Yalıtım ve nötrofil kaynaklı Microparticles karakterizasyonu için fonksiyonel çalışmalar

Özet

Yeni iletişim kuralları burada yalıtmak ve insan türetilmiş microparticles karakterize açıklanmıştır ve fare nötrofiller. Bu protokoller ultrasantrifüj, Akış Sitometresi ve microparticle içeriği analiz etmek için immunoblotting teknikleri kullanmak ve çeşitli hücre tiplerinin hücresel işlevde türetilen microparticles rolü çalışma için kullanılabilir.

Özet

Polimorfonükleer nötrofil kaynaklı microparticles (PMN)-MPs) lipid bilayer, çapı 50-1000 nm arasında değişen boyutlarıyla küresel microvesicles vardır. MPs bir yeni gelişen, hücre hücre iletişim ve sinyal makine önemli parçası vardır. Büyüklükleri ve serbest bırakılmaları doğası nedeniyle, yakın zamana kadar MP varlığını gözden oldu. Ancak, gelişmiş teknoloji ve analitik yöntemleri ile sağlık ve hastalık kendi işlevleriyle şimdi ortaya çıkıyor. Burada sunulan protokolleri Akış Sitometresi ve immunoblotting tarafından izole edip PMN-MPs karakterize hedefleniyor. Ayrıca, çeşitli uygulama örnekleri verilmiştir. Bu protokoller MP yalıtım için hızlı, ucuz ve pahalı setleri kullanılması gerekli değildir. Ayrıca, onlar bir membran özel floresan boya kullanarak görselleştirme ve analiz için Akış Sitometresi tarafından yalıtım aşağıdaki gibi MP yayın önce kaynak hücrelerinin önceden etiketleme MPs etiketleme için izin. Bu yöntemi ancak, saflık PMNs ve MPs ve gelişmiş analitik araçları ihtiyacını da dahil olmak üzere bazı sınırlamaları vardır. Bir high-end Akış Sitometresi güvenilir MPs analiz ve yanlış pozitif okuma gürültü veya otomatik Floresans nedeniyle en aza indirmek için gereklidir. Açıklanan protokoller yalıtmak ve MP Biyogenez tanımlamak için kullanılan ve onların işaretleri ve kompozisyon farklı uyarıcı koşullar altında varyasyon karakterize. Boyutu heterojenite membran parçacıklar exosomes karşı içeriğini farklı olup olmadığı ve olup doku homeostazı içinde farklı rolleri yerine getirmek araştırmak için yararlanılabilir. Son olarak, aşağıdaki yalıtım ve karakterizasyonu MPs, hücresel yanıt işlevlerine ve çeşitli hastalık modelleri (dahil olmak üzere, inflamatuar barsak hastalıkları veya akut akciğer yaralanma gibi PMN ilişkili enflamatuar bozuklukları) düzenlemelidir.

Giriş

Çapı, 50-1000 nm arasında değişen bu yapıların biyolojik bilgi taşıdığını ortaya çıkan veri önerdiği gibi son zamanlarda, "microparticles/microvesicles" hücre sitozol ve plazma zarı'büyük bilimsel ilgi haline gelmiştir ve hücresel iletişim kurallı olmayan bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Bağışıklık hücre MPs kaynaklı ve özellikle bu polimorfonükleer nötrofiller (PMNs) tarafından üretilen PMNs önemli rolü ana savunma^1,2, inflamatuar yanıt³ve yara iyileşmesi verilen büyük ilgi vardır ⁴. çoğu intriguingly konularda, şimdiye kadar çok sayıda rapor pro-inflamatuar ve anti-inflamatuar PMN-MPs⁵bir potansiyel içerik-, hastalık, türler- ve MPs organ özgü rolü düşündüren, işlevlerinin göstermiştir.

Bu iletişimde açıklanan protokoller MPs işlevi sağlığı ve hastalıkları eğitim için düşük maliyetli, yenilikçi ve uyarlanabilir bir yöntem sağlar. Onlar birçok model organizmalar, organları ve stimülasyon koşullara tabidir. Onlar çeşitli MPs tanımlanması için izin ve gelecekte pro-inflamatuar ve anti-inflamatuar işlevlerini gidermek için kullanılan. Örneğin, açıklanan işte PMN-MPs işlevi epitel yara iyileşme vitro ve içinde vivoçalışma. Kemik iliği türevi PMNs yukarıda açıklanan yöntem⁶bazı değişikliklerle adapte fare yalıtım için sunulan protokolü.

Ayrıca, bu çalışmada açıklanan protokollere algılama ve PMN-MPs üzerinde iki tamamlayıcı yöntemler tarafından bulunabilir belirli işaretleri karakterizasyonu için izin ver: Western blot ve Akış Sitometresi. İmmunoblotting standart protokolleri⁵ kullanarak MPs, kolay ve güvenilir, ancak, şimdi daha fazla MPs analiz için izin duyarlılık Akış Sitometresi aletler ve geliştirilmiş gürültü sinyal oranı son gelişmeler bu yöntemi kullanarak bul. Bu çalışmada açıklanan protokoller son gelişmeler ve Santrifüjü hız ve zaman, örnek filtreleme ve donma/saklama koşulları⁷ ek değişiklikler de dahil olmak üzere özgün araştırma makaleleri gelen önerileri dahil ^{, 8}ve nasıl "arka plan gürültü" azaltmak, PMN-MPs algılama sınırını artırmak ve MPs farklı boyutlar arasında ayırımcılık.

Protokol

Tüm hayvan iş kuzeybatı IACUC tarafından kabul edildi. Tüm deneyler uygun olarak ve tüm ilgili yasal ve kurumsal yönergeleri ile uyum içinde tamamlandı. Kan Bağış insan denekler için aydınlatılmış onam sunulan ve imzaladı; Ayrıca, bu çalışmanın tüm insan denekler insan refahı için kurumsal ve federal yönergelere uygun olarak tedavi edildi.

Not: Protokolü adımları aşağıdaki alt bölümleri altında listelenir: (i) fare kemik iliği hücre izolasyon; (ii) PMN yalıtım üzerinden fare kemik iliği; (iii) PMN insan kanı izolasyonu; (iv) MP izolasyon PMN Supernatants (tarafından ultrasantrifüj); (v) MPs Western Blot tarafından karakterizasyonu; (vi) MPs Akış Sitometresi tarafından karakterizasyonu; (VIII) çalışma yara iyileşmesi için izole MPs uygulanması

1. fare kemik iliği hücre izolasyon

1. Femur ve tibia fare arka bacaklara gelen diseksiyon
   1. Bir ötenazi kutusu (örneğin, bir boş 1 mL İpucu kutusunu) anesteziye inhalasyon için hazırlayın. % 100 isoflurane bir plastik kutu kapak iç bantlanmış bir Steril bez üzerine birkaç damla ekleyin. Yeni IACUC kurallar uyarınca hayvanlar değil isoflurane ile doğrudan temas, böylece yer bir ipucu tutucu isoflurane içeren gazlı bez ve fare arasında.
      Not: Isoflurane güçlü bir inhalational anestezi ve aşırı dikkatli bir duman başlık içinde ele alınmalıdır.
   2. Fareler IACUC öneri göre ötenazi. Bir fare kadar nefes kesildiği tarih vardır 1 – 5 dk 1.1.1. adımda açıklanan ötenazi kutusunun içine yerleştirir. Hayvanın ölüm servikal yerindençıkmasına gerçekleştirerek emin olun.
   3. Karın deri 0,17 X 0.1 mm cımbız paslanmaz çelik, 12 cm kavisli, kullanarak kaldırın ve üst ve alt ekstremitelerde arasında yarı yolda deriyi kesme. Alt ekstremite gibi fare vücudun en distal bölümüne buradan cilt soyma. 10 cm uzunluğunda, ile düz makas anatomi, kaslar arka legs--dan kaldırmak ve femur başı dokunmadan Kalça eklemi yerinden çıkar.
   4. Makas femur ve tibia kas incelemek ve uyluk kemiği tibia ayırmak için kullanın. Kemik iliği önemli miktarda içerdiğinden kemik uçları sağlam kalır emin olun.
   5. Tüm kalan eti kemik bir kağıt havlu içinde haddeleme tarafından kaldırın. Temiz kemikler Serum-Alerjik orta (SFM, Yani, Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) serum veya antibiyotik olmadan) içeren bir Petri kabına yerleştirin.
   6. Kemikleri % 70 etanol ve sonra SFM durulayın.
   7. SFM 50 mL 50 mL konik tüp hazırlayın. SFM 10 mL 10 mL şırınga yük ve bir 25 ve 5/8 inç ölçer iğneye takın.
   8. Bir açılış için kemik iliği (kırmızımsı renk) görünene kadar kemikleri sonu makasla kırpın.
   9. Kemik iliği hücre yeni bir 50 mL tüp floş. Yaklaşık 3 mL/kemik SFM ile 26 ve 5/8 inç ölçer iğneyle bir 10 mL şırınga kullanın. Kızarma bittiğinde, tüp hücrelerde hücre toplamları kırmaya (kullanım 1 mL tek kullanımlık plastik ipuçları) pipetting tarafından resuspend.

2. fare kemik iliği izolasyonu PMN

1. Kırmızı hücre lizis
   1. 350 x g 4 ° C'de 8 min için de centrifuging tarafından toplanan kemik iliği cips
   2. Hücre Pelet %0,2 20 mL resuspend eritrosit kesir lyse NaCl yaklaşık 20-30 s. 30 fazla olamaz bu s PMN lizis neden olacaktır. %1,6 20 mL ekleyin NaCl osmolalite geri yüklemek için.
      Not: Bu adım çok az PMN harekete geçirmek neden olabilir.
   3. PBS ve santrifüj adım 2.1.1 yukarıda olduğu gibi 2 mL hücrelerle yıkayın. Süpernatant kaldırın.
   4. İzoleli PMNs yoğunluk gradient Santrifüjü tarafından devam edin.
2. Yalıtım nötrofil yoğunluk gradient Santrifüjü tarafından
   1. Sıcak polysucrose ve sodyum diatrizoate çözümleri, 1.119 g/mL ve 1.077 g / ( Tablo malzemelerigörmek) mL, oda sıcaklığında (RT) kullanmadan önce yoğunlukları ile.
   2. Polysucrose ve sodyum diatrizoate degradeler taze, yavaş yavaş 1.077 g/mL yoğunluğu çözüm 1.119 g/mL yoğunluğu çözüm 15 mL konik tüpler üzerinde 3 mL 3 mL katman tarafından hemen kemik iliği hücre uygulamadan önce hazırlayın.
      Not: Degrade çözümde çok önceden hazırlanması katmanlar ve zavallı nötrofil saflık ve kurtarma karıştırma neden olur.
   3. Kemik iliği hücre Pelet 1 mL buz gibi PBS resuspend ve polysucrose ve sodyum diatrizoate üzerine ortaya çıkan hücre süspansiyon yerleşimi degrade (yavaş yavaş, katmanları karıştırma önlemek için).
   4. Santrifüj 850 x g RT, fren, 25 ° c de 30 dk için. Reaktifleri RT kemik iliğinde mevcut diğer hücrelerden nötrofil etkili ayrılması için tutun. Etkili bir şekilde kurulmuş ve Santrifüjü adımdan sonra tutulan gradyan için izin vermek için yavaş yavaşlama, santrifüj ayarlayın.
   5. Görsel olarak PBS ve 1.077 g/mL yoğunluğu çözüm (üst katman) arabiriminin mononükleer hücre katmanında bulun. Bu tabaka ve yoğunluk çözüm geri kalanı PMN grup bozmadan kaldırın.
   6. Bir katmanın tamamına PMN ve bazı temel polysucrose ve sodyum diatrizoate 1.119 g/mL solüsyon kullanarak transfer pipet 15 mL tüpler içine toplamak.
      Not: İzole PMNs saflığı tümüyle kaldırılmasını üst katman üzerinde bağlıdır.
   7. Filtre uygulanmış PBS (0,1 µm gözenek boyutu filtre ile filtre) ve 4 ° C'de 5 min için 300 x g, santrifüj tüpleri top
   8. Pelleted PMNs Santrifüjü koşullar olduğu gibi adım 2.2.7 kullanarak PBS 2 mL ile yıkayın.
   9. 1 mL süzülmüş PBS resuspend ve hemasitometre tarafından izole PMNs say.
      Not: Bu yalıtım yöntem için elde edilen PMN saflık tutarlar için ~ 85-%90, gibi Akış Sitometresi tarafından değerlendirildi. Kesirler kirletici kalan öncelikle mononükleer lenfosit oluşur.
3. MP yayın ikna etmek için PMN stimülasyon
   Not: PMNs N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-myristate-13-asetat (PMA) veya Interferon gama (IFNγ) de dahil olmak üzere çeşitli aktive koşul kullanma MPs serbest bırakmak için teşvik. Önemlisi, simülasyon önce PMNs buz üzerinde her zaman tutulmalıdır.
   1. Pelet PMNs (300 x g, 5 dk, 4 ° C) ve resuspend 0,1 µm Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) çözüm, seçim teşvik edici Ajan içeren filtre. En iyi uyarılması için 20-30 dk 15 mL tüpler 37 ° C'de 10 milyon PMNs başına 100 µL stimülasyon çözüm kullanın.
      Not: Aktivatörleri aşağıdaki konsantrasyonları başarıyla önceki çalışmalarda kullanılmıştır: fMLF (0.5-1 µM insan ve fare PMNs için 2-5 µM), PMA (200 nM) ve IFNγ (100 ng/mL). Önceden etiketli MPs sürümü isterseniz, unstimulated PMNs kuluçkaya (1-5 10 x⁶) N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC ile ( Tablo malzemelerigörmek) (100 µL HBSS, 15 dk, 37 ° C de 1 µM). Adımları 2.3.1-2.3.3 ile devam edin.
   2. 850 x g 4 ° C'de 5 min için de PMNs kaldırmak ve boş hücre supernatants yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpler için aktarmak için spin aşağı.
   3. Boş hücre supernatants MP izolasyonu için 4.2 adıma geçer.

3. insan kanı PMN izolasyon

1. Sağlıklı gönüllüler kurumsal IRB esaslarına göre kan çıkarılması için recruit.
   1. Kan sağlıklı gönüllü önkol ( Tablo malzemelerigörmek) ticari olarak mevcut 5 mL sodyum sitrat içeren tüpler-içine toplamak.
   2. 5 mL dextran ve sodyum diatrizoate çözeltisi pipet (1.113 g/mL, yoğunluğu bkz: Malzemeler tablo) steril 15 mL tüpler ve yavaş yavaş katman 5 mL taze izole insan periferik kan üstüne de içine.
   3. Tüpler için düşük ivme ile de RT (25 ° C) g x 400 ve fren yok 50 dk santrifüj kapasitesi.
   4. Santrifüjü sonunda, plazma ve mononükleer hücreler (üst katman) steril plastik emme pipet kullanarak kaldırın.
   5. Alt tabaka (PMNs) yeni bir steril 50 mL konik tüp içine aktarın.
   6. % 0.45 eşit bir birim eklemek NaCl PMNs (mix iyi ve yavaşça tüp döndürerek) için.
   7. Vasıl 400 x g 25 ° C'de 10 dakika santrifüj
2. Kırmızı hücre lizis
   1. 45 için pelleted hücrelere 10 mL buz gibi steril su ekle s ardından buz gibi steril %1.8 tarafından 10 mL NaCl osmolalite geri yüklemek için.
      Not: PMN yalıtım için aşağıdaki adımların tümünü buza PMN etkinleştirme ve ürün, erken MP önlemek için yapılmalıdır. Lizis adım küçük ama önemli değil PMN harekete geçirmek içinde sonuçlanır, ancak, bu işlev deneyleri için saf bir PMN nüfus yalıtmak için esastır.
   2. Hücreler için 250 x g yumuşak yavaşlama ile 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi.
   3. 3.2.1 ve 3.2.2 adımları yineleyin.
   4. PMNs kalsiyum ve magnezyum buz gibi HBSS 5 ml resuspend. Saymak toplam canlı hücreleri (hemasitometre ve 1:2 seyreltme boyama canlılık kullanın, Malzemeler tablobakınız) stimülasyon önce.
      Not: İzole PMNs stimülasyon veya diğer deneyler 2s tecrit içinde işlevsel ve hücresel değişiklikler ve hücre ölümü önlemek için kullanılmalıdır.

4. MP aktif PMN Supernatants izolasyonu

Not: Benzer bir iletişim kuralı üzerinden fare ve insan PMNs MPs yalıtım için kullanılır.

1. Pelet PMNs (300 x g, 5 dk, 4 ° C) ve resuspend 0,1 µm olarak filtre HBSS çözüm, seçim teşvik edici Ajan içeren (Örnek 1 µM fMLF için bkz: Not: 2.3.1). En iyi uyarılması için 20-30 dk 15 mL tüpler 37 ° C'de 10 milyon PMNs başına 100 µL stimülasyon çözüm kullanın.
2. Aşağıdaki stimülasyon, 600 x g 4 ° C'de 5 min için de harekete geçirmek PMNs aşağı spin ve boş hücre supernatants yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpler için transfer.
3. PMN temizlenmiş süpernatant 13.000 x g, 10 min, hücre artıkları kaldırmak ve temizlenen süpernatant yeni bir ultracentrifuge tüp içine aktarmak için 4 ° C, santrifüj kapasitesi.
4. Santrifüj 4 ° C'de 100.000 x g, 1 h için Supernatants MP depolama önce kaldırın. Gerektiğinde, mağaza MPs deneyler kullanımda kadar ultracentrifuge tüpler-80 ° C'de mühürlü parafin içinde pelleted.

5. Western Blot tarafından PMN-MPs incelenmesi

1. % 1 SDS arabellek ekleyin (50-200 µL ile 100 mM Tris pH: 7,4) için MPs (adımından 4.4), transfer yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpler için cips ve 5 min için lysed MPs kaynatın.
   Not: MPs ve lizis arabellek birim sayısı ayarlanabilir ve faiz her protein için en iyi duruma getirilmiş.
2. PMN-MPs eşit miktarda % 10 β-mercapto-etanol içeren arabellek yükleme lane başına yük.
   Not: bizim yöntemi ile uyarılan PMNs aynı numaradan izole edildi MPs yükleyin.
   1. SDS-sayfa tarafından lysates % 10 polyacrylamide jel üzerinde ayrı (50-100 V 1-1.5 h için kullanılır) ve açıklanan⁹olarak nitroselüloz membran üzerine toplam protein transfer.
3. % 0.05 ara-20 Tris arabelleğe alınmış serum %5 yağsız süt ile 1 h için membranlar engellemek ve uygun bir birincil ikincil HRP Birleşik antikorlar tarafından takip (gecede 4 ° C'de), ile kuluçkaya.
4. Bantları membran ve ışık geçirmez kaset (1 / 24 h) içinde bir röntgen filmi maruz chemoluminescence çözüm ekleyerek görselleştirin.

6. PMN-MPs Akış Sitometresi tarafından incelenmesi

1. Antikor boyama için antikorlar uygun şekilde arabellekte FACS (0.1 mm EDTA, % 0,1 sodyum azid PBS) oranında seyreltin. Resuspend pelleted PMN-MPs (1-3 x 10 elde edilen⁶ PMNs/koşul) 100 µL antikor çözümde.
   1. Annexin V için boyama eğer pelleted PMN-MPs FITC Birleşik Annexin v 5 µL içeren Annexin V arabellekte resuspend. Antikorlar ile birlikte boyama, istenen antikorlar (için bir örnek bakın Malzemeler tablo) doğrudan Annexin V ekleyin. Floresan lipid boya, N-(2-aminoethyl) maleimide ekleyin (bkz. Tablo malzemeler), 100 µL 1 µM konsantrasyon FACS tampon etiket ve MPs tanımlamak için.
2. Çözüm için en az 20 dk 4 ° C'de boyama içinde MPs kuluçkaya
3. MPs yıkama ultrasantrifüj tarafından (100.000 x g, 4 ° C'de 1 h); süpernatant atmak.
4. FACS arabellekte resuspend ve artan duyarlılık için yükseltilmiş elektronik birimi ile donatılmış bir belirlenen Akış Sitometresi örnekleri çalıştırmak ( Tablo malzemelerigörmek).

7. yara iyileşmesi de PMN işlevi çalışmaya izole PMN MPs uygulamalarda

1. Vivo İdaresi PMN-MPs kolon yaralar
   1. Fareler ketamin (100 mg/kg) ve xylazine (5 mg/kg) karışımı bir mayi enjeksiyonu ile anestezi. Anestezi pedal refleks (firma ayak tutam) onaylamak ve gerektiği gibi ayarlayın.
   2. Onun mide ve 28 cm biyopsi forceps ve yüksek çözünürlüklü bir fotoğraf makinesi ile donatılmış bir endoskop kullanma üzerine fareyi getirin (küçük hayvan kullanmak için veteriner endoskop gibi Malzemeleri tablogörmek), 3-5 yüzeysel yaralar sırt tarafındaki oluşturmak iki nokta üst üste. Yaralama tamamlanmasından sonra yeniden elde etmek kadar ısı kontrollü (37 ° C) mindere dönüş fareler için bir kafes yerleştirilir.
   3. Fareler (aynı derecede içinde adım 7.1.1) anestezi. Bir endoskop yaralama verdirdiler yaralar 24 saat (gün 1) sonrası görüntüleri elde etmek için kullanmak. Fareler gibi adım 7.1.2 kurtarmak izin.
   4. (24 saat sonrası yaralama) aynı zamanda fare PMN-MPs 2 x 10⁶ PMNs mikroenjeksiyon kolonoskopi-esaslı sistem (kullanım 29 G iğne)⁹kullanan her yara site içine HBSS + doğrudan 100 µL içinde türetilen yönetmek. Üç gün sonra (4 gün sonrası yaralama) fareler (aynı derecede içinde adım 7.1.1) anestezi ve bir endoskop yaraların iyileşme görüntüleri yeniden almak için kullanın. Fareler gibi adım 7.1.2 kurtarmak izin.
   5. Tercih edilen görüntü analiz yazılımı kullanarak (bakınız Tablo malzemeler), anahat görünür yara bölgeleri elde edilen görüntülerde, alan aynı gün 1 ve 4 sonrası yaralama yara ve yara kapatma yüzdesini hesaplamak ölçü birimi.
2. Vitro yara iyileşmesi insan epitel hücreleri
   1. Count Caco-2 BBe veya T84, insan bağırsak epitel hücreleri tarafından hemasitometre ve tohum 5 x 10⁵ hücreleri/kuyuda 24-şey kültür plakaları. Standart kuluçka odası 37 ° C ve % 5 CO₂hücrelerinde kuluçkaya. Caco-2 BBe veya T84 ulaşmak confluency 48 saat⁹. Epitel hücreleri kültür, DMEM ve DMEM-F12 (50: 50) ile ek olarak daha önce kullanmak için⁹açıklanan.
   2. Pipet ucu kullanarak monolayer mekanik kazı-kazan yaralar oluşturmak ve düşük emme daha önce^4,9açıklandığı gibi. Hemen bir zaman kullanılmak üzere bir ters faz kontrast fark girişim mikroskop (5 X veya 10 X kullanmak hedefleri) kullanarak çizilmemesi sonra yara alanlarda görüntüleri elde 0 referans noktası =.
   3. (2-4 X 10⁶ PMNs türetilmiş) MPs epitel hücre çizik-yaralı monolayers ekleyin ve bir ek 24 h (48 h, % 5 CO₂37 ° C'de sonrası yaralama) için kuluçkaya. Şu anda çizik-yaralar görüntülerini yeniden elde etmek.
   4. Tercih edilen görüntü analiz yazılımı kullanın (görmek Malzemeler tablot yara alanlarını ölçmek için) = 0 ve t = seçilen zaman noktalarda yara alanında fark belirlenerek 48 h. Calculate yara kapatma yüzdesi =.

Sonuçlar

Temsilcisi akış sitometrik analiz üzerinden insan izole edildi ve PMNs fare MPs şekil 1' de gösterilmiştir. PMN-MPs boyutu heterojen, buna karşılık insan MPs. Not için şekil 1A, B gösterildiği gibi bilinen boyutlu boncuk için değerlendirilebilir, fare ve insan milletvekilleri arasında boyutu heterojenite hiçbir önemli farklılıklar gözlenmiştir. Benzer şekilde, Akış Sitometresi ve floresan...

Tartışmalar

Yalıtım ve MPs PMN kaynaklı karakterizasyonu için protokoller bu iletişimde açıklanmıştır. Birkaç anahtar kritik noktaları yordamı başarısı için dikkate alınması gerekir. İlk olarak, PMNs taze izole ve deneyler 2s tecrit içinde kendiliğinden harekete geçirmek ve degranulation önlemek için kullanılan gerekir. Tüm işleme PMNs sırasında yalıtım ve stimülasyon noktasına kadar harekete geçirmek ve erken MP yayın¹²önlemek için buza gerçekleştirilmelidir. İkinci o...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-041-CV
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)	Atlanta Biologics	S11150
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)	GIBCO	15140
0.5 M EDTA	Fisher	BP2482
Sodium chloride	Sigma	S9888	Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit
Sterile filtered Histopaque 1077	Sigma	10771
Sterile filtered Histopaque 1119	Sigma	11191	Density 1.119 g/ml.  Solution of polysucrose and  sodium diatrizoate. Bring to room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium	Cellgro	210-40-CV
Ethyl Alcohol (200 proof)	Decon labs	2701
HBBS	Corning	21-022-CV
Trypan Blue Solution, 0.4%	Sigma	T8154 SIGMA	Diluted 1:2 for cell viability counting
Isoflurane	Abbot	50033
Anti-human CD11b-APC conjugated	Biolegend	301350	Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL)
BODIPY FL	Invitrogen	B10250	N-(2-aminoethyl) maleimide
Annexin V Binding Buffer	Biolegend	422201
Calibration Beads for Flow Cytometry	BioCytex	7803
FITC Annexin V	Biolegend	640906
Polymorphprep	Axis-Shield PoC AS		Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml
C57BL/6 mice	Jackson Labs
15 ml centrifuge tubes	Corning	430053
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
25 ml serological pipettes	Celltreat	229225B
10 ml serological pipettes	Celltreat	229210B
5 ml serological pipettes	Celltreat	229205B
Pasteur pipettes	BD Falcon	357575
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)	BD	305122
100 µm cell strainers	Celltreat	229485
Vacutainer tubes	BD	367251
Equipment
LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP)	BD	(SORP)
Swinging bucket centrifuge	ThermoFisher Scientific	75007210
Ultracentrifuge	Beckman	(L8-80 M)
Micro-centrifuge	ThermoFisher Scientific	VV-17703-15 (Fresco 17)
Swinging bucket centrifuge	ThermoFisher Scientific	75004503 (Megafuge 40R)
Biopsy forceps, 28 cm	Storz	27071zj
Software
Image J	National Institute of Health	Open source