中性粒细胞衍生微粒的分离与鉴定功能研究

摘要

本文介绍了新的协议, 以分离和表征从人和小鼠中性粒细胞衍生的微粒。这些协议利用离心、流式细胞术和免疫印迹法技术对微粒含量进行分析, 可用于研究不同细胞类型的微粒在细胞功能中的作用。

摘要

中性粒细胞衍生微粒-MPs) 是脂双层, 球形微泡大小不等, 直径从 50–1,000 nm。MPs 是细胞对细胞通信和信号机械的一个新兴的、重要的组成部分。因为他们的大小和他们释放的性质, 直到最近 MP 存在被忽略了。然而, 随着技术和分析方法的改进, 它们在健康和疾病中的作用正在出现。这里提出的协议旨在通过流式细胞术和免疫印迹法分离和表征中性粒的 MPs。同时给出了几个实现实例。这些 MP 隔离协议是快速、低成本的, 不需要使用昂贵的套件。此外, 它们允许在隔离后对 MPs 进行标记, 以及在 MP 释放之前对源细胞进行预先标记, 使用膜特异荧光染料进行流式细胞仪的可视化和分析。然而, 这些方法有几个限制, 包括 PMNs 和 MPs 的纯度和复杂的分析仪器的需要。一个高端流式细胞仪是需要可靠地分析 MPs 和尽量减少假阳性读数由于噪声或自动荧光。所述协议可用于分离和定义 MP 合成, 并在不同刺激条件下表征其标记和组成的变化。可利用大小异质性研究膜颗粒与外来体的含量是否不同, 以及它们是否在组织稳态中发挥不同作用。最后, 在对 MPs 的分离和鉴定之后, 可以探讨它们在细胞反应和各种疾病模型 (包括炎症性肠病或急性肺损伤) 中的作用。

引言

最近, 来自细胞细胞质或等离子膜的 "微粒/微泡" 已成为极大的科学兴趣, 因为新兴的数据表明, 这些结构, 范围从 50-1, 000 nm 直径, 可以携带生物信息和作为一种非规范化的蜂窝通信方法。免疫细胞衍生的 MPs, 特别是中性粒细胞 (PMNs) 所产生的, 对于 PMNs 在宿主防御中的重要作用是很有兴趣的^1,2, 炎症反应³, 伤口愈合⁴. 迄今为止, 许多报告都显示了中性粒细胞-mps⁵的亲炎症和抗炎作用, 表明了 mps 的潜在环境、疾病、物种和器官特定作用。

本通信中描述的协议为研究 MPs 在健康和疾病中的作用提供了一种成本效益高、创新性和适应性强的方法。它们适用于许多模型有机体, 器官和刺激条件。他们允许鉴定几种类型的 MPs, 并可用于未来, 以解决他们的亲炎和抗炎功能。例如, 这里描述了如何研究中性粒细胞-MPs 在上皮创面愈合中的作用体外和体内。提出了分离小鼠骨髓源性 PMNs 的协议, 并对先前描述的方法⁶进行了一些修改。

此外, 本研究中描述的协议可以通过两种互补的方法来检测和表征中性粒细胞 (MPs) 的特异标记物: 西方印迹和流式观察仪。我们发现使用标准协议⁵的 MPs 的免疫印迹法是容易和可靠的, 然而, 最近的进展, 流式细胞仪的灵敏度和改进的信噪比现在允许进一步分析 MPs 使用这种方法。本研究中所述的协议包括最近的研究成果和建议, 如对离心速度和时间的修改, 添加采样过滤和冻结/存储条件^7,8, 以及如何减少 "背景噪声", 提高中性粒细胞的检测极限, 并区分不同大小的 mps。

研究方案

所有的动物工作都是由西北 IACUC 批准的。所有的实验都是按照所有相关的规章制度和制度准则完成的。对于献血者, 知情同意书被提出并签署;此外, 这项研究中的所有人类学科都是按照《机构和联邦人类福利准则》处理的。

注意: 协议步骤列在以下小节中: (i) 小鼠骨髓细胞分离;(ii) 中性粒细胞与小鼠骨髓隔绝;(iii) 中性粒细胞与人血隔绝;(四) MP 与中性粒细胞上清液 (由离心) 隔离;(五) 用西方印迹描述 MPs;(vi) 流式细胞术对 MPs 的表征;(viii) 孤立的 MPs 在伤口愈合研究中的应用

1. 小鼠骨髓细胞分离

1. 小鼠后腿的股骨和胫骨解剖
   1. 准备一个安乐死盒 (例如, 一个空的1毫升提示盒) 吸入麻醉。添加几滴100% 异氟醚到一个不育布贴在塑料盒盖内。根据新的 IACUC 准则, 动物不应该直接接触异氟醚, 因此在老鼠和含有异氟醚的纱布之间放置一个尖端支架。
      注: 异氟醚是一种强大的吸入麻醉药, 应在通风罩内极端小心处理。
   2. 弄死小鼠按 IACUC 推荐。将鼠标放在步骤1.1.1 中描述的安乐死框中, 1–5分钟, 直到它停止呼吸。通过执行颈椎脱位来确保动物的死亡。
   3. 用不锈钢、12厘米弯曲、0.17 毫米 X 0.1 毫米镊子和在上肢和下肢之间切开皮肤的腹部皮肤。将皮肤从这里剥离到老鼠身体的最远端部分, 包括下肢。用10厘米长, 直解剖剪刀, 从后腿移除肌肉和脱臼髋部关节留下股骨头完整。
   4. 用剪刀解剖股骨和胫骨的肌肉, 并将股骨与胫骨分开。确保骨骼的两端保持完好, 因为它们含有大量的骨髓。
   5. 通过在纸巾内滚动骨头来除去所有剩余的肉。将干净的骨骼放在含有无血清培养基的培养皿中 (可以持续使用,即, Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM), 不含血清或抗生素)。
   6. 在70% 乙醇中冲洗骨头, 然后在森林中。
   7. 在50毫升圆锥管中准备50毫升的森林能持续。将10毫升的可持续森林可持续性转化为10毫升注射器, 并将其附加到25和5/8 英寸口径的针上。
   8. 用剪刀修剪骨头的末端, 直到骨髓的开口 (红颜色) 可见。
   9. 将骨髓细胞冲洗成新的50毫升管。使用10毫升注射器与26和5/8 英寸测量针与大约3毫升/骨的可以持续森林。冲洗完后, 用吹打 (使用一次性1毫升塑料小贴士) 并用重悬管中的细胞, 以打破细胞团聚体。

2. 小鼠骨髓中性粒细胞的分离

1. 红细胞裂解
   1. 用离心在 350 x g上将收集到的骨髓颗粒在4摄氏度8分钟。
   2. 并用重悬细胞颗粒在20毫升0.2% 氯化钠约20-30 秒溶解红细胞分数。不要超过三十年代, 因为这将导致中性粒细胞裂解。添加20毫升1.6% 氯化钠, 以恢复渗透。
      注意: 这一步可能导致很少的中性粒细胞活化。
   3. 用2毫升的 PBS 和离心机清洗细胞, 2.1.1 以上步骤。移除上清。
   4. 进行密度梯度离心分离 PMNs。
2. 密度梯度离心法分离中性粒细胞
   1. 温暖的聚蔗糖和钠葡溶液, 密度为1.119 克/毫升和1.077 克/毫升 (参见材料表), 以室温 (RT) 使用前。
   2. 准备聚蔗糖和钠葡梯度新鲜, 立即在骨髓细胞应用之前, 慢慢地分层3毫升的1.077 克/毫升密度溶液3毫升的1.119 克/毫升密度溶液在15毫升圆锥管。
      注: 梯度溶液的制备在很大程度上会导致混合层和不良的中性粒细胞纯度和恢复。
   3. 并用重悬骨髓细胞颗粒在1毫升冰冷 PBS 和叠加产生的细胞悬浮在聚蔗糖和钠葡梯度 (缓慢, 以避免混合层)。
   4. 离心机为30分钟在 850 x g 在25°c 在 RT,没有刹车。将试剂保存在 RT 中, 有效地将中性粒细胞与骨髓中的其他细胞分离。将离心机设置为慢速减速, 以便在离心步骤后有效地形成和保持梯度。
   5. 在 PBS 和1.077 克/毫升密度溶液 (上层) 的界面上视觉定位单个核细胞层。去掉这个层和其余的密度解决方案, 而不干扰中性粒细胞带。
   6. 收集一个完整的中性粒细胞层和一些基础聚蔗糖和钠葡1.119 克/毫升溶液成15毫升管使用转移吸管。
      注意: 隔离 PMNs 的纯度将取决于对上层层的完全去除。
   7. 管与过滤 PBS (过滤通过0.1 µm 孔径过滤器) 和离心机在 300 x g 5 分钟, 在4°c。
   8. 使用离心条件, 如步骤 2.2.7, 用2毫升的 PBS 洗涤颗粒 PMNs。
   9. 并用重悬在1毫升的过滤 PBS 和计数的孤立 PMNs 由 hemocytometer。
      注: 对于这种隔离方法, 所产生的中性粒细胞纯度为 ~ 85-90%, 这是由流式检测仪评估的。其余的污染分数主要由单核淋巴细胞组成。
3. 中性粒细胞刺激诱导 MP 释放
   注: PMNs 可刺激释放 MPs 使用各种活化条件, 包括 n-甲酰基-l-methionyl-leucyl-l-苯丙氨酸 (fMLF), phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), 或干扰素伽玛 (IFNγ)。重要的是, 在模拟之前, PMNs 应该一直放在冰上。
   1. 颗粒 PMNs (300 x 克, 5 分钟, 4 °c) 和并用重悬在0.1 µm 过滤了汉克的平衡盐溶液 (HBSS) 溶液中, 含有刺激剂的选择。为优化刺激, 使用100µL 刺激溶液每 1000万 PMNs 20-30 分钟在37°c 在15毫升管。
      注: 在我们以前的工作中成功地使用了以下活化剂浓度: fMLF (0.5-1 µM 为人和2-5 µM 为小鼠 PMNs)、PMA (200 毫微米) 和 IFNγ (100 ng/毫升)。如果需要预先标记的 MPs 的发行, 孵化静态 PMNs (1-5 x 10⁶) 与 n-(2-氨基乙基) maleimide FITC (参见材料表) (1 µM 在100µL HBSS, 15 分钟, 37 °c)。继续执行步骤 2.3. 1-2. 3.3。
   2. 在4摄氏度处旋转 850 x g 5 分钟, 去除 PMNs 并将无细胞上清液转移到新的1.5 毫升离心管中。
   3. 对于从无单元格上清液的 MP 隔离, 请继续执行步骤4.2。

3. 中性粒细胞与人血分离

1. 根据机构内部评级准则, 招募健康志愿者进行血液提取。
   1. 从一个健康的志愿者的前臂收集血液到商业上可利用的5毫升含柠檬酸钠的管 (请参阅材料表)。
   2. 吸管5毫升葡聚糖和钠葡溶液 (密度为1.113 克/毫升, 见材料表) 成无菌15毫升管和缓慢层5毫升新鲜隔离的人外周血在它上面。
   3. 离心管50分钟在 400 x g 在 RT (25 °c) 与低加速度和没有刹车。
   4. 在离心结束时, 使用无菌的塑料吸吸管去除血浆和单个核细胞 (上层)。
   5. 将底层 (PMNs) 转移到新的无菌50毫升圆锥管中。
   6. 在 PMNs 中加入等量的0.45% 氯化钠 (混合好, 轻轻旋转管)。
   7. 离心机为10分钟在 400 x g 在25°c。
2. 红细胞裂解
   1. 在四十五年代加入10毫升的冰冷, 不育水给颗粒细胞, 其次是10毫升的冰冷无菌 1.8% NaCl, 以恢复渗透。
      注意: 应在冰上执行所有的中性粒细胞隔离步骤, 以避免中性粒细胞活化和早产 MP 释放。裂解步骤本身会导致轻微但不显著的中性粒细胞活化, 然而, 它是必不可少的隔离纯中性粒细胞的功能化验。
   2. 离心的细胞为10分钟在 250 x g 在4°c 与软减速。
   3. 重复步骤3.2.1 和3.2.2。
   4. 并用重悬 PMNs 5 毫升冰冷 HBSS, 无钙或镁。计数总活细胞 (使用 hemocytometer 和生存能力染色在1:2 稀释, 参见材料目录) 在刺激之前。
      注: 隔离 PMNs 应用于刺激或其他实验2小时内隔离, 以避免功能和细胞变化和细胞死亡。

4. MP 与活化中性粒细胞分离上清液

注: 类似的协议用于隔离小鼠和人类 PMNs 的 MPs。

1. 颗粒 PMNs (300 x g, 5 分钟, 4 °c) 和并用重悬在0.1 µm 过滤 HBSS 解决方案, 包含刺激剂的选择 (例如1µm fMLF, 见注: 2.3.1)。为最佳的刺激使用100µL 刺激解答每 1000万 PMNs 20-30 分钟在37°c 在15毫升管子。
2. 刺激后, 在4摄氏度的 600 x g 处旋转激活 PMNs 5 分钟, 并将无细胞上清液转移到新的1.5 毫升离心管。
3. 离心机的中性粒细胞清除清液 1.3万 x g, 10 分钟, 4 °c, 以去除电池碎片和转移清除上清到一个新的 ultracentrifuge 管。
4. 离心机为1小时在 10万 x g, 在4°c。在 MP 存储之前删除上清液。根据需要, 储存颗粒状 MPs 在石蜡密封 ultracentrifuge 管在-80 °c, 直到使用的实验。

5. 用西方印迹检查中性粒细胞-MPs

1. 添加 1% SDS 缓冲器 (50-200 µL 100 毫米三 pH: 7.4) 到 MPs 颗粒 (从步骤 4.4), 转移到新的1.5 毫升离心管和煮沸裂解 MPs 5 分钟。
   注意: 必须调整和优化每个感兴趣的蛋白质的 MPs 和溶解缓冲容积的数量。
2. 载入含有10% β-巯基乙醇的负载缓冲器中每车道的中性粒细胞 MPs。
   注意: 用我们的方法, 我们加载从相同数量的受刺激 PMNs 隔离的 MPs。
   1. 在10% 聚丙烯酰胺凝胶上分离裂解物 (使用 50-100 V 1-1. 5 小时), 并将总蛋白转移到硝化纤维膜上, 如下所述 9.
3. 在 0.05% Tween-20 三缓冲盐水中用5% 非脂牛奶块膜1小时, 然后用适当的初级 (隔夜在4摄氏度) 孵化, 其次是二次酶共轭抗体。
4. 通过将 chemoluminescence 溶液添加到薄膜中, 并在防光盒 (1-24 小时) 内暴露在 X 射线胶片上, 可视化带。

6. 流式细胞仪检查中性粒度 MPs

1. 抗体染色, 适当稀释抗体在外地资产管制署缓冲区 (PBS 与0.1 毫米 EDTA, 0.1% 叠氮化钠)。并用重悬颗粒中性粒细胞-MPs (从 1-3 x¹⁰ 6 PMNs/条件) 在100µL 抗体溶液中获得。
   1. 如果染色的蛋白 v, 并用重悬颗粒中性粒细胞-MPs 在蛋白 V 缓冲器含有5µL FITC 共轭蛋白 v。如果与抗体共染色, 添加所需的抗体 (例如, 请参阅材料表) 直接到蛋白 V 解决方案。添加荧光脂染料, n-(2-氨基乙基) maleimide (见材料表), 1 µM 浓度在100µL 的外地资产管制署缓冲区, 以标签和识别 MPs。
2. 在染色液中孵育 MPs 至少20分钟, 在4摄氏度。
3. 用离心 (1 小时, 10万 x g, 4 摄氏度) 清洗 MPs;放弃上清。
4. 并用重悬在外地资产管制系统缓冲区中, 并在指定的流式细胞仪上运行样本, 配备升级后的电子设备以提高灵敏度 (请参阅材料表)。

7. 孤立中性粒细胞-MPs 在创面愈合中研究中性粒细胞功能的应用

1. 在体内管理中性粒细胞-MPs 到结肠伤口
   1. 麻醉小鼠腹腔注射氯胺酮 (100 毫克/千克) 和甲苯噻嗪 (5 毫克/千克) 的混合物。通过踏板反射 (牢固的脚趾捏) 确认麻醉, 必要时进行调整。
   2. 将鼠标放在它的胃上, 使用28厘米的活检钳和一个装有高分辨率照相机的内窥镜 (如用于小动物使用的兽医内窥镜, 请参阅材料表), 沿背侧产生3-5 处浅层伤口。结肠.受伤后, 将小鼠送回置于温度控制 (37 摄氏度) 垫子上的笼子, 直到恢复。
   3. 麻醉小鼠 (如步 7.1.1)。使用内窥镜获取受伤后24小时 (1 天) 造成的伤口图像。让老鼠在步骤7.1.2 中恢复。
   4. 同时 (24 小时后受伤), 管理小鼠中性粒细胞-MPs 从 2 x 10⁶ PMNs 100 µL HBSS + 直接进入每个伤口部位使用基于结肠镜检查的显微注射系统 (使用29克针)⁹。三天后 (4 天受伤后) 麻醉小鼠 (如步 7.1.1), 并使用内窥镜重新获取愈合伤口的图像。让老鼠在步骤7.1.2 中恢复。
   5. 使用首选的图像分析软件 (请参阅材料表), 在获得的图像中勾勒出可见的伤口区域, 测量在1天和4创伤后的同一伤口面积, 并计算伤口闭合的百分比。
2. 人上皮细胞体外创面愈合
   1. 计数 Caco-2 BBe 或 T84, 人肠道上皮细胞 hemocytometer 和种子 5 x 10⁵细胞/以及24井培养板。在标准孵化室的37°c 和 5% CO₂孵化细胞。Caco-2 BBe 或 T84 在 48 h⁹内达到融合。要培养上皮细胞, 请使用 DMEM 和 DMEM-F12 (50:50), 如前所述的⁹。
   2. 使用吸管尖端和低吸力在单层中产生机械刮伤, 如前所述^4,9。使用反相对比度差动显微镜 (使用5X 或10X 目标), 在划伤后立即获取伤口区域的图像, 用作时间 = 0 参考点。
   3. 添加 MPs (从 2-4 X 10⁶ PMNs) 到划伤的上皮细胞单分子膜, 再孵育 24 h (48 h 后伤后, 37 摄氏度与 5% CO₂)。此时重新获取伤痕的影像。
   4. 使用首选的图像分析软件 (请参阅材料表), 以测量 t = 0 和 t = 48 h 的伤口面积. 通过确定所选时间点上伤口区域的差异来计算伤口闭合的百分比。

结果

从人和鼠标 PMNs 隔离的 MPs 的代表性流细胞分析显示在图 1中。中性粒细胞的大小异质性可以通过与已知大小的珠子的比较来评估, 如图 1A、B中所示. 注意, 小鼠和人的 mps 在大小非均质上没有显著差异。同样, 使用流式细胞术和荧光标记, 可以确定由老鼠或人的孤立的 MPs 所选择的蛋白质/s 的表达。例如, 磷脂丝氨酸 (...

讨论

本文介绍了中性粒细胞衍生 MPs 的分离和鉴定的协议。必须考虑到这一程序取得成功的几个关键关键点。首先, PMNs 必须隔离新鲜, 并在2小时内的隔离实验中使用, 以防止自发活化和脱粒。所有的 PMNs 在隔离和刺激点的处理必须在冰上执行, 以防止激活和过早 MP 释放¹²。第二, 离心为1小时或以上, 最大限度地提高了国会议员的造粒. 第三, 对于流式细胞术的分析, 必须用仪器指定的荧?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-041-CV
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)	Atlanta Biologics	S11150
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)	GIBCO	15140
0.5 M EDTA	Fisher	BP2482
Sodium chloride	Sigma	S9888	Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit
Sterile filtered Histopaque 1077	Sigma	10771
Sterile filtered Histopaque 1119	Sigma	11191	Density 1.119 g/ml.  Solution of polysucrose and  sodium diatrizoate. Bring to room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium	Cellgro	210-40-CV
Ethyl Alcohol (200 proof)	Decon labs	2701
HBBS	Corning	21-022-CV
Trypan Blue Solution, 0.4%	Sigma	T8154 SIGMA	Diluted 1:2 for cell viability counting
Isoflurane	Abbot	50033
Anti-human CD11b-APC conjugated	Biolegend	301350	Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL)
BODIPY FL	Invitrogen	B10250	N-(2-aminoethyl) maleimide
Annexin V Binding Buffer	Biolegend	422201
Calibration Beads for Flow Cytometry	BioCytex	7803
FITC Annexin V	Biolegend	640906
Polymorphprep	Axis-Shield PoC AS		Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml
C57BL/6 mice	Jackson Labs
15 ml centrifuge tubes	Corning	430053
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
25 ml serological pipettes	Celltreat	229225B
10 ml serological pipettes	Celltreat	229210B
5 ml serological pipettes	Celltreat	229205B
Pasteur pipettes	BD Falcon	357575
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)	BD	305122
100 µm cell strainers	Celltreat	229485
Vacutainer tubes	BD	367251
Equipment
LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP)	BD	(SORP)
Swinging bucket centrifuge	ThermoFisher Scientific	75007210
Ultracentrifuge	Beckman	(L8-80 M)
Micro-centrifuge	ThermoFisher Scientific	VV-17703-15 (Fresco 17)
Swinging bucket centrifuge	ThermoFisher Scientific	75004503 (Megafuge 40R)
Biopsy forceps, 28 cm	Storz	27071zj
Software
Image J	National Institute of Health	Open source