passo 5.2 ou 5.3) nos poços.
    Nota: Amostras e padrões para qPCR são configurados em duplicatas.
  6. A placa com a película adesiva do selo e centrifugar brevemente.
  7. Executar a reação em um termociclador em tempo real: 95 ° C por 20 s, seguido de 45 ciclos de 95 ° C por 1 s e 60 ° C durante 20 s.

6. análise de dados

  1. Calcule o número de cópia bruta de cada amostra utilizando o software de análise de dados que funciona com o correspondente termociclador em tempo real.
    Nota: A linha de limite é definida manualmente como "1.0" em todas as placas no estudo, para confirmar a reprodutibilidade em comparação com os seus vales de Cq. Nível de interrupção é definido no Cq > 40 ciclos.
  2. Calcule a média do número de cópia bruta de cada amostra de duplicatas.
  3. Calcule o factor de correcção, dividindo um número de cópia de cel-miR-238 em cada amostra pela média do número de cópia de cel-miR-238 de todas as amostras em um tubo correspondente.
    Nota: Conforme mostrado na Figura 2, cada tubo contém até 4 alvo miRNAs incluindo cel-miR-238 (controle externo). Portanto, o fator de correção é calculado para cada tubo utilizando o valor correspondente do cel-miR-238.
  4. Calcule o número de cópia ajustado, dividindo o número de cópia bruta média de cada amostra (do passo 6.2) pelo fator de correção (da etapa 6.3) para cada amostra.
  5. Calcular o número de cópia absoluta multiplicando o número de cópia bruta ajustada de cada amostra (do passo 6.4) pelo factor de diluição para cada amostra.
    Nota: O fator de diluição é "5" no presente protocolo, que é derivado de passo 5.2.
  6. Calcule as eficiências de amplificação por PCR de encosta da trama dos valores de Cq para cada diluição serial contra a concentração de cDNA de log.
    Nota: Fórmula para calcular a eficiência; E = (10(-1/inclinação) -1) x 100%.
  7. Calcular a variação de técnica usando os valores de Cq da cel-miR-238 de todas as amostras, usando a fórmula E = (eficácia de amplificação de 2 x)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)).
    Nota: As etapas 6.5 e 6.7 são utilizadas para avaliação da qualidade do processo.

Resultados

Fluxo de trabalho de miRNA ensaio por RT-qPCR e qualidade assessment
A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho de miRNA ensaio de amostras de sangue usando qPCR10. A qualidade das experiências pode ser verificada por incluindo cel-miR-238 como um controle externo. Isto irá revelar variações técnicas de extração do RNA e RT-qPCR subsequente processos. Neste estudo, a média ± DP do Cq valores calculados ...

Discussão

Nossa avaliação abrangente fornecido uma análise estatística mais rigorosa da extensão da faixa dinâmica, que indicava claramente que a magnitude da variação entre amostras individuais foi extremamente diferente entre os miRNAs testados. Embora estas variações podem ser atribuíveis à suas pequenas quantidades em fluidos corporais, note-se que esses dados refletem não apenas variações biológicas, mas também variações técnicas. A maioria da variação técnica pode ser avaliada por meio de valores de Cq...

Divulgações

O autor não tem nenhum conflito de interesses para divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa não recebeu qualquer subsídio específico de agências de financiamento no setor público, comercial ou não-lucrativa.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
BD Microtainer tube (K2EDTA)Becton, Dickinson and Company365974For blood collection
Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mLEppendorf0030124359
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  1.5 mLEppendorf0030120086
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  2.0 mLEppendorf0030120094
Synthetic oligonucleotideHokkaido System Science-Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade)
Tris-EDTA Buffer  (pH 8.0)Nippon Gene314-90021TE buffer
Buffer RPEQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
Buffer RWTQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
miRNeasy Mini KitQIAGEN217004
Nuclease-Free Water QIAGEN129114
QIAzol Lysis ReagentQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic QIAGEN219600ID:MSY0000293, 5 nmol
SC AdaptersTAIGEN Bioscience CorporationS0120For RNA extraction
VacEZor 36 Complete SystemTAIGEN Bioscience CorporationM3610For RNA extraction
7900HT Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific Inc.4351405Fast 96-Well Block
GeneAmp PCR System 9700Thermo Fisher Scientific Inc.9700
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction PlateThermo Fisher Scientific Inc.4346907
MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific Inc.4311971
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific Inc.4444557
TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000248
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002245
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002246
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002222
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000491
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000510
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000511
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002290
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 001352
TaqMan MicroRNA Reverse
Transcription Kit		Thermo Fisher Scientific Inc.4366597
TaqMan PreAmp Master Mix (2×)Thermo Fisher Scientific Inc.4391128
Chloroform Wako Pure Chemicals035-02616
Ethanol (99.5)Wako Pure Chemicals057-00456

Referências

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