Isolement et caractérisation de microparticules neutrophile dérivés pour des études fonctionnelles

Résumé

Nouveaux protocoles sont décrits ici pour isoler et caractériser les microparticules dérivées de l’homme et les neutrophiles de souris. Ces protocoles utilisent l’ultracentrifugation, cytométrie en flux et immunoblotting techniques pour analyser le contenu au moyen de microparticules, et ils peuvent être utilisés pour étudier le rôle de microparticules dérivés de divers types de cellules à fonction cellulaire.

Résumé

Polynucléaires neutrophiles dérivés microparticules (PMN)-MPs) sont bicouche lipidique, microvésicules sphérique avec des tailles allant de 50 à 1 000 nm de diamètre. MPs sont un nouvellement en évolution, une partie importante de la cellule-cellule communication et signalisation machines. En raison de leur taille et la nature de leur libération, existence de MP a été négligé jusqu'à récemment. Cependant, avec une technologie améliorée et des méthodes d’analyse leur rôle dans la santé et la maladie se dessine maintenant. Les protocoles présentés ici visent à isoler et à caractériser les PMN-MPs par immunotransfert et cytométrie en flux. En outre, plusieurs exemples d’application sont donnés. Ces protocoles d’isolement de MP sont rapides, peu coûteux et ne nécessitent pas l’utilisation de kits coûteux. En outre, ils permettent l’étiquetage des députés après isolement, mais aussi de marquage préalable des cellules source avant la sortie de MP, à l’aide d’un colorant fluorescent membranaires spécifiques pour la visualisation et l’analyse par cytométrie en flux. Ces méthodes, cependant, ont plusieurs limitations, y compris la pureté de l’APF et de députés et de la nécessité d’instruments d’analyse sophistiqués. Un cytomètre en flux haut de gamme il faut analyser MPs et de minimiser les fausses lectures positives en raison de bruit ou auto-fluorescence de façon fiable. Les protocoles décrits peuvent servir à isoler et à définir la biogenèse des MP et caractérisent leurs marqueurs et la variation dans la composition sous différentes conditions stimulantes. Hétérogénéité de taille peut être exploitée pour étudier la question de savoir si le contenu de particules de membrane versus exosomes est différent, et si elles jouent des rôles différents dans l’homéostasie tissulaire. Enfin, isolement et caractérisation des députés, leur rôle dans les réponses cellulaires et divers modèles de maladies (y compris, PMN associée à des troubles inflammatoires, telles que les maladies inflammatoires de l’intestin ou la lésion pulmonaire aiguë) suivantes peuvent être explorées.

Introduction

Récemment, « microparticules/microvésicules » provenant du cytosol cellulaire ou de la membrane plasmique sont devenus de grand intérêt scientifique, comme de nouvelles données suggèrent que ces structures, allant de 50-1 000 nm de diamètre, peuvent transporter des données biologiques et servir de méthode de communication cellulaire non canonique. Immunitaire cellules dérivées MPs et particulièrement celles produites par les polynucléaires neutrophiles (PMN) sont d’un grand intérêt, étant donné l’importance de l’APF dans hôte défense^1,2, réactions inflammatoires³et cicatrisation ⁴. Curieusement, jusqu’ici, de nombreux rapports ont montré des fonctions pro-inflammatoires et anti-inflammatoires du PMN-MPs⁵, suggérant un éventuel contexte - maladie-, espèce- et organe-spécifiques au rôle des députés.

Les protocoles décrits dans la présente communication fournissent une méthode rentable, innovante et adaptable pour étudier la fonction des députés dans la santé et la maladie. Elles s’appliquent à de nombreux organismes modèles, les organes et les conditions de stimulation. Elles permettent d’identifier plusieurs types de MPs et peuvent être utilisés à l’avenir pour traiter leurs fonctions pro-inflammatoires et anti-inflammatoires. Par exemple, décrit ici est de savoir comment étudier la fonction des PMN-MPs dans la plaie épithéliales guérison in vitro et in vivo. Le protocole présenté pour l’isolement de souris APF de moelle osseuse a été adapté avec quelques modifications d’une méthode décrite précédemment⁶.

En outre, les protocoles décrits dans cette étude permettent pour la détection et la caractérisation de marqueurs spécifiques que l'on retrouve sur PMN-MPs par deux méthodes complémentaires : Western blot et cytométrie en flux. Nous trouvons qu’immunoblotting de députés à l’aide de protocoles standard⁵ est simple et fiable, cependant, les progrès récents dans la sensibilité des instruments de cytométrie en flux et amélioration du rapport signal-bruit autorisent désormais une analyse plus approfondie des députés en utilisant cette méthode. Les protocoles décrits dans la présente étude incorporent les progrès récents et recommandations émanant des articles de recherche originaux, y compris les modifications apportées à la vitesse de centrifugation et de temps, l’ajout de l’échantillon des conditions de filtrage et surgélation/conservation^{7 , 8}et comment réduire le « bruit de fond », améliorer la limite de détection de PMN-MPs et distinguer les différentes tailles de MPs.

Protocole

Tous les travaux d’animaux a été approuvé par l’IACUC Nord-Ouest. Toutes les expériences ont été achevées en conformité et le respect de toutes les directives réglementaires et institutionnels. Pour faire un don de sang des sujets humains, un consentement éclairé a été présenté et signé ; en outre, tous les sujets humains dans cette étude ont été traités conformément aux directives institutionnelles et fédérales pour le bien-être de l’humanité.

Remarque : Les étapes du protocole sont répertoriés dans les sous-sections suivantes : (i) l’isolement de cellules de la moelle osseuse de souris ; (ii) isolement de PMN de la moelle osseuse Murine ; (iii) PMN isolement du sang humain ; (iv) MP indépendamment des surnageants PMN (par Ultracentrifugation) ; (v) la caractérisation des députés par Western Blotting ; (vi) la caractérisation des députés par cytométrie de flux ; (viii) l’application des députés isolées d’étude la cicatrisation

1. isolement de cellules de moelle osseuse souris

1. Dissection du fémur et du tibia depuis les pattes de la souris
   1. Préparer une boîte de l’euthanasie (par exemple, une boîte de pointe vide 1 mL) pour l’inhalation de l’anesthésie. Ajouter quelques gouttes d’isoflurane 100 % sur un chiffon stérile collé à l’intérieur d’un couvercle de boîte en plastique. Selon les nouvelles directives IACUC, animaux ne devrait pas entrer en contact direct avec l’isoflurane, donc placer un embout porte entre la souris et la gaze contenant l’isoflurane.
      Remarque : L’Isoflurane est un puissant anesthésique par inhalation et doit être manipulé avec une extrême prudence à l’intérieur d’une hotte aspirante.
   2. Euthanasier souris conformément à la recommandation IACUC. Placez une souris à l’intérieur de la boîte de l’euthanasie, décrite à l’étape 1.1.1 pour 1 à 5 min, jusqu'à ce qu’elle a cessé de respirer. S’assurer de la mort de l’animal en effectuant une dislocation cervicale.
   3. Soulever la peau abdominale à l’aide d’acier inoxydable, 12 cm, courbé, pincettes 0,17 X 0,1 mm et couper la peau à mi-chemin entre les extrémités supérieures et inférieures. Peler la peau d’ici à la section plus distale du corps de souris, y compris les membres inférieurs. Avec 10 cm de long, tout droit ciseaux de dissection, retirez les muscles postérieurs et disloquer l’articulation de la hanche laissant la tête de fémur intact.
   4. Utiliser des ciseaux à disséquer les muscles du fémur et du tibia et séparer le fémur du tibia. Assurez-vous que les extrémités des os restent intactes, car ils contiennent des quantités importantes de la moelle osseuse.
   5. Supprimer toute chair restant en faisant rouler l’os à l’intérieur d’une serviette en papier. Placer les os propres dans une boîte de Pétri contenant un milieu sans sérum (GDF, c'est-à-diremoyen de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM) sans sérum ou antibiotiques).
   6. Rincer les os dans l’éthanol à 70 %, puis dans la GFD.
   7. Préparer 50 mL de l’AFD dans un tube conique de 50 mL. Charger les 10 mL de la GDF dans une seringue de 10 mL et l’attacher à une aiguille de calibre 25 et 5/8 po.
   8. Coupez l’extrémité des os avec des ciseaux jusqu'à ce qu’une ouverture vers la moelle osseuse (couleur rouge) est visible.
   9. Rincer les cellules de la moelle osseuse dans un nouveau tube de 50 mL. Utiliser une seringue de 10 mL avec une aiguille de calibre 26 et 5/8 po avec environ 3 mL/OS de la GFD. Lorsque vous avez terminé les bouffées de chaleur, remettre en suspension les cellules dans le tube de pipetage (usage jetable 1 mL des pointes en plastique) pour briser les agrégats cellulaires.

2. PMN isolement de murins de la moelle osseuse

1. Lyse des globules rouges
   1. Granulés de la moelle osseuse recueillie par centrifugation à 350 x g pendant 8 min à 4 ° C.
   2. Resuspendre le culot dans 20 mL de 0,2 % NaCl pour environ 20-30 s à lyser la fraction des érythrocytes. Ne dépassez pas 30 s car cela se traduira par la lyse PMN. Ajouter 20 mL de 1,6 % NaCl pour restaurer l’osmolalité.
      Remarque : Cette étape peut conduire à l’activation des PMN très peu.
   3. Laver les cellules avec 2 mL de PBS et centrifuger comme au point 2.1.1 ci-dessus. Retirez le surnageant.
   4. Procéder à l’isolement APF par centrifugation en gradient de densité.
2. Isolement des neutrophiles par centrifugation en gradient de densité
   1. Chaude polysucrose sodium diatrizoate solutions et, avec des densités de 1,119 g/mL et 1,077 g/mL (voir Table des matières), à température ambiante (RT) avant utilisation.
   2. Préparer polysucrose et sodium diatrizoate dégradés frais, immédiatement avant la demande de cellules de moelle osseuse en superposant lentement 3 mL de la solution de densité de 1,077 g/mL plus de 3 mL de la solution de densité 1,119 g/mL dans les tubes coniques 15 mL.
      Remarque : Préparation de la solution dégradée trop longtemps à l’avance donne au mélange des couches et des pauvre pureté neutrophile et récupération.
   3. Resuspendre le culot de cellules de moelle osseuse dans 1 mL de PBS glacée et la suspension de cellules qui en résultent sur le dessus de la diatrizoate polysucrose et de sodium de superposition dégradé (lentement, pour éviter le mélange des couches).
   4. Centrifuger pendant 30 min à 850 g à 25 ° C à la droite, sans frein. Conserver les réactifs à RT pour la séparation efficace des neutrophiles des autres cellules présentes dans la moelle osseuse. Définissez la centrifugeuse à décélération lente pour permettre le gradient d’être efficacement formé et maintenu après l’étape de centrifugation.
   5. Localiser visuellement une couche de cellules mononucléées à l’interface de PBS et 1,077 g/mL de solution de densité (couche supérieure). Enlever cette couche et le reste de la solution de densité sans déranger la bande PMN.
   6. Recueillir une couche entière de PMN et certains polysucrose sous-jacent et sodium diatrizoate 1,119 g/mL, solution dans des tubes de 15 mL à l’aide d’une pipette de transfert.
      Remarque : La pureté de l’APF isolé dépendra un enlèvement complet de la couche supérieure.
   7. Garnir les tubes filtrée PBS (filtré par un filtre de taille de pore de 0,1 µm) et centrifuger à 300 x g pendant 5 min, à 4 ° C.
   8. Laver le PMN granulés avec 2 mL de PBS à l’aide des conditions de centrifugation comme au point 2.2.7.
   9. Remettre en suspension dans 1 mL de PBS filtrée et compter l’APF isolé par hémocytomètre.
      Remarque : Pour cette méthode d’isolement, la pureté PMN qui en résulte s’élève à ~ 85-90 %, a été évaluée par cytométrie en flux. Les autres fractions de contaminer se composent principalement des lymphocytes mononucléaires.
3. Stimulation de PMN pour induire la libération MP
   NOTE : PN peut être stimulée pour libérer les députés à l’aide de diverses conditions d’activation, telles que N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA) ou interféron gamma (IFNγ). Ce qui est important, avant la simulation, APF convient sur la glace en permanence.
   1. Pellet APF (300 x g, 5 min, 4 ° C) et remettre à 0,1 µm filtrée Balanced Salt solution de solution (HBSS) de Hank, contenant l’agent stimulant de choix. Pour une stimulation optimale, utilisez 100 µL de solution de stimulation par PN 10 millions pendant 20-30 min à 37 ° C dans des tubes de 15 mL.
      Remarque : Les concentrations suivantes d’activateurs ont été utilisées avec succès dans nos travaux précédents : fMLF (0,5 à 1 µM pour homme et 2 à 5 µM pour les souris APF), PMA (200 nM) et IFNγ (100 ng/mL). Si vous souhaitez la libération des députés préalablement étiquetées, incuber APF non stimulées (1-5 x 10⁶) avec 2′ maléimide-FITC (voir Table des matières) (1 µM dans 100 µL HBSS, 15 min, 37 ° C). Procéder à des mesures 2.3.1-2.3.3.
   2. Tournez en bas à 850 x g pendant 5 min à 4 ° C, pour enlever les PMN et transfert de surnageants acellulaires dans de nouveaux tubes de microcentrifuge de 1,5 mL.
   3. Pour l’isolation de MP de surnageants acellulaires, passez à l’étape 4.2.

3. PMN isolement du sang humain

1. Recruter des volontaires sains pour l’extraction de sang selon les directives de la CISR institutionnels.
   1. Prélever le sang de l’avant-bras d’un volontaire sain dans des tubes contenant du citrate de sodium de commercialement disponible 5 mL (voir Table des matières).
   2. Pipette 5 mL de solution de diatrizoate de sodium et de dextran (densité de 1,113 g/mL, voir Table des matières) dans des tubes de stérile de 15 mL et, lentement, couche 5 mL de fraîchement isolé sang périphérique humain au-dessus de celui-ci.
   3. Centrifuger les tubes pendant 50 min à 400 x g à ta (25 ° C) avec une accélération faible et sans frein.
   4. À la fin de la centrifugation, retirer le plasma et les cellules mononucléées (couche supérieure) à l’aide d’une pipette d’aspiration en plastique stérile.
   5. Transférer la couche inférieure (PMN) dans un nouveau tube conique stérile de 50 mL.
   6. Ajouter un volume égal de 0,45 % NaCl à APF (mix bien et doucement en tournant le tube).
   7. Centrifugation pendant 10 min à 400 g à 25 ° C.
2. Lyse des globules rouges
   1. Ajouter 10 mL d’eau glacée et stérile aux cellules granulés pour 45 s puis 10 mL de glacee stérile 1,8 % NaCl pour restaurer l’osmolalité.
      Remarque : Toutes les étapes suivantes pour l’isolement de PMN doivent être effectuées sur la glace pour éviter l’activation PMN et libération prématurée de MP. L’étape de lyse elle-même entraîne l’activation de PMN mineure mais non significative, cependant, il est essentiel d’isoler une population PMN pure pour les tests fonctionnels.
   2. Centrifuger les cellules pendant 10 min à 250 x g à 4 ° C, avec une décélération douce.
   3. Répétez les étapes 3.2.1 et 3.2.2.
   4. Resuspendre PMNs dans 5 mL de HBSS glacee sans calcium ou de magnésium. Compter les cellules vivantes totales (utiliser un hémocytomètre et la viabilité à la dilution 1 / 2, voir la Table des matières) avant la stimulation.
      Remarque : APF isolé devrait servir de stimulation ou d’autres expériences après 2 h d’isolement afin d’éviter des changements fonctionnels et cellulaires et la mort cellulaire.

4. MP isolement de surnageants PMN activés

Remarque : Un protocole similaire est utilisé pour l’isolement de parlementaires de l’APF murins et humains.

1. Pellet APF (300 x g, 5 min, 4 ° C) et remettre à 0,1 µm filtré la solution HBSS, contenant l’agent stimulant de choix (pour exemple 1 µM fMLF, voir Note : 2.3.1). Pour une stimulation optimale utilisez 100 µL de solution de stimulation par PN 10 millions pendant 20-30 min à 37 ° C dans des tubes de 15 mL.
2. Après la stimulation, tournez en bas activé APF à 600 x g pendant 5 min à 4 ° C et transfert de surnageants acellulaires dans de nouveaux tubes de microcentrifuge de 1,5 mL.
3. Centrifuger le surnageant PMN affranchis à 13 000 x g, 10 min, 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires et transférer le surnageant déboisée dans un nouveau tube ultracentrifugeuse.
4. Centrifuger pendant 1 h à 100 000 x g, à 4 ° C. Supprimer les surnageants avant stockage MP. Au besoin, magasin granulées MPs en paraffine scellé tubes ultracentrifugeuse à-80 ° C jusqu'à l’utilisation dans des expériences.

5. examen des PMN-MPs Western Blot

1. Ajouter 1 % SDS tampon (50-200 µL avec 100 mM de Tris pH : 7,4) aux députés pellet (de l’étape 4.4), transfert dans de nouveaux tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et faire bouillir les députés lysées pendant 5 min.
   Remarque : Le nombre des députés et le volume de tampon de lyse doit être ajusté et optimisé pour chaque protéine d’intérêt.
2. Charger une quantité égale de PMN-MPs par couloir en chargement tampon contenant du β-mercapto-éthanol à 10 %.
   Remarque : Avec notre méthode, nous chargeons les députés qui ont été isolées chez le même nombre de PN stimulée.
   1. Séparer les lysats par SDS-PAGE sur gel de polyacrylamide 10 % (utiliser 50-100 V pour 1 à 1,5 h) et le transfert des protéines totales sur des membranes de nitrocellulose comme décrit⁹.
3. Bloquer les membranes pendant 1 h avec lait écrémé 5 % à 0,05 % Tween-20 tampon Tris salin et incuber il avec un primaire approprié (une nuit à 4 ° C), suivie par l’anticorps conjugué HRP secondaires.
4. Visualiser les bandes en ajoutant chemoluminescence solution à la membrane et l’exposition à une radiographie à l’intérieur d’une cassette opaque (1-24h).

6. examen des PMN-MPs par cytométrie en flux

1. Pour la coloration d’anticorps, diluer anticorps convenablement dans le tampon de FACS (PBS avec EDTA, 0,1 % d’azide de sodium à 0,1 mM). Remettre granulées PMN-MPs (dérivé de 1-3 x 10⁶ PN/condition) dans 100 µL de solution d’anticorps.
   1. Si la coloration pour l’annexine V, resuspendre granulées PMN-MPs dans un tampon d’annexine V contenant 5 µL de conjugué FITC annexine V. Si la coloration conjointement avec des anticorps, ajoutez l’anticorps désirés (pour un exemple, voir Table des matières) directement à la solution de l’annexine V. Ajouter le colorant fluorescent lipide, 2′ maléimide (voir Table des matières), à la concentration de 1 µM dans 100 µL de tampon de FACS d’étiqueter et d’identifier les MPs.
2. Incuber les députés de la coloration de la solution pendant au moins 20 min à 4 ° C.
3. Laver les députés par ultracentrifugation (1 h à 100 000 x g, à 4 ° C) ; jeter le surnageant.
4. Remettre en suspension dans un tampon FACS et exécuter les exemples sur un cytomètre désigné équipé d’une unité électronique améliorée pour une sensibilité accrue (voir Table des matières).

7. les demandes d’isolé PMN-MPs à étudier la fonction PMN dans la cicatrisation des plaies

1. In vivo administration PMN-MPs aux plaies du côlon
   1. Anesthésier souris par injection intrapéritonéale d’un mélange de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (5 mg/kg). Confirmer l’anesthésie par pédale réflexe (pincement de l’orteil ferme) et ajuster au besoin.
   2. Placez la souris sur son ventre et à l’aide de pinces à biopsie de 28 cm et un endoscope équipé d’une caméra à haute résolution (par exemple un endoscope vétérinaire pour petits animaux utilisés, voir la Table des matières), générer des plaies superficielles de 3-5 le long de la face dorsale de la deux points. Au terme de blessant, retour de souris à une cage placée sur un tapis de contrôle de la température (37 ° C) jusqu'à guérison.
   3. Anesthésier la souris (comme au point 7.1.1). Utiliser un endoscope pour acquérir des images de blessures infligées après blessant 24 h (jour 1). Laisse les souris à récupérer comme au point 7.1.2.
   4. En même temps (24h après blessure), administrer murines PMN-MPs dérivés de 2 x 10⁶ PMNs dans 100 µL de HBSS + directement dans chaque site de la plaie à l’aide d’une microinjection axée sur la coloscopie système (utilisez une aiguille de 29 G)⁹. Trois jours plus tard (jour 4 après blessure) offrir une souris (comme au point 7.1.1) et utilise un endoscope pour réacquérir les images de la guérison des plaies. Laisse les souris à récupérer comme au point 7.1.2.
   5. À l’aide de logiciels d’analyse image préférée régions en mode plan visible plaie (voir Table des matières), dans les images acquises, mesure de la zone de la même blessure aux jours 1 et 4 post-blessant et calculer le pourcentage de fermeture de la plaie.
2. Les cellules épithéliales humaines in vitro la cicatrisation des plaies
   1. BBe Caco-2 comte ou T84, les cellules épithéliales intestinales humaines par hémocytomètre et semences 5 x 10⁵ cellules/puits dans les plaques 24 puits culture. Incuber les cellules dans une chambre standard d’incubation à 37 ° C et 5 % de CO₂. Caco-2 BBe ou T84 atteignent confluence dans 48 h⁹. Pour la culture de cellules épithéliales, utilisez DMEM et DMEM-F12 (50/50) avec des suppléments comme précédemment décrit⁹.
   2. Générer des plaies de grattage mécaniques dans la monocouche à l’aide d’un embout de la pipette et succion faible comme décrit précédemment,^4,9. Acquérir des images des zones de la plaie immédiatement après grattage à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversée interférentiel différentiel (objectifs d’utilisation 5 X ou 10 X), pour être utilisé comme un temps = point de référence 0.
   3. MPs (dérivés du 2-4 X 10⁶ PMNs) s’ajoute les monocouches de cellules épithéliales rayé-blessé et incuber pendant 24 h supplémentaires (48 h après blessure, à 37 ° C, avec 5 % de CO₂). En ce moment ré-acquisition d’images de zéro-plaies.
   4. Utilisez le logiciel d’analyse image préférée (voir Table des matières) pour mesurer des plaies à t = 0 et t = 48 h. calculer le pourcentage de fermeture de la plaie en déterminant la différence dans la région de la plaie aux points de temps choisi.

Résultats

Cytométrie représentant des députés qui ont été isolés des humains et de souris APF sont indiquées à la Figure 1. L’hétérogénéité de taille de PMN-MPs peut être n’évaluée par comparaison à des perles de tailles connues comme illustré à la Figure 1A, B pour humain MPs. Note, aucune différence significative dans l’hétérogénéité de taille ont été observés entre la souris et les hum...

Discussion

Protocoles d’isolement et caractérisation de dérivés de PMN MPs sont décrites dans la présente communication. Plusieurs points clés de la critique doit être tenus compte pour la réussite de la procédure. Tout d’abord, PMN doit être isolé frais et utilisé dans des expériences après 2 h d’isolement pour éviter la dégranulation et une activation spontanée. Toute manipulation des APF lors de l’isolation et jusqu’au moment de la stimulation doit être effectuée sur la glace pour prévenir l’activ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-041-CV
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)	Atlanta Biologics	S11150
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)	GIBCO	15140
0.5 M EDTA	Fisher	BP2482
Sodium chloride	Sigma	S9888	Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit
Sterile filtered Histopaque 1077	Sigma	10771
Sterile filtered Histopaque 1119	Sigma	11191	Density 1.119 g/ml.  Solution of polysucrose and  sodium diatrizoate. Bring to room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium	Cellgro	210-40-CV
Ethyl Alcohol (200 proof)	Decon labs	2701
HBBS	Corning	21-022-CV
Trypan Blue Solution, 0.4%	Sigma	T8154 SIGMA	Diluted 1:2 for cell viability counting
Isoflurane	Abbot	50033
Anti-human CD11b-APC conjugated	Biolegend	301350	Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL)
BODIPY FL	Invitrogen	B10250	N-(2-aminoethyl) maleimide
Annexin V Binding Buffer	Biolegend	422201
Calibration Beads for Flow Cytometry	BioCytex	7803
FITC Annexin V	Biolegend	640906
Polymorphprep	Axis-Shield PoC AS		Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml
C57BL/6 mice	Jackson Labs
15 ml centrifuge tubes	Corning	430053
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
25 ml serological pipettes	Celltreat	229225B
10 ml serological pipettes	Celltreat	229210B
5 ml serological pipettes	Celltreat	229205B
Pasteur pipettes	BD Falcon	357575
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)	BD	305122
100 µm cell strainers	Celltreat	229485
Vacutainer tubes	BD	367251
Equipment
LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP)	BD	(SORP)
Swinging bucket centrifuge	ThermoFisher Scientific	75007210
Ultracentrifuge	Beckman	(L8-80 M)
Micro-centrifuge	ThermoFisher Scientific	VV-17703-15 (Fresco 17)
Swinging bucket centrifuge	ThermoFisher Scientific	75004503 (Megafuge 40R)
Biopsy forceps, 28 cm	Storz	27071zj
Software
Image J	National Institute of Health	Open source