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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce rapport décrit un protocole de mesure des niveaux absolus de miRNA plasma, à l’aide de la transcription inverse en temps réel quantitative PCR avec ou sans pré amplification. Ce protocole permet de mieux comprendre la quantité de plasma miARN et permet une évaluation qualitative des données correspondantes de différentes études ou laboratoires.

Résumé

RT-qPCR est l’une des méthodes plus courantes pour évaluer des miARN cible individuelle. Les niveaux de miARN sont généralement mesurés par rapport à un échantillon de référence. Cette approche est appropriée pour l’examen des changements physiologiques dans le taux d’expression de gènes cibles. Cependant, quantification absolue en utilisant mieux l’analyse statistique est préférable pour une évaluation complète des niveaux d’expression de gène. Quantification absolue est toujours pas d’usage courant. Ce rapport décrit un protocole de mesure des niveaux absolus de plasma miRNA, utilisant la RT-qPCR avec ou sans pré amplification.

Un volume fixe (200 µL) de plasma EDTA a été préparé à partir le sang prélevé à la veine fémorale commune des singes cynomolgus consciente (n = 50). L’ARN total a été extrait en utilisant le système disponible dans le commerce. Plasma miARN ont été quantifiés par sonde RT-qPCR analyses qui contient la sonde et amorces PCR miRNA spécifique marche avant/marche arrière. Des courbes standard pour la quantification absolue ont été générés utilisant des oligonucléotides de RNA synthétiques disponibles dans le commerce. Un cel-miR-238 synthétique a été utilisé comme un contrôle externe pour la normalisation et l’évaluation. Les miARN qui présentaient de quantification des valeurs de cycle (Cq) au-dessus de 35 ont été pré amplifié avant l’étape de qPCR.

Parmi les 8 miARN examinés, miR-122, miR-133 a et miR-192 étaient détectables sans pré-amplification, tandis que miR-1 et miR-206 miR-499 a requis pré-amplification à cause de leur taux d’expression faible. MiR-208 a et 208 miR-b n’étaient pas détectables même après préamplification. Efficacité de traitement d’échantillon a été évaluée par les valeurs de Cq de la cel-miR-238 enrichis. Dans cette méthode de dosage, variation de la technique a été estimée à moins de 3 fois et la limite de quantification (PPQM) était 102 copie/µL, pour la plupart des miARN examinés.

Ce protocole prévoit une meilleure estimation de la quantité de plasma miARN et permet l’évaluation de la qualité des données correspondantes de différentes études. Compte tenu que du faible nombre des miARN dans les fluides corporels, préamplification est utile pour améliorer la détection du mal exprimé miARN.

Introduction

Un nombre croissant d’études ont été découverte de microARN (miARN) comme biomarqueurs pour le diagnostic et le pronostic des cancers, ou surveiller et détecter d’autres maladies dans les études cliniques et non cliniques1,2,3 . Quantitative en temps réel de transcription inverse PCR (RT-qPCR) est l’une des méthodes plus courantes utilisées pour évaluer les miARN cible individuelle, parce que cette technique est plus sensible que « microarray »4 et séquençage de RNA basant plates-formes5. En général, l’expression miRNA est mesurée par rapport à un échantillon de référence à l’aide de la méthode de ΔCq6. Cette approche est appropriée pour enquêter sur les changements physiologiques chez les taux d’expression de gènes cibles. Cependant, quantification relative des miARN en circulation a une utilité limitée en raison de leurs faibles quantités. En outre, variation de la technique rend difficile de comparer les résultats de différentes études, parce que différents laboratoires personnaliser les protocoles expérimentaux de la RT-qPCR différemment, ce qui conduit à incompatible ou contradictoire même résulte de différentes études7.

Compte tenu des préoccupations mentionnées ci-dessus, la quantification absolue pourrait être plus appropriée pour l’évaluation des petites quantités des miARN dans les fluides corporels. La méthode de quantification absolue utilise une courbe standard générée à partir des concentrations connues d’oligonucléotides synthétiques de RNA qui sont identiques dans l’ordre à la cible correspondante miRNA8. La santé et la Environmental Sciences Institute (HESI) Comité technique sur la génomique a récemment mené des études approfondies afin de comparer les résultats des mesures absolues de plasma miARN, sur plusieurs sites de test. Les résultats ont montré qu’en utilisant un protocole standard pour la quantification absolue des miARN ont donné des résultats comparables à travers les multiples test sites9. La méthode de dosage de RT-qPCR décrite dans la présente étude est presque identique au protocole standard de l’HESI, qui inclut une analyse multiplexée de multiples cibles miRNA et préamplification pour faciliter la détection des miARN faible expression.

Dans cette étude, un volume fixe (200 µL) de plasma EDTA-préparé à partir du sang prélevé de la veine fémorale commune des singes cynomolgus consciente (n = 50) a été utilisé10. Le protocole suivant décrit la procédure pour la préparation des échantillons de plasma, extraction de miRNA et RT-qPCR, y compris de pré-amplification. Plus important encore, des informations techniques supplémentaires sur le protocole a été incluses, afin que la quantité des miARN cible dans les échantillons peut être validée en combinaison avec un processus hautement qualifié. Tout d’abord, la courbe d’étalonnage de chaque miRNA a été validée pour sa gamme de détection individuels, avant sa quantification dans des échantillons biologiques. En second lieu, la qualité de la méthodologie actuelle a été complètement évaluée au moyen d’un contrôle externe (cel-miR-238), les valeurs de Cq. Par conséquent, cette plate-forme de rendements plus informatives et fiables des données permettant de comparer les résultats des différentes études ou laboratoires.

Les profils de 8 miARN ont été incluses dans le présent rapport comme résultats représentatifs de la méthode d’essai décrite ici. Ces miARN ont été proposés comme biomarqueurs potentiels de sécurité associées aux lésions au foie (miR-122 et miR-192), coeur (miR-1, miR-208, miR-208 et miR-499 a) et le muscle squelettique (miR-133 a et miR-206) chez les rongeurs et les humains3, 11,12,13.

Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité de Daiichi Sankyo Co., Ltd.

1. préparation de l’échantillon

  1. Prélever le sang (au moins 0,5 mL) de la veine fémorale commune des macaques de Buffon dans les tubes EDTA contenant 2K.
    NOTE : Citrate et l’héparine ne sont pas acceptables car ces anticoagulants inhibent les PCR14,15.
  2. Placer les échantillons prélevés immédiatement sur la glace et processus pour l’isolement de plasma dans les 2 heures suivant le prélèvement.
  3. Centrifuger les échantillons à 10 000 x g à 4 ° C pendant 5 min.
  4. Transvaser le surnageant dans un microtube 2 mL, suivi par centrifugation à 16 000 x g à 4 ° C pendant 5 min éliminer les débris cellulaires et plaquettes résiduelles.
    NOTE : Quantification des miARN peut être affectée considérablement par plaquettes contamination16.
  5. Placer 200 µL d’extraits du surnageant dans frais 2 mL-microtubes et conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
    Remarque : Un volume fixe de chaque échantillon est utilisé pour l’extraction de l’ARN ; par conséquent, le volume de l’aliquote doit être exact.

2. Extraction de l’ARN

  1. Décongeler les échantillons congelés sur la glace (de l’étape 1.5).
    1. Garder échantillon froid sur la glace au cours de l’extraction de l’ARN. Chill réactif de lyse et chloroforme sur l’avant de la glace de l’utiliser.
  2. Ajouter 5 volumes (1000 µL) de réactif de lyse, contenant une solution de phénol et guanidine isothiocyanate, à l’échantillon (200 µL), monophasique et mélanger vigoureusement au Vortex pendant 1 min.
  3. Ajouter 5 µL de 5 nM synthétique miRNA Caenorhabditis elegans (Syn-cel-miR-238-3 p).
  4. Ajouter 1 volume (200 µL) de chloroforme et mélanger vigoureusement au Vortex pendant 1 min.
  5. Rester sur la glace pendant 2 à 3 min et centrifuger les échantillons à 12 000 x g à 4 ° C pendant 15 min.
  6. Transférer la phase aqueuse soigneusement dans un microtube de nouveau.
    Remarque : Ne transférez pas les phase organique (rouge) ou l’interphase (blanc). Le volume de la phase aqueuse collecté devrait être uniform pour éviter de gérer l’incompatibilité, qui se traduit par une variation technique accrue. La quantité habituelle de phase aqueuse transféré dans le présent protocole a été 650 µL.
  7. Ajouter 1,5 volumes (975 µL) d’éthanol et mélanger bien en pipettant également de haut en bas.
  8. Transférer l’échantillon dans une colonne correspondante et l’adaptateur, suivie du séchage sous vide pendant 3 min à l’aide de collecteurs sous vide. Si le volume de l’échantillon est plus de 700 µL, répétez cette étape pour traiter le reste de la solution.
    Remarque : ARN basée sur les colonnes est compatible avec la méthode vide et centrifugation.
  9. Ajouter 200 µL d’éthanol à la colonne, suivie du séchage sous vide pendant 1 min.
  10. Ajouter 800 µL de tampon de RTT à la colonne, suivie du séchage sous vide pendant 2 min.
  11. Ajouter 800 µL de tampon de la RPE à la colonne, suivie du séchage sous vide pendant 2 min.
  12. Répétez l’étape 2.11.
  13. Ajouter 300 µL d’éthanol à la colonne, suivie du séchage sous vide pendant 1 min.
  14. Placer la colonne sur un microtube de nouveau et centrifuger à 12 000 g à la température ambiante (15 à 25 ° C) pendant 1 min.
  15. Transférer la colonne dans un microtube de nouveau et ajouter 50 µL d’eau exempte de nucléase.
  16. Reposer à température ambiante (15 à 25 ° C) pendant 3 min et centrifuger à 8 000 × g à température ambiante (15 à 25 ° C) pendant 1 min.
  17. Réappliquez l’éluat à la colonne.
  18. Répétez l’étape 2.16 et stocker l’éluat à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.

3. synthèse de cDNA

  1. Décongeler les échantillons congelés (de l’étape 2.18).
  2. Préparer une concentration connue d’oligonucléotides synthétiques de RNA qui correspondent aux cibles miARN.
    1. Utilisation oligonucléotide synthétique de RNA pour produire une courbe d’étalonnage en qPCR. Solution mère de concentration de 1 x 108 copie/µL est préparée à des fins de stockage.
    2. Diluer la solution 10 fois pour obtenir 1 x 107 copie/µL (pas des échantillons pré amplifiés) ou solution de travail de 1 x 105 copie/µL (échantillons pré amplifiés) comme la concentration la plus élevée pour la construction de la courbe d’étalonnage. En général, une gamme suggérée pour les concentrations de la courbe d’étalonnage est de 1 x 107 à 1 x 102 copie/µL (pas des échantillons pré amplifiés) ou 1 x 105 à 1 x 100 copie/µL (échantillons pré amplifiés).
  3. Préparer les multiplex piscine d’amorce de RT en mélangeant des volumes égaux des amorces de RT x 20 pour cible miARN.
    Remarque : Comme illustré à la Figure 2, un bassin contenant jusqu'à 4 cible miARN est possible en mélangeant les amorces de RT 20 x de chacun des miARN dans la piscine. Cel-miR-238 (contrôle externe) doit être inclus parmi les miARN cible dans chaque tube. En cas de moins de 4 cibles miARN, ajouter des quantités égales de tampon TE 1/10 au lieu de l’apprêt de RT 20 x.
  4. Préparer le mélange de réaction de RT : 3 µL d’apprêt RT piscine (à l’étape 3.3), 0,15 µL des dNTPs 100 mM avec dTTP, 1 µL de la transcriptase inverse (50 U/µL), 1,5 µL 10 x tampon RT, 0,19 µL d’inhibiteur de RNase (20 U/µL) et 4.16 µL d’exempte de nucléase de l’eau.
  5. Mix 10 µL de la réaction de RT mélanger 5 µl de l’échantillon de RNA (à l’étape 3.1) ou d’oligonucléotides (de l’étape 3.2) en pipettant également et incuber sur glace pendant 5 min.
  6. Exécuter la transcription renversée sur un appareil cycleur thermique : 16 ° C, pendant 30 min, 42 ° C pendant 30 min, suivie d’une étape d’inactivation de final de la transcriptase inverse à 85 ° C pendant 5 min. échantillons transcription inverses de magasin à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.

4. préamplification (facultative)

Remarque : Les miARN qui affiche des valeurs de Cq au-dessus de 35 ou plus en qPCR subséquente est pré amplifié.

  1. Décongeler les échantillons congelés (à l’étape 3.6).
  2. Faire 10 fois des dilutions du produit RT d’oligonucléotides synthétiques de RNA ; 1 x 105 à 1 x 100 copie/µL pour générer la courbe d’étalonnage.
  3. Préparer piscine apprêt essai multiplex en mélangeant des volumes égaux (5 µL) de 20 x amorces de dosage miARN cible avec la concentration finale de chaque amorce de dosage dilué 200 fois par tampon TE dans un volume final de 1 000 µL.
    Remarque : Les amorces de dosage dont miARN cible peut être décelées dans qPCR ultérieur sans pré amplification et ceux de cel-miR-238 (contrôle externe) ne figurent pas dans la piscine de l’apprêt.
  4. Préparer le mélange réactionnel de pré-amplification : 12,5 µL de 2 x réactif preamplification prêt-à-utiliser, 3,75 µL de piscine apprêt test (de l’étape 4.3) et 6,25 µL d’eau exempte de nucléase.
  5. Mix 22,5 µL de pré-amplification réaction 2,5 µL d’inverse transcrit échantillon (point 4.1) ou d’oligonucléotides (de l’étape 4.2) se mêlent de pipetage et incuber sur glace pendant 5 min.
  6. Exécuter la réaction sur un appareil cycleur thermique : 95 ° C pendant 10 min ; suivie par 12 cycles de 95 ° C pour 15 s et 60 ° C pendant 4 min. stockent des échantillons pré amplifiés à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.

5. quantitative PCR en temps réel (qPCR)

  1. Décongeler les échantillons congelés (de l’étape 3.6 ou 4.6).
  2. Diluer les échantillons 5 fois avec de l’eau stérile.
  3. Préparer des dilutions 10 fois du produit RT dérivé d’oligonucléotides synthétiques de RNA ; 1 x 107 à 1 x 102 copie/µL (pas des échantillons pré amplifiés) ou 1 x 10-5 1 x 100 copie/µL (échantillons pré amplifiés) pour générer des courbes d’étalonnage.
  4. Préparer le mélange réactionnel de qPCR : 10 µL de 2 x réactif d’amplification de prêt-à-utiliser, 1 µL de 20 x réactif d’analyse, contenant des amorces PCR et la sonde correspondant à la cible miRNA, marche avant/marche arrière et 7 µL d’eau exempte de nucléase.
  5. Transférer 18 µL du mélange de la réaction de qPCR aux plaques optique rapide réaction de 96 puits et ajouter 2 µL de sérums des dilués (à partir d’étape 5.2 ou 5.3) dans les puits.
    NOTE : Échantillons et étalons pour qPCR sont mis en place en double.
  6. Sceller la plaque avec film adhésif et centrifuger brièvement.
  7. Exécuter la réaction sur un thermocycleur en temps réel : 95 ° C pendant 20 s, suivie de 45 cycles de 95 ° C pour 1 s et 60 ° C pendant 20 s.

6. analyse de données

  1. Calculer le nombre de copie brute de chaque échantillon à l’aide du logiciel d’analyse de données qui fonctionne avec les correspondant thermocycleur en temps réel.
    Remarque : Ligne de seuil est définie manuellement sur « 1.0 » dans toutes les plaques dans l’étude, pour confirmer la reproductibilité par comparaison avec leurs vallées de Cq. Seuil est fixé à Cq > 40 cycles.
  2. Calculer la moyenne du nombre de copie brute de chaque échantillon de doublons.
  3. Calculer le facteur de correction en divisant un nombre de copies de cel-miR-238 dans chaque échantillon par la moyenne du nombre de copies de cel-miR-238 de tous les échantillons dans un tube correspondant.
    Remarque : Comme indiqué dans la Figure 2, chaque tube contient jusqu'à 4 cible miARN dont cel-miR-238 (contrôle externe). Facteur de correction est donc calculé pour chaque tube à l’aide de la valeur correspondante de cel-miR-238.
  4. Calculer le nombre de copies ajustées en divisant le nombre de copie brute moyenne de chaque échantillon (à partir d’étape 6.2) par le facteur de correction (à partir d’étape 6.3) pour chaque échantillon.
  5. Calculer le nombre de copies absolue en multipliant le nombre de copie brute ajustée de chaque échantillon (à partir de 6.4 étape) par le le facteur de dilution pour chaque échantillon.
    Remarque : Le facteur de dilution est « 5 » dans le présent protocole, qui est dérivée de point 5.2.
  6. Calculer l’efficacité de l’amplification par PCR de la pente de l’intrigue des valeurs Cq pour chaque dilution en série contre la concentration de cDNA logarithmique.
    NOTE : Formule de calcul de l’efficacité ; E = (10(-1/pente) -1) x 100 %.
  7. Calculer la variation de technique utilisant les valeurs de Cq de cel-miR-238 de tous les échantillons à l’aide de la formule E = (2 x amplification d’efficacité)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)).
    Remarque : Les étapes 6.5 et 6.7 sont utilisés pour l’évaluation de la qualité de la procédure.

Résultats

Workflow de miRNA analyse par RT-qPCR et qualité assessment
La figure 1 illustre le flux de travail de miRNA analyse d’échantillons de sang à l’aide de qPCR10. La qualité des expériences peut être vérifiée en incluant cel-miR-238 comme un contrôle externe. Cela révélera variations techniques d’extraction de l’ARN et traite de la RT-qPCR ultérieur. Dans cette étude, la moyenne ± écart ...

Discussion

Notre évaluation globale a fourni une analyse statistique plus rigoureuse de l’étendue de la gamme dynamique, qui indique clairement que l’ampleur de la variation entre les échantillons individuels était extrêmement différent parmi les miARN testé. Bien que ces variations peuvent être attribuables à leurs petites quantités dans les fluides corporels, il convient de noter que ces données reflètent non seulement des variations biologiques, mais aussi des variantes techniques. La plupart de la variation de l...

Déclarations de divulgation

L’auteur n’a aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Remerciements

Cette recherche n’a pas reçu une subvention spécifique de bailleurs de fonds dans les secteurs publics, de commerciale ou à but non lucratif.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
BD Microtainer tube (K2EDTA)Becton, Dickinson and Company365974For blood collection
Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mLEppendorf0030124359
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  1.5 mLEppendorf0030120086
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  2.0 mLEppendorf0030120094
Synthetic oligonucleotideHokkaido System Science-Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade)
Tris-EDTA Buffer  (pH 8.0)Nippon Gene314-90021TE buffer
Buffer RPEQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
Buffer RWTQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
miRNeasy Mini KitQIAGEN217004
Nuclease-Free Water QIAGEN129114
QIAzol Lysis ReagentQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic QIAGEN219600ID:MSY0000293, 5 nmol
SC AdaptersTAIGEN Bioscience CorporationS0120For RNA extraction
VacEZor 36 Complete SystemTAIGEN Bioscience CorporationM3610For RNA extraction
7900HT Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific Inc.4351405Fast 96-Well Block
GeneAmp PCR System 9700Thermo Fisher Scientific Inc.9700
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction PlateThermo Fisher Scientific Inc.4346907
MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific Inc.4311971
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific Inc.4444557
TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000248
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002245
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002246
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002222
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000491
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000510
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000511
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002290
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 001352
TaqMan MicroRNA Reverse
Transcription Kit		Thermo Fisher Scientific Inc.4366597
TaqMan PreAmp Master Mix (2×)Thermo Fisher Scientific Inc.4391128
Chloroform Wako Pure Chemicals035-02616
Ethanol (99.5)Wako Pure Chemicals057-00456

Références

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