分離と機能研究の好中球由来の微粒子のキャラクタリゼーション

要約

新しいプロトコルを特定し人間由来の微粒子を特徴付けるとおりマウス好中球。これらのプロトコルは遠心、フローサイトメトリーとイムノブロット微粒子コンテンツを分析する手法を活用し、細胞機能のさまざまなセル型から派生した微粒子の役割を研究する使用できます。

要約

多形核好中球由来マイクロパーティクル (PMN)-国会議員) が脂質二重層、サイズ直径 50-1,000 nm に至ると球状機構の解明。MPs は、新しく進化して、細胞間コミュニケーションとシグナリング機械の重要な部分です。彼らのサイズと彼らのリリースの性質のため最近まで MP 存在を見落としていた。しかし、技術の向上と分析方法健康および病気の機能今浮上しています。ここに示すプロトコルは、フローサイトメトリーとイムノブロットによって分離して PMN MPs を評価を目指しています。さらに、いくつかの実装例のとおりです。MP 分離のこれらのプロトコルは高速で低コスト、および高価なキットの使用を必要としません。また、彼らは MPs 前 MP リリースする前にコピー元のセルのラベルし同様、次の分離、フローサイトメトリーによる可視化・解析用膜固有の蛍光染料を使用してのラベルにできます。これらのメソッドただし、Pmn と MPs と高度な分析機器の必要性の純度を含むいくつかの制限があります。ハイエンドの流れの cytometer は確実に MPs を分析し、ノイズまたは自動蛍光性のための偽肯定的な読み取りを最小限に抑えるために必要です。記述されていたプロトコル分離し、MP 器官を定義する使用ことができ、そのマーカーと異なる刺激的な条件の下での組成変化の特徴します。エクソソーム対膜の粒子の内容が異なっているかどうか、組織の恒常性に異なる役割を満たしているかどうかを調査するためサイズの不均一性を利用できます。最後に、次の分離と MPs、細胞応答の機能および様々 な疾患モデル (を含む、多形核白血球の炎症性疾患、炎症性腸疾患や急性肺障害など) の特性を探索できます。

概要

最近では、「微粒子/ミクロベシクル「細胞細胞質または細胞膜由来が新興が示唆された、直径 50 1,000 nm に至るこれら構造が生物学的情報を運ぶことができる偉大な科学的な興味のなると携帯電話通信の非標準のメソッドとして機能します。免疫細胞の MPs と Pmn のホストの防衛の^1、2、炎症性応答³、および創傷治癒に重要な役割を与えられたの関心は、好中球 (Pmn) 作り出される特にそれら⁴. 興味を持って、これまで多数のレポートを示しているプロ炎症性と抗炎症機能 PMN MPs の⁵潜在的なコンテキスト-病気-種-、MPs の臓器固有の役割を示唆しています。

この通信で説明されているプロトコルは、健康と病気における MPs の機能を研究するコスト効果の高い、革新的な柔軟メソッドを提供します。彼らは多くのモデル有機体、器官、および刺激条件に適用されます。彼らは MPs のいくつかの種類の同定を可能にする、プロ炎症性と抗炎症機能に対処するため、将来的に使用できます。例として記述されている上皮創傷治癒の in vitroおよびin vivoにおける PMN MPs の関数を勉強する方法があります。マウス骨髄由来の Pmn は前述方法⁶からいくつかの変更と合わせられたの隔離のため提案するプロトコル。

さらに、この研究で説明されているプロトコルは検出と PMN MPs の 2 つの相補的な方法で見つけることができます特定のマーカーの評価、: 西部のしみし、フローサイトメトリーします。我々 は、標準プロトコル⁵を使用して MPs の免疫ブロットは簡単で信頼性の高い、しかし、流れ cytometry 計測器、および改良された騒音に信号の比率の感度の最近の進歩により、MPs のさらなる分析このメソッドを使用して見つけます。本研究では記述されていたプロトコルを組み込む最近の進歩と遠心分離速度と時間のサンプル フィルタ リングと凍結/ストレージの条件のための⁷の加算への変更を含む元の研究の記事からの提言^,8、および「バック グラウンド ノイズ」を削減、PMN MPs の検出限界を向上、MPs のさまざまなサイズの間で区別する方法。

プロトコル

すべての動物の仕事は、北西 IACUC によって承認されました。すべての実験は、調和とすべての関連する規制・制度のガイドラインの遵守に完了しました。献血者の人権のインフォームド コンセントを提示され、署名されて。さらに、本研究ではすべての被験者は、福祉の機関および連邦政府のガイドラインに従って扱われました。

注: プロトコルの手順は以下のサブセクションの下で表示されます: (i) マウス骨髄細胞の隔離;(ii) 多形核白血球の分離から骨髄;(ヒトの血液から iii) PMN の隔離(iv) MP (遠心); によって多形核白血球培養上清から分離(v); ウエスタンブロット法による MPs のキャラクタリゼーション(vi); フローサイトメトリーによる MPs のキャラクタリゼーション(viii) 孤立した国会議員の研究創傷治癒過程への応用

1. マウス骨髄細胞分離

1. 大腿骨と脛骨マウスの後脚からの解剖
   1. 吸入麻酔のため安楽死ボックス (例えば、空 1 mL ヒント] ボックス) を準備します。プラスチックの箱の蓋の内側にテープで滅菌布の上に 100% イソフルランを数滴を追加します。新しい IACUC ガイドラインに従って動物必要がありますないイソフルランとの直接接触入って来、従ってマウスとガーゼ、イソフルランを含むチップ ホルダーを配置します。
      注: イソフルラン強力な吸入麻酔薬は、ヒューム フードの中慎重に処理する必要があります。
   2. IACUC 勧告に従ってマウスを安楽死させます。それは呼吸を停止しているまで手順 1.1.1 1-5 分で説明安楽死ボックス内には、マウスを配置します。頚部転位を実行することによって動物の死を確認します。
   3. ステンレス製 12 センチ、腹部皮膚 0.17 × 0.1 mm ピンセットを持ち上げて肌上部と下肢の間の半分の方法をカットします。ここから下肢を含むマウス本体の最も遠位部の皮膚の皮をむきます。10 cm 長い、まっすぐ解剖はさみ、後ろ足から筋肉を削除、大腿骨頭をそのまま股関節を脱臼します。
   4. はさみを使用すると、大腿骨と脛骨から筋肉を細かく分析し、大腿骨と脛骨を切り離します。骨髄のかなりの量を含んでいるので、骨の両端はそのまま残ることを確認します。
   5. ペーパー タオル中骨を圧延によってすべての残り肉を削除します。無血清培地 (SFM、すなわち、ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 血清または抗生物質なし) を含むペトリ皿にきれいな骨を配置します。
   6. 70% のエタノールで、SFM の骨をすすいでください。
   7. 50 mL の円錐管に SFM の 50 mL を準備します。SFM の 10 mL を 10 mL のシリンジに読み込む、25、5/8 インチのゲージの針を取り付けます。
   8. 骨髄 (赤み) に開口部が表示されるまでは、ハサミで骨の端をトリミングします。
   9. 新しい 50 mL のチューブに骨髄細胞をフラッシュします。約 3 mL/骨 SFM の 26、5/8 インチ g 針、10 mL の注射器を使用します。フラッシュしたら、細胞凝集塊を破る (使用使い捨て 1 mL プラスチック ヒント) をピペッティングによりチューブに細胞を再懸濁します。

2. PMN マウス骨髄から分離

1. 赤のセル換散
   1. 4 ° C で 8 分間 350 × gで遠心分離によって収集された骨髄をペレットします。
   2. 0.2 %20 mL で細胞ペレットを再懸濁します赤血球画分を分離する約 20-30 秒の塩化ナトリウム。30 を超えていないこの s は PMN の換散になります。1.6 %20 mL を加えて浸透圧を復元する塩化ナトリウム。
      注: この手順は非常に少しの多形核白血球の活性化につながる可能性があります。
   3. 2 ml の PBS とステップ 2.1.1 上記と同様に遠心分離機のセルを洗浄します。上澄みを除去します。
   4. 密度勾配遠心法による分離 Pmn に進みます。
2. 密度勾配遠心法による好中球の隔離
   1. 暖かい polysucrose ナトリウム diatrizoate ソリューション、1.119 g/mL と 1.077 g/mL (材料の表を参照してください)、使用する前に部屋の温度 (RT) の密度の。
   2. Diatrizoate グラデーション 1.077 グラム/mL の濃度溶液 15 mL の円錐管に 1.119 グラム/mL の濃度溶液 3 mL 以上 3 mL をゆっくりとレイヤリングによって骨髄細胞処理直前に、新鮮な polysucrose、ナトリウムを準備します。
      注: 事前に遠くグラデーション溶液の調製は、層と貧しい好中球純度と回復の混合になります。
   3. 1 mL の氷冷 PBS で骨髄細胞ペレットを再懸濁します、polysucrose、ナトリウムの diatrizoate の上に生じる細胞懸濁液をオーバーレイ勾配 (ゆっくりと、層の混合を避けるために)。
   4. ブレーキなしの RT で 25 ° C で 850 x g で 30 分間遠心します。他の細胞は骨髄に存在から好中球の効果的な分離のため、RT で試薬を維持します。グラデーションを効率的に形成し、遠心分離のステップ後管理のできるように減速で遠心分離機を設定します。
   5. 視覚的に PBS の 1.077 グラム/mL の密度ソリューション (上層) 界面の単核細胞層を探します。PMN バンドを乱すことがなく、この層と密度ソリューションの残りの部分を削除します。
   6. 転送ピペットを使用して 15 mL チューブに PMN レイヤー全体といくつかの基になる polysucrose とナトリウム diatrizoate 1.119 g/mL の溶液を収集します。
      注: 孤立した Pmn の純度は、上側のレイヤーの完全な除去に依存します。
   7. フィルター処理 (0.1 μ m 孔サイズのフィルターで濾過) PBS や 300 x g で 4 ° C で 5 分間遠心チューブをトップします。
   8. 2.2.7 のステップのように遠心分離条件を使用して PBS の 2 ml 小球形にされた Pmn を洗います。
   9. フィルター処理された PBS の 1 mL で再懸濁します、検定によって孤立した Pmn をカウントします。
      注: この分離メソッドの結果の PMN 純度になる ~ 85-90%、フローサイトメトリーによって評価されました。主に単核リンパ球の残りの分数を汚染で構成されています。
3. MP のリリースを誘発する多形核白血球の刺激
   注: Pmn はインターフェロン γ (肝腎) やホルボール 12-ミリスチン酸-13-アセタート (PMA)、N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF) を含む、さまざまな活性化条件を使用して Mp を解放する刺激できます。重要なは、シミュレーション、前に Pmn おく氷の上すべての回で。
   1. ペレット Pmn (300 × g、5 分、4 ° C) と 0.1 μ m で再懸濁しますフィルター ・ ハンクの平衡塩類 (HBSS) ソリューション、好みの刺激剤を含みます。最適な刺激は、15 mL の管に 37 ° C で 20-30 分の 1000 万 Pmn あたり 100 μ L 刺激ソリューションを使用します。
      注: アクティベーターの次の濃度が正常に我々 の以前の仕事で使用: fMLF (0.5-1 ヒトとマウス Pmn の 2-5 μ M の μ M)、PMA (200 nM)、および肝腎 (100 ng/mL)。事前ラベル MPs のリリースが必要な場合インキュベート些細 Pmn (10 x 1 5⁶) N-(2-aminoethyl) マレイミド FITC と (材料の表を参照してください) (100 μ L HBSS、15 分、37 ° C で 1 μ M)。2.3.1-2.3.3 の手順を続行します。
   2. Pmn を削除し、細胞培養上清を新しい 1.5 mL 遠心チューブに転送 4 ° C で 5 分間 850 x g でスピンダウンします。
   3. MP 分離細胞の培養上清から、4.2 の手順に進みます。

3. ヒトの血液から PMN の隔離

1. 機関の IRB のガイドラインに従って採血の健康なボランティアを募集します。
   1. 健康ボランティアの前腕部から市販 5 mL クエン酸ナトリウム含有チューブ (材料の表を参照してください) に血液を収集します。
   2. デキストランおよびナトリウムの diatrizoate 溶液 5 mL をピペット (1.113 グラム/mL の濃度は、材料表を見なさい) 滅菌 15 mL チューブ、ゆっくりとレイヤーの上に新鮮な孤立したひと末梢血 5 mL に。
   3. 室温 (25 ° C) で低加速 g x 400 でないブレーキ 50 分間チューブを遠心します。
   4. 遠心分離の最後には、プラズマと単核細胞 (上層) 滅菌プラスチック吸引ピペットを使用してを削除します。
   5. 新しい滅菌 50 mL のコニカル チューブに下部層 (PMNs) を転送します。
   6. 0.45% の等量を追加 Pmn (ミックスも、軽くチューブを回転させることにより) 塩化ナトリウム。
   7. 25 ° C で 400 × g で 10 分間遠心
2. 赤のセル換散
   1. 45 の小球形にされたセルに 10 mL の冷たい、滅菌水を追加 s に続いて 10 mL の氷冷滅菌 1.8% の塩化ナトリウム浸透圧を復元します。
      注: PMN の隔離のためのすべての次の手順は、多形核白血球の活性化と早期の MP 放出を避けるために氷の上行わなければなりません。散のステップ自体は軽度だが、重要ではない多形核白血球の活性化の結果、しかし、それは機能の試金のための純粋な多形人口を隔離するために不可欠です。
   2. ソフト減速 4 ° C で 250 x g で 10 分の細胞を遠心します。
   3. 3.2.1、3.2.2 の手順を繰り返します。
   4. カルシウムやマグネシウムなし冷たい HBSS の 5 mL の PMNs を再懸濁します。総生きているセルをカウント (検定と生存率 2:1 希釈で染色を使用、材料の表を参照してください) 刺激する前に。
      注: 孤立した Pmn は刺激や分離の 2 時間以内の他の実験のため機能および細胞の変化と細胞死を避けるために使用する必要があります。

4 活性化された PMN の培養上清から MP 分離

注: 同様のプロトコルはマウスとヒト Pmn からの MPs の分離されます。

1. ペレット Pmn (300 × g、5 分、4 ° C) と 0.1 μ m で再懸濁しますフィルター HBSS ソリューション選択の刺激剤を含む (例 1 μ M fMLF 参照してください注: 2.3.1)。最適な刺激 15 mL チューブで 37 ° C で 20-30 分の 1000 万 Pmn あたり 100 μ L 刺激ソリューションを使用します。
2. 次の刺激は 4 ° C で 5 分間 600 x g で活性化された Pmn スピンダウンし、細胞培養上清を新しい 1.5 mL 遠心チューブに転送。
3. 13,000 × g、10 分、細胞の残骸を削除し、クリアの上清を新しい遠心管に転送 4 ° C で PMN クリア上清を遠心します。
4. 4 ° C で、100,000 × g で 1 h、遠心分離MP 保管する前に培養上清を削除します。必要に応じて、ストアは-80 ° C で遠心管を実験で使用するまで封印パラフィンで MPs をペレットしました。

5. 西部にしみが付くことによって国会議員の多形核白血球の検査

1. 1 %sds バッファーを追加 (100 mM Tris pH と 50-200 μ L: 7.4) ペレット MPs に (手順 4.4) から新しい 1.5 mL 遠心チューブの転送と 5 分間分離の MPs を沸騰します。
   注: MPs および換散バッファーのボリュームの数する必要があります調整し、興味の各蛋白質のために最適化されました。
2. 10% β-メルカプト-エタノールを含むバッファーの読み込み中レーンあたり PMN MPs の同量をロードします。
   注: 当社の方法で刺激 Pmn の同じ数から分離された MPs を読み込みます。
   1. 10% ポリアクリルアミドゲルの SDS-PAGE による lysates を分離 (1 〜 1.5 h 50 100 V を使用) と説明⁹としてニトロセルロース膜に総蛋白質を転送。
3. 0.05% Tween 20 含有トリス緩衝生理食塩水、5% 無脂肪牛乳で 1 h の膜をブロックし、HRP 標識二次抗体に続いて (一晩で 4 ° C)、適切なプライマリと孵化します。
4. 膜と耐光性カセット (1-24 h) 内の x 線フィルムを露出する電気ソリューションを追加することによってバンドを視覚化します。

6. フローサイトメトリーによる国会議員の多形核白血球の検査

1. 抗体の汚損のため FACS バッファー (0.1 ミリメートルの EDTA、0.1% アジ化ナトリウムと PBS) で適切に抗体を希釈します。PMN MPs にペレットを再懸濁します (10 x 1 3 から派生した⁶ Pmn/条件) 100 μ L 抗体溶液で。
   1. アネキシン V で染色、アネキシン V の FITC 結合の 5 μ L を含むアネキシン V バッファーの小球形にされた PMN MPs を再懸濁します。抗体染色、アネキシン V ソリューションに直接目的抗体 (使用例は材料のテーブル) を追加します。蛍光脂質色素、N-(2-aminoethyl) マレイミドを追加 (材料の表を参照)、ラベルし、MPs の識別に FACS バッファーの 100 μ L に 1 μ M の濃度で。
2. 染色液を 4 ° C で少なくとも 20 分の MPs を孵化させなさい
3. 超遠心法 (100,000 × g、4 ° c で 1 h); で Mp を洗う上清を捨てます。
4. FACS バッファーで再懸濁し、感度の向上のためのアップグレードされた電子ユニット装備指定流れの cytometer でサンプルを実行 (材料の表を参照してください)。

7. 創傷治癒における多形核白血球の機能を研究する孤立した PMN MPs 申請

1. 体内管理 PMN MPs の大腸の傷に
   1. ケタミン (100 mg/kg) とキシラジン (5 mg/kg) の混合物の腹腔内投与によるマウスを麻酔します。ペダル反射 (しっかりつま先ピンチ) によって麻酔を確認し、必要に応じて調整します。
   2. その胃と 28 cm 生検鉗子と高解像度カメラを搭載した内視鏡を使用して、マウスを置きます (小動物用動物用内視鏡など材料の表を参照)、3-5 の背側に沿って表面的な傷を生成、コロン。負傷の完了時にケージに戻りマウスは回復するまで温度制御 (37 ° C) マットに配置されます。
   3. (ステップ 7.1.1) のようにマウスを麻酔します。内視鏡を使用して、傷を与えた 24 時間 (1 日目) が負傷した後の画像を取得します。マウス ステップ 7.1.2 のように回復をしましょう。
   4. (24 h 後負傷) 同時に、大腸内視鏡検査を用いたマイクロインジェクション システム (29 G 針使用)⁹を使用して各傷のサイトに 100 μ L の HBSS + 直接で 2 x 10⁶ Pmn から派生したマウス PMN MPs を管理します。3 日後 (4 日後負傷) (ステップ 7.1.1) のようにマウスを麻酔し、傷を癒しの画像を再取得する内視鏡を使用します。マウス ステップ 7.1.2 のように回復をしましょう。
   5. 最寄りの画像解析ソフトウェアを使用して取得した画像、同じエリア 1 人が負傷した後、4 日で傷し、傷の閉鎖のパーセンテージを計算するメジャーで (材料の表を参照)、アウトライン表示傷領域。
2. 人間の上皮細胞の in vitro創傷治癒
   1. カウント カコ 2 BBe または T84、検定と種子 5 x 10 の⁵細胞/ウェル 24 ウェル培養皿でひと腸管上皮細胞。37 ° C と 5% の CO₂の標準培養チャンバーに細胞を孵化させなさい。カコ 2 BBe や T84 48 h⁹内の confluency に到達します。上皮細胞の培養、以前サプリメントに DMEM と DMEM F12 (50: 50) を利用して⁹を説明します。
   2. ピペット チップを使用して単分子膜の機械的スクラッチ傷を生成し、低吸引前述した^4,9。直後の時間として使用される倒立位相微分干渉顕微鏡 (5 X、10 X の使用目的) を使用してスクラッチ傷領域の画像を取得 = 0 基準点。
   3. 上皮細胞の傷が負傷する MPs (2-4 10⁶ Pmn X から派生) を追加し、(48 時間後負傷、5% CO₂と 37 ° C で) 追加 24 時間インキュベートします。この時にスクラッチ傷の画像を再取得します。
   4. 最寄りの画像解析ソフトを使用して (材料の表を参照) t で傷の面積を測定する = 0 および t 48 h. 創閉鎖の割合を計算するを選択した時点で傷の領域の違いを決定することにより =。

結果

代表的なヒトから分離された、マウスの Pmn MPs のフローサイトメトリーによる解析は、図 1に表示されます。PMN MPs のサイズの不均一性を評価して、図 1A, Bに示すように、サイズのビーズを比較することにより MPs。 メモ人間のする、サイズの不均一性に有意差は認められなかったマウスと人間の MPs の間.同様?...

ディスカッション

分離・同定多形核白血球由来の MPs のためのプロトコルは、この通信で説明されます。キーのいくつかの重要なポイントは、プロシージャの成功のためのアカウントに撮影する必要があります。まず、Pmn を新鮮な分離し、自発的な活性化と脱顆粒を防ぐために分離の 2 時間以内の実験で使用する必要があります。Pmn 分離時、刺激のポイントまでのすべての処理は、活性化と早期 MP リリース

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-041-CV
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)	Atlanta Biologics	S11150
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)	GIBCO	15140
0.5 M EDTA	Fisher	BP2482
Sodium chloride	Sigma	S9888	Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit
Sterile filtered Histopaque 1077	Sigma	10771
Sterile filtered Histopaque 1119	Sigma	11191	Density 1.119 g/ml.  Solution of polysucrose and  sodium diatrizoate. Bring to room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium	Cellgro	210-40-CV
Ethyl Alcohol (200 proof)	Decon labs	2701
HBBS	Corning	21-022-CV
Trypan Blue Solution, 0.4%	Sigma	T8154 SIGMA	Diluted 1:2 for cell viability counting
Isoflurane	Abbot	50033
Anti-human CD11b-APC conjugated	Biolegend	301350	Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL)
BODIPY FL	Invitrogen	B10250	N-(2-aminoethyl) maleimide
Annexin V Binding Buffer	Biolegend	422201
Calibration Beads for Flow Cytometry	BioCytex	7803
FITC Annexin V	Biolegend	640906
Polymorphprep	Axis-Shield PoC AS		Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml
C57BL/6 mice	Jackson Labs
15 ml centrifuge tubes	Corning	430053
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
25 ml serological pipettes	Celltreat	229225B
10 ml serological pipettes	Celltreat	229210B
5 ml serological pipettes	Celltreat	229205B
Pasteur pipettes	BD Falcon	357575
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)	BD	305122
100 µm cell strainers	Celltreat	229485
Vacutainer tubes	BD	367251
Equipment
LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP)	BD	(SORP)
Swinging bucket centrifuge	ThermoFisher Scientific	75007210
Ultracentrifuge	Beckman	(L8-80 M)
Micro-centrifuge	ThermoFisher Scientific	VV-17703-15 (Fresco 17)
Swinging bucket centrifuge	ThermoFisher Scientific	75004503 (Megafuge 40R)
Biopsy forceps, 28 cm	Storz	27071zj
Software
Image J	National Institute of Health	Open source