בידוד ואפיון של נויטרופילים, נגזר Microparticles ללימודי פונקציונלי

Summary

פרוטוקולים חדשים מתוארים כאן כדי לבודד ולאפיין microparticles נגזר מן האדם ואת העכבר נויטרופילים. פרוטוקולים אלה לנצל ultracentrifugation, מיכשור וטכניקות immunoblotting לנתח תוכן microparticle, הם יכולים לשמש כדי ללמוד את התפקיד של microparticles נגזר סוגי תאים שונים של תפקוד התאים.

Abstract

אורך חייהם נויטרופילים, נגזר microparticles (נויטרופיל)-MPs) הם ליפידית, כדורית שלפוחיות זעירות בגודל הנע בין 50 – 1,000 nm בקוטר. MPs הם מתפתחים עתה, חלק חשוב של מכונות איתות ותקשורת לתא. בגלל גודלם מהות שחרורם, עד לאחרונה MP קיומו היה להתעלם. עם זאת, עם טכנולוגיה משופרת, שיטות אנליטיות תפקידם על בריאות ומחלה עכשיו מתגלה. הפרוטוקולים המובאת כאן מכוונים בידוד ואפיון נויטרופיל-MPs cytometry זרימה ו immunoblotting. יתר על כן, מקבלים מספר דוגמאות ליישום. פרוטוקולים אלה לבידוד MP הן מהר, בעלות נמוכה, אינם דורשים שימוש ערכות יקר. יתר על כן, הן מאפשרות עבור תיוג של MPs בעקבות בידוד, כמו גם תיוג מראש של תאי המקור לפני שחרור MP, באמצעות הפלורסנט ממברנה ספציפי עבור הדמיה וניתוח על ידי cytometry זרימה. שיטות אלה, אולם, יש מספר מגבלות כולל טוהר PMNs ו MPs והצורך מכשור אנליטי מתוחכם. Cytometer זרימה באיכות גבוהה יש צורך לנתח MPs ולמזער קריאות חיובי כוזב עקב רעש או אוטומטי-זריחה באופן אמין. הפרוטוקולים שתואר יכול לשמש כדי לבודד ולהגדיר להן MP, לאפיין שלהם סמנים, וריאציה בהרכב בתנאים שונים מגרה. גודל הטרוגניות אפשר לנצל את זה כדי לחקור אם התוכן של קרום חלקיקים נגד exosomes הוא שונה, בין אם הם למלא תפקידים שונים בתוך רקמת הומאוסטזיס לבסוף, ניתן לסייר הבאים בידוד ואפיון של חברי פרלמנט, תפקידם בתגובות הסלולר מודלים מחלות שונות (לרבות, נויטרופיל-הקשורים הפרעות דלקתיות, כמו במחלות מעי דלקתיות או פציעה ריאות חריפה).

Introduction

לאחרונה, "microparticles/שלפוחיות זעירות" שמקורם ציטוזול תא או קרום פלזמה הפכו עניין מדעי רב, כפי המתעוררים הנתונים מראים כי מבנים אלה, הנע בין 50-1, 000 nm בקוטר יכול לשאת מידע ביולוגי, לשמש כשיטה קאנונית של התקשורת הסלולארית. החיסון התא-derived MPs ואלה במיוחד המיוצר על ידי נויטרופילים אורך חייהם (PMNs) עניין רב נתן את תפקידה החשוב של PMNs מארח ההגנה^1,2, תגובות דלקתיות³ו ריפוי פצע ⁴. מסקרן, עד כה, דיווחים רבים הראו פונקציות הן הפרו דלקתיים ואנטי דלקתיות של נויטרופיל-MPs⁵, רומז על הקשר הפוטנציאלי - מחלות-, מינים-, תפקידים ייחודיים של MPs.

פרוטוקולים שתואר בתקשורת זו מספקות שיטה חסכונית, חדשניים וישימה ללמוד את הפונקציה של MPs על בריאות ומחלה. הם חלים רבים דגם אורגניזמים, איברים והתנאים גירוי. הם מאפשרים הזיהוי של מספר סוגים של חברי פרלמנט, יכול לשמש בעתיד לטפל הפונקציות שלהם הפרו דלקתיים ואנטי דלקתיות. לדוגמה, תיאר כך ניתן לחקור את הפונקציה של נויטרופיל-MPs הפצע אפיתל הריפוי במבחנה ו vivo בתוך. פרוטוקול הציג עבור בידוד של העכבר הנגזרות מח עצם PMNs הותאמה עם כמה שיפורים שיטה שתואר לעיל⁶.

יתר על כן, פרוטוקולים המתוארים במחקר זה מאפשרים זיהוי ואפיון של סמנים ספציפיים ניתן למצוא באתר נויטרופיל-MPs על ידי שתי שיטות משלימות: ווסטרן כתם, לזרום cytometry. אנו מוצאים כי immunoblotting של MPs באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים⁵ הוא קל ואמין, עם זאת, ההתקדמות רגישות של מכשירים cytometry זרימה, שיפור יחס הרעש-כדי-אות כעת לאפשר לצורך ניתוח נוסף של MPs בשיטה זו. הפרוטוקולים המתוארים במחקר זה לשלב את ההתקדמות והמלצות של מאמרי מחקר מקורי, כולל שינויים מהירות צנטריפוגה וזמן, התוספת של מדגם הקפאה/אחסון וסינון תנאים^{7 , 8}וכיצד להפחית את "רעשי הרקע", לשפר את מגבלת זיהוי של נויטרופיל-MPs, ולהבחין בין גדלים שונים של MPs.

Protocol

כל העבודה בעלי חיים אושרה על ידי IACUC מערבי. כל הניסויים הושלמו ב בהתאם ותאימות עם כל הרלוונטיים ההנחיות הרגולטוריות ומוסדיים. עובד תרומת דם, היה הסכמה מדעת שהוצגו, חתמו; בנוסף, בכל המקצועות האדם במחקר זה טופלו בהתאם להנחיות הפדרלי המוסדיות לרווחת האדם.

הערה: השלבים פרוטוקול מפורטים תחת מקטעי המשנה שלהלן: (i) העכבר מח עצם תא בידוד; (ii) נויטרופיל בידוד מ מאתר מח העצם; (iii) נויטרופיל בידוד של דם אנושי; (iv) MP בידוד של נויטרופיל Supernatants (על-ידי Ultracentrifugation); (v) אפיון MPs מאת המערבי סופג; (vi) אפיון MPs מאת Cytometry זרימה; (viii) יישום של MPs מבודד על המחקר פצע ריפוי

1. עכבר מח עצם תא בידוד

1. דיסקציה של עצם הירך, שוקה של הרגליים האחוריות העכבר
   1. להכין תיבה המתת חסד (למשל, קופסת עצה ריק 1 מ"ל) שאיפה של הרדמה. הוסף מספר טיפות של 100% איזופלוריין על גבי בד סטרילי מודבק הפנימי של מכסה קופסת פלסטיק. לפי הנחיות חדשות IACUC, בעלי חיים כדאי לא באים במגע ישיר עם איזופלוריין, ולכן מקום בעל קצה העכבר בין פד המכיל את איזופלוריין.
      הערה: איזופלוריין הרדמה inhalational רב עוצמה, שצריך לנהוג בזהירות בתוך ברדס fume.
   2. המתת חסד עכברים לפי המלצות IACUC. הנח את העכבר בתוך הקופסה המתת חסד שמתואר בשלב 1.1.1 1 – 5 דקות עד שהיא גוועה נשימה. ודא המוות של בעל החיים על-ידי ביצוע תאמת צוואר הרחם.
   3. הרם בעור בטן באמצעות פלדת אל-חלד, 12 ס מ מעוקל, פינצטה 0.17 מ"מ X 0.1 מ"מ, לחתוך את העור במחצית הדרך בין הגפיים העליונים והתחתונים. לקלף את העור מכאן בסעיף דיסטלי ביותר בגוף העכבר כולל הגפיים התחתונות. עם 10 ס מ, ישר לנתח מספריים, להסיר את שרירי הרגליים האחוריות, לנקוע את מפרק הירך עוזב את ראש עצם הירך ללא פגע.
   4. להשתמש במספריים כדי לנתח את השרירים לבין עצם הירך עצם השוקה, להפריד בין עצם הירך לבין עצם השוקה. ודא שקצות העצמות נשארים בעינם כמו שהם מכילים כמויות משמעותיות של מח העצם.
   5. הסר כל בשר שנותרו על ידי גלגול העצמות בתוך מגבת נייר. מניחים את העצמות נקי בצלחת פטרי המכילות בינוני ללא סרום (SFM, קרי, הבינונית ששינה הנשר של Dulbecco (DMEM) ללא סרום או אנטיביוטיקה).
   6. יש לשטוף את העצמות אתנול 70% וב -SFM.
   7. להכין 50 מ של SFM צינור חרוטי 50 מ. לטעון 10 מ"ל של SFM לתוך מזרק 10 מ"ל ולחבר אותו מחט בקוטר 25 ו- 5/8 אינץ '.
   8. לקצץ את הסוף של העצמות עם מספריים עד פתח במח העצם (צבע אדמדם) יהיה גלוי.
   9. לרוקן את התאים במח העצם לתוך צינור 50 מ. השתמש מזרק 10 מ"ל עם מחט מד 26, 5/8 אינץ ' עם 3 מ ל/עצם של SFM. בסיום השטיפה, resuspend את התאים בצינור על-ידי pipetting (שימוש חד פעמי 1 מ"ל פלסטיק טיפים) לשבור אגרגטים התא.

2. נויטרופיל בידוד ממח העצם מאתר

1. פירוק תא אדום
   1. גלולה מח העצם שנאספו על ידי צריך שתוציאו ב x 350 גרם במשך 8 דקות ב 4 º C.
   2. Resuspend בגדר תא ב- 20 מ של 0.2% NaCl עבור 20-30 s כדי lyse השבר כדוריות דם אדומות. לא יעלה על 30 s כמו זה יגרום פירוק נויטרופיל. הוסף 20 מ של 1.6% NaCl לשחזור osmolality.
      הערה: שלב זה עלול להוביל ההפעלה נויטרופיל מעט מאוד.
   3. לשטוף את התאים עם 2 מ"ל של PBS, צנטריפוגה כמו שלב 2.1.1 לעיל. הסר את תגובת שיקוע.
   4. המשך PMNs בידוד על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות.
2. בידוד של נויטרופילים על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות
   1. חמה polysucrose, סודיום diatrizoate פתרונות, עם צפיפות של 1.119 g/mL ו- 1.077 g/mL (ראה טבלה של חומרים), לטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש.
   2. להכין polysucrose נתרן diatrizoate מעברי צבע טרי, מייד לפני יישום תא מח עצם על ידי לאט שכבות 3 מ"ל של הפתרון צפיפות 1.077 g/mL מעל 3 מ"ל של הפתרון צפיפות 1.119 g/mL 15 מ"ל צינורות חרוט.
      הערה: הכנה של הפתרון הדרגתיות רחוק מדי מראש תגרום ערבוב של שכבות, טוהר נויטרופילים המסכן ושחזור.
   3. Resuspend בגדר תאי מח העצם ב 1 מ"ל של PBS קר כקרח, כיסוי התליה תא הנוצרת על גבי diatrizoate polysucrose ו נתרן הדרגתי (לאט, כדי למנוע ערבוב השכבות).
   4. צנטריפוגה למשך 30 דקות ב g x 850 25 ° c-RT, ללא בלם. לשמור את ריאגנטים RT להפרדה יעילה של נויטרופילים של תאים אחרים הנמצאים במח העצם. לקבוע לצנטריפוגה ההאטה איטי כדי לאפשר את מעבר הצבע הנוצרת באופן יעיל ותחזוקה לאחר השלב צנטריפוגה.
   5. חזותית לאתר שכבה תא תאי-הממשק של PBS והפתרון צפיפות 1.077 g/mL (השכבה העליונה). להסיר רובד זה ואת שאר הפתרון צפיפות מבלי להפריע הלהקה נויטרופיל.
   6. לאסוף על שכבה שלמה של נויטרופיל כמה polysucrose הבסיסית ו נתרן diatrizoate 1.119 g/mL פתרון לתוך צינורות 15 מ"ל באמצעות פיפטה של העברה.
      הערה: טוהר PMNs מבודדים תלויות הסרה מלאה של השכבה העליונה.
   7. למעלה הצינורות עם PBS (מסונן דרך מסנן גודל הנקבוביות 0.1 מיקרומטר) מסוננות ולא צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות, ב 4 º C.
   8. לשטוף את PMNs pelleted עם 2 מ של PBS באמצעות צנטריפוגה תנאים כמו שלב 2.2.7.
   9. Resuspend ב 1 מ"ל של PBS מסוננים ולספור את PMNs מבודדים על ידי hemocytometer.
      הערה: עבור שיטה זו בידוד, טוהר נויטרופיל וכתוצאה מכך מסתכם ~ 85-90%, כפי הוערכה על ידי cytometry זרימה. שאר מזהמות שברים מורכב בעיקר תאי לימפוציטים.
3. נויטרופיל גירוי לזירוז שחרור MP
   הערה: יכול להיות מגורה PMNs לשחרר MPs באמצעות הפעלת תנאים שונים, לרבות N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-פעילים-13-אצטט (PMA) או אינטרפרון גמא (IFNγ). חשוב לציין, לפני סימולציה, PMNs יש לשמור על קרח בכל עת.
   1. PMNs צנפה (300 x גרם, 5 דקות, 4 ° C) ו resuspend ב 0.1 מיקרומטר מסונן מאוזנת מלח פתרון של האנק פתרון (HBSS), המכיל את הסוכן מגרה של בחירה. גירוי אופטימלית, להשתמש פתרון גירוי µL 100 לכל 10 מיליון PMNs למשך 20-30 דקות ב 37 ° C 15 מ"ל צינורות.
      הערה: ריכוזי activators הבאים שימשו בהצלחה בעבודה הקודמת: fMLF (0.5-1 מיקרומטר עבור האדם ו- 2-5 מיקרומטר עבור העכבר PMNs), ובחום (200 ננומטר), ו- IFNγ (100 ng/mL). אם המהדורה של MPs מראש שכותרתו היא הרצויה, דגירה unstimulated PMNs (1-5 x 10⁶) עם N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC (ראה טבלה של חומרים) (1 מיקרומטר ב 100 µL HBSS, 15 דקות, 37 ° C). להמשיך עם שלבים 2.3.1-2.3.3.
   2. ספין למטה ב- g x 850 עבור 5 דקות ב 4 ° C, להסיר PMNs ולהעביר supernatants נטולת תא ל צינורות microcentrifuge 1.5 mL החדש.
   3. MP בידוד מ ללא תא supernatants, המשך לשלב 4.2.

3. נויטרופיל בידוד של דם אנושי

1. לגייס מתנדבים בריאים לחילוץ דם לפי הנחיות IRB מוסדיים.
   1. לאסוף דם מן האמה של מתנדבים בריאים לתוך הצינורות המכילים סודיום ציטרט זמינים מסחרית מ ל (ראה טבלה של חומרים).
   2. פיפטה 5 מ של פתרון לתוספי diatrizoate נתרן (צפיפות של 1.113 g/mL, ראה טבלה של חומרים) לתוך צינורות סטרילי 15 מ"ל, לאט שכבה 5 מ"ל של דם היקפיים אנושי טרי מבודד על גבי זה.
   3. Centrifuge צינורות למשך 50 דקות ב 400 x ג'י ב- RT (25 ° C) עם האצת נמוכה, בלי בלמים.
   4. בסוף צנטריפוגה, להסיר את הפלזמה תאים תאי (השכבה העליונה) באמצעות פיפטה היניקה פלסטיק סטרילית.
   5. להעביר את השכבה התחתונה (PMNs) לתוך צינור חרוטי סטרילי 50 מ.
   6. הוסף אמצעי שווה של 0.45% NaCl כדי PMNs (מערבבים היטב ובעדינות על-ידי סיבוב הצינור).
   7. צנטריפוגה 10 דקות ב 400 g x ב- 25 ° C.
2. פירוק תא אדום
   1. להוסיף 10 מ של מים קפואים, סטרילי לתאים מגורען עבור 45 s ואחריו 10 מ"ל של קרח סטרילי 1.8% NaCl לשחזור osmolality.
      הערה: כל הפעולות הבאות לבידוד נויטרופיל צריכה להתבצע על קרח כדי למנוע הפעלת נויטרופיל ושחרור MP מוקדמת. הצעד פירוק עצמה גורמת הפעלה נויטרופיל קטנה, אך לא משמעותיים, עם זאת, חיוני עבור בידוד אוכלוסיה נויטרופיל טהור עבור מבחני פונקציונלי.
   2. Centrifuge התאים 10 דקות ב 250 g x ב 4 ° C עם ההאטה רך.
   3. חזור על שלבים 3.2.1 ו- 3.2.2.
   4. Resuspend PMNs ב 5 מ של HBSS קר כקרח ללא סידן או מגנזיום. לספור תאים חיים הכולל (להשתמש א hemocytometer הכדאיות מכתים-1:2 דילול, ראה טבלה של חומרים) לפני גירוי.
      הערה: PMNs מבודדים אמור לשמש גירוי או ניסויים אחרים בתוך שעתיים של בידוד כדי למנוע שינויים פונקציונליים, סלולר ומוות של תאים.

4. MP בידוד של נויטרופיל שהופעל Supernatants

הערה: פרוטוקול דומה משמש את ניתוקה של MPs של PMNs מאתר ואנושי.

1. PMNs צנפה (300 x גרם, 5 דקות, 4 ° C) ו resuspend ב 0.1 מיקרומטר מסונן פתרון HBSS, המכיל את הסוכן מגרה של בחירה (ראו דוגמה 1 מיקרומטר fMLF, הערה: 2.3.1). לגירוי אופטימלית להשתמש פתרון גירוי µL 100 לכל 10 מיליון PMNs למשך 20-30 דקות ב 37 ° C 15 מ"ל צינורות.
2. גירוי הבאים, ספין למטה PMNs מופעל ב- g x 600 עבור 5 דקות ב 4 ° C ולהעביר ללא תא supernatants צינורות microcentrifuge 1.5-mL החדש.
3. Centrifuge את תגובת שיקוע נויטרופיל-והפנים-13,000 x גרם, 10 דקות, 4 ° C כדי להסיר שאריות תאים ולהעביר את תגובת שיקוע שנוקה לתוך צינור ultracentrifuge.
4. צנטריפוגה עבור 1 h ב g x 100,000, ב 4 º C. הסר את supernatants לפני האחסון MP. לפי הצורך, חנות מגורען MPs של פרפין אטום צינורות ultracentrifuge ב-80 מעלות צלזיוס עד שימוש בניסויים.

5. בחינת נויטרופיל-MPs מאת סופג המערבי

1. להוסיף 1% מרחביות מאגר (µL 50-200 עם pH טריס 100 מ מ: 7.4) חברי פרלמנט גלולה (מתוך שלב 4.4), העברה אל צינורות microcentrifuge החדש של 1.5 mL. והרתיחו שהמשטרה הצבאית lysed במשך 5 דקות.
   הערה: המספר של MPs ונפח מאגר פירוק חייב להיות מותאם והם ממוטבים עבור כל חלבון עניין.
2. לטעון כמויות שוות של נויטרופיל-MPs בנתיב בטעינת מאגר המכיל 10% β-mercapto-אתנול.
   הערה: עם השיטה שלנו אנו לטעון MPs שהיו שבודד אותו מספר של PMNs מגורה.
   1. להפריד את lysates על ידי עמודים מרחביות על 10% לזיהוי ג'ל (השתמש V 50-100 עבור h 1-1.5) ולהעביר סך החלבונים על גבי ממברנות ניטרוצלולוזה כפי שמתואר⁹.
3. לחסום ממברנות h 1 עם 5% חלב דל שומן בתוך תמיסת מלח באגירה Tween-20 טריס 0.05%, דגירה זה עם ראשי המתאים (בן לילה ב 4 ° C), ואחריו נוגדנים מצומדת HRP משנית.
4. דמיינו הלהקות על-ידי הוספת פתרון chemoluminescence קרום וחשיפה סרט צילום רנטגן בתוך קלטת אור-הוכחה (h 1-24).

6. בחינת נויטרופיל-MPs מאת Cytometry זרימה

1. עבור נוגדן מכתים, לדלל נוגדנים כראוי במאגר FACS (PBS עם 0.1 מ"מ EDTA, אזיד הנתרן 0.1%). Resuspend מגורען נויטרופיל-MPs (נגזר 1-3 x 10⁶ PMNs/תנאי) בתמיסה נוגדן 100 µL.
   1. אם צביעת עבור Annexin V, resuspend מגורען נויטרופיל-MPs במאגר Annexin V המכיל 5 µL של FITC מצומדת Annexin V. אם שותף מכתים עם נוגדנים, להוסיף את הנוגדן הרצוי (עבור ראה דוגמה טבלה של חומרים) ישירות אל הפתרון Annexin V. להוסיף צבע השומנים פלורסנט, N-(2-aminoethyl) maleimide (ראה טבלה של חומרים), ב- 1 ריכוז מיקרומטר 100 µL FACS מאגר תווית ולזהות MPs.
2. דגירה למשטרה. הצבאית ב מכתים פתרון לפחות 20 דקות ב 4 º C.
3. לשטוף את MPs מאת ultracentrifugation (1 h ב g x 100,000, ב 4 ° C); למחוק את תגובת שיקוע.
4. Resuspend במאגר FACS ולהפעיל את הדגימות cytometer זרימה המיועדת מצויד יחידה אלקטרונית המשודרגת של רגישות מוגברת (ראה טבלה של חומרים).

7. יישומים עבור מבודד נויטרופיל-MPs ללמוד לתפקד נויטרופיל ריפוי הפצע

1. In vivo הניהול של נויטרופיל-MPs לפצעים חוקן
   1. עזים ומתנגד עכברים על ידי זריקה בקרום הבטן של תערובת של קטאמין (100 מ ג/ק ג) חריגות השירותים הווטרינריים (5 מ"ג/ק"ג). לאשר הרדמה על ידי פדלים רפלקס (הבוהן המשרד צביטה) ולהתאים במידת הצורך.
   2. הנח את העכבר על הבטן שלו, באמצעות מלקחיים 28 ס מ ביופסיה באנדוסקופ מצויד with a מצלמה ברזולוציה גבוהה (כגון אנדוסקופ וטרינרי לשימוש בבעלי חיים קטנים, ראה טבלה של חומרים), ליצור 3-5 פצעים שטחיים לאורך הצד הגבי של המעי הגס. עם סיום ופצעו, עכברים החזרה לכלוב להציב על מזרון מבוקרי טמפרטורה (37 מעלות) עד התאושש.
   3. עזים ומתנגד עכברים (כמו שלב 7.1.1). אשתמש באנדוסקופ כדי לרכוש תמונות של הפצעים נגרמו ופצעו 24 שעות (יום 1) פוסט. תן עכברים לשחזר כמו שלב 7.1.2.
   4. באותו זמן (24 שעות שלאחר ופצעו), לנהל מאתר נויטרופיל-MPs נגזר PMNs⁶ 2 x 10 ב 100 µL של HBSS + ישירות לתוך כל אתר הפצע באמצעות המערכת (השתמש מחט ג'י 29) המבוסס על קולונוסקופיה microinjection⁹. שלושה ימים מאוחר יותר (יום 4 פוסט ופצעו) עזים ומתנגד עכברים (כמו שלב 7.1.1) ולהשתמש באנדוסקופ לחלץ. את תמונות של ריפוי פצעים. תן עכברים לשחזר כמו שלב 7.1.2.
   5. באמצעות תוכנת ניתוח התמונות המועדף (ראה טבלה של חומרים), אזורים לרמות פצע נראה לעין בתמונות הנרכש, למדוד האזור של אותו פצע ימים 1 ו- 4 פוסט ופצעו, ולחשב את האחוז של סגירת הפצע.
2. האדם אפיתל תאי במבחנה ריפוי הפצע
   1. ספירת קאקו-2 BBe או T84, האדם בתאי אפיתל המעי מאת hemocytometer, זרע 5 x 10⁵ תאים/טוב ב- 24-ובכן תרבות צלחות. דגירה התאים בחדר דגירה סטנדרטי-CO 37 ° C ו-5%₂. קאקו-2 BBe או T84 להגיע confluency בתוך 48 שעות⁹. התרבות תאים אפיתל, להשתמש DMEM ו- DMEM-F12 (50: 50) עם תוספי כאמור תיאר⁹.
   2. צור פצעי גירוד מכאני ב טפט באמצעות פיפטה עצה יניקה נמוכה כפי שתואר לעיל^4,9. לרכוש תמונות של הפצע אזורים מיד לאחר גירוד באמצעות מיקרוסקופ התערבות דיפרנציאלית שלב הפוכה-ניגודיות (מטרות השימוש 5 X או 10 X), כדי לשמש זמן = נקודת התייחסות 0.
   3. הוסף MPs (נגזר 2-4 X 10⁶ PMNs) monolayers תא אפיתל שרוט-פצועים ולאחר תקופת דגירה של h 24 נוספים (48 שעות שלאחר ופצעו, ב 37 ° C עם 5% CO₂). בשלב זה מחדש לרכוש תמונות של השריטה-הפצעים.
   4. השתמש בתוכנת ניתוח התמונות המועדף (ראה טבלה של חומרים) כדי למדוד את הפצע אזורים ב- t = 0 ו- t = 48 ח' חשב אחוז סגירת הפצע על ידי לקבוע את ההבדל באזור הפצע בנקודות זמן נבחר.

תוצאות

ניתוח cytometric תזרים נציג של MPs היו מבודדים מן האדם, עכבר PMNs מוצגים באיור1. גודל הטרוגניות של נויטרופיל-MPs יכול להיות מוערך על ידי השוואה כדי החרוזים בגודל ידוע, כפי שמוצג באיור 1A, B עבור האדם MPs. הערה, אין הבדל משמעותי בין גודל הטרוגניות...

Discussion

פרוטוקולים עבור בידוד ואפיון של נויטרופיל-derived MPs מתוארים תקשורת זו. מספר נקודות קריטיות מפתח חייב להילקח בחשבון להצלחת ההליך. ראשית, PMNs בטח טרי? כן, להשתמש בניסויים בתוך שעתיים של בידוד כדי למנוע הפעלת ספונטנית ו degranulation. כל הטיפול PMNs במהלך בידוד, עד לנקודה של גירוי חייב להתבצע על קרח כדי למ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-041-CV
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)	Atlanta Biologics	S11150
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)	GIBCO	15140
0.5 M EDTA	Fisher	BP2482
Sodium chloride	Sigma	S9888	Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit
Sterile filtered Histopaque 1077	Sigma	10771
Sterile filtered Histopaque 1119	Sigma	11191	Density 1.119 g/ml.  Solution of polysucrose and  sodium diatrizoate. Bring to room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium	Cellgro	210-40-CV
Ethyl Alcohol (200 proof)	Decon labs	2701
HBBS	Corning	21-022-CV
Trypan Blue Solution, 0.4%	Sigma	T8154 SIGMA	Diluted 1:2 for cell viability counting
Isoflurane	Abbot	50033
Anti-human CD11b-APC conjugated	Biolegend	301350	Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL)
BODIPY FL	Invitrogen	B10250	N-(2-aminoethyl) maleimide
Annexin V Binding Buffer	Biolegend	422201
Calibration Beads for Flow Cytometry	BioCytex	7803
FITC Annexin V	Biolegend	640906
Polymorphprep	Axis-Shield PoC AS		Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml
C57BL/6 mice	Jackson Labs
15 ml centrifuge tubes	Corning	430053
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
25 ml serological pipettes	Celltreat	229225B
10 ml serological pipettes	Celltreat	229210B
5 ml serological pipettes	Celltreat	229205B
Pasteur pipettes	BD Falcon	357575
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)	BD	305122
100 µm cell strainers	Celltreat	229485
Vacutainer tubes	BD	367251
Equipment
LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP)	BD	(SORP)
Swinging bucket centrifuge	ThermoFisher Scientific	75007210
Ultracentrifuge	Beckman	(L8-80 M)
Micro-centrifuge	ThermoFisher Scientific	VV-17703-15 (Fresco 17)
Swinging bucket centrifuge	ThermoFisher Scientific	75004503 (Megafuge 40R)
Biopsy forceps, 28 cm	Storz	27071zj
Software
Image J	National Institute of Health	Open source